雅致放射毛霉ZGB1及其在微生物合成ATP中的应用

摘要

本发明提供了一株能够合成ATP的新菌株——雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1及其应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.4313，保藏日期：2010年11月8日。本发明有益效果主要体现在：利用该菌株可以腺嘌呤为前体合成ATP，具有原料价格较低、来源丰富、菌体培养基原料简单、菌体容易分离等优点，且转化效率高：在含有3g/L以上腺嘌呤的反应液中能够产生10g/L以上的ATP。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株能够合成ATP的新菌株--雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1，及其在微生物合成ATP中的应用。

(二)背景技术

ATP即腺苷三磷酸，作为一种生化药物，已被用于肌肉萎缩、心肌梗塞、肝炎等和各种急救病症的治疗或辅助治疗。

目前国内外主要采用微生物转化法生产ATP，具体有采用腺苷和腺嘌呤为前体原料的两种主要生产方法。已经公开报道的采用腺嘌呤为前体原料的微生物转化合成ATP的方法主要有：日本协和发酵公司采用产氨杆菌(Cornebacterium ammoniagenes)转化合成ATP(Biosci.Boitechnol.Biochem.，65(3)，644～650，2001)；国内中山大学采用啤酒酵母转化合成ATP(中山大学学报自然科学版，3，15～26，1975)；詹谷宇等采用生香毛霉(Mucor armaticus)等7株毛霉菌转化合成ATP(西北大学学报自然科学版，02，118～129，1980)等，至今还没有以腺嘌呤为前体原料采用雅致放射毛霉菌种转化合成ATP的文献或专利报道。

腺嘌呤目前已经采用化学合成法大量生产，因此采用腺嘌呤为前体原料的生产方法，具有原料价格较低、来源丰富、合成ATP的理论转化率较高等优点，以毛霉转化合成ATP还具有菌体培养基原料简单，菌体容易分离等优点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株筛选到的能够合成ATP的新菌株--雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1，及其在微生物合成ATP中的应用。

本发明采用的技术方案是：

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.4313，保藏日期：2010年11月8日。

本申请发明人通过菌种培养摇瓶转化，然后用纸电泳法测定转化液中ATP含量的方法，筛选具有合成ATP能力的微生物时，筛选到了该菌种。在根据平板菌落特征、菌丝形态、产孢结构及孢子形态等对其鉴定的基础上，结合18S rDNA序列分析对比(测序公司：生工生物工程(上海)有限公司)，确定该菌为雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)。至今未见有以腺嘌呤为前体原料采用雅致放射毛霉菌种转化合成ATP的文献或专利报道。

本发明菌株的18S rDNA部分序列(SEQ ID No.1)如下：

TAGGATTCCTCGTTGAGAGCAATAATTACAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGTTTACCCAGACCTTCCGGCCAAGGTTATAAACTCGCTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTAAAACTTCCTTCGGCTTGAAGCCGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAGATAGATAAATCTATTCACCAACTAAAAAGTTGGCCTGCCTATTTAGCAGAATAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACGAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCTAGAAAGAGCTTTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGTCCCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTACTTTCGCTAAGATGCTGAGCCAGTCATAATAAACAGGCCCAATCTCTAGTCGGCATAGTTTGTGGTTAAGACTACGACGGTATCTAATCGTCTTCGATCCCTTAACTTTAGACCTTGATCAATGAAAACGTCCTGGGTCAAATGCTTTCGCAGTAGTTTGTCTTCGGTCAATCCAAGAATTTCACCTCTAGCGACCAAATACAAATGCCCCCAACCGTTTCTATTCATCATTACTCAAGTTCCTGAACCAACGAAATAGGGACTAGAGTCATATTTCATTATTCCATGCTAACACATTCAAGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCTGATTTGCTCATGGTAATCATTTGGCTAGAGACTATAGGCGACCGAAGCCACCCATAGCATAACCAAATACAAAAGCCTCGGCAGAAGCGAGCTTGATCAATGAAGACCAGGCCACCTCGCCTAAAGGCTAAAGTTTGACTACGGACGTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTGCAAGACCTTAAAGGCCCTGCATTGTTATTTATTGTCACTACCTCACCATGTCGGTATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGTAGGCATTGTAAGCCTCTATCTTACAATCTCAACCATGATAGGGCAGAAAATCGAGTGGACCGTCGCCAGCACAAGGCCATGCGATCCGCTTAATTATTATGAATCACCAAGGGAAACTGGTTTTACCCAGCGTTGGCTTTATCTAATAAGTGCACCCCTTCCGAAGTCAGGGCTTTTTTGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAAGAATATGTCACGTAGATCATAACTGATTAATGAGCCATCGCA。

ZGB1菌株形态特征及培养方法：

1.形态特征

菌落形态(参见图1～图4)与一般毛霉近似，棉絮状，气生菌丝高度超过1cm，初期为纯白色，后逐渐转为灰黄色，有匍匐菌丝和不发达的假根，孢囊梗直立，直径10.5～26.3μm。主枝顶端有一较大的孢子囊，其下常有3～8个轮生分枝，每一分支顶端都生有孢子囊。孢子囊呈球形或洋梨形，表面绒毛状，成熟后呈黑褐色，大小不一，直径30～70μm。囊壁易消解，有囊领，囊轴圆形、卵圆形或梨形，表面光滑，大小不均，直径(25.0～60.0)×(20.5～55.0)μm，大者可达67.3～66.1μm。孢囊孢子呈短卵形和球形、略透明、表面光滑，大小不均，大小为(10.5～21.0)×(7.9～24.0)μm，大者可达28.9×28.9μm。孢囊孢子萌发时膨大，呈典型的单极萌发。能形成厚垣孢子。

该菌最适生长温度28℃，37℃生长受抑制，40℃几乎不生长。

2.采用的培养基

固体斜面培养基1：马铃薯、葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

固体斜面培养基2：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6.0～6.5。

液体种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，pH 6.0～6.5。

发酵培养基：葡萄糖30～50g/L，酵母膏1～6g/L，玉米浆5～20g/L，MgSO₄·7H₂O  0.5～2g/L，FeSO₄·7H₂O  0.05～0.5g/L，NH₄Cl 1～5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1～5g/L，溶剂为水，pH 6.0～6.5。

3.培养条件

经28℃、3～4d培养的斜面菌种制成孢子悬液，以10％(V/V)的接种量接入液体种子培养基中，置于28℃，160r/min旋转式摇床中培养12h。以10％(V/V)的接种量将液体种子液接入发酵培养基中，置于28℃，160r/min旋转式摇床中培养12h，发酵结束。

本发明还涉及所述的雅致放射毛霉ZGB1在微生物合成ATP中的应用。

具体的，所述应用为：以腺嘌呤为底物，以雅致放射毛霉ZGB1发酵获得的菌体为酶源，于25～35℃下进行转化反应6～24小时，反应结束后转化液中ATP产物含量可以达到10g/L以上。按常规离交、浓缩、结晶等分离纯化方法处理即可得到所述产物ATP。

优选的，所述应用方法如下：

(1)雅致放射毛霉ZGB1接种至发酵培养基，28～30℃培养12～18小时，发酵液分离收集菌体，清洗、滤干后40～80℃恒温干燥2～4小时，得到雅致放射毛霉ZGB1菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖30～50g/L，酵母膏1～6g/L，玉米浆5～20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05～0.5g/L，NH₄Cl 1～5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1～5g/L，pH 6.0～6.5；发酵结束后的发酵液经过滤收集的菌体先经通透化处理(即恒温干燥箱40～80℃干燥处理2～4h)。由于毛霉菌过滤收集菌体非常方便，使用该通透化处理方法具有操作简便、转化活性高的特点，由于不需要在转化反应液中添加二甲苯等处理方法，还具有环保的优点；

(2)取步骤(1)雅致放射毛霉ZGB1菌体与底物配制转化反应液，于30～35℃下进行转化反应6～24小时，反应结束后转化液经后处理得到所述ATP；所述转化反应液初始组成如下：葡萄糖60～90g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 30～90g/L，MgCl₂·6H₂O3～6g/L，腺嘌呤2～6g/L，毛霉菌体50～100g/L。反应6h后，每隔2h用纸电泳法跟踪检测转化情况，适时终止反应。反应液中的ATP可以达到10g/L以上，已有毛霉菌转化文献报道最高ATP产率在8g/L左右。

转化反应产物分析及计算方法：

取样5～20μL，点样在20mm宽的普通滤纸上，以pH 2.5的柠檬酸-柠檬酸钠溶液为缓冲液，电压400V，电泳时间为30～60min。电泳结束后，用电吹风吹干滤纸，在紫外分析仪下描出与标准ATP斑点相同位置的产物斑点，将斑点剪成2mm左右的细条，用5ml 0.01mol/L的HCl溶液在28℃，160r/min旋转式摇床中浸提4h，测定浸提液在260nm处吸光度(OD₂₆₀)，按摩尔吸光系数计算ATP产率。

ATP产率计算公式：

ATP产率＝OD₂₆₀·Mr_ATP·C/E_ATP

式中：Mr_ATP为ATP分子量，C为稀释倍数，E_ATP为ATP摩尔吸光系数。

转化率，等于摩尔转化率，数值等于实际ATP产率与理论ATP产率之比。

本发明的有益效果主要体现在：筛选获得一株能够合成ATP的新菌株--雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGB1，利用该菌株可以腺嘌呤为前体合成ATP，具有原料价格较低、来源丰富、菌体培养基原料简单、菌体容易分离等优点，且转化效率高：在含有3g/L以上腺嘌呤的反应液中能够产生10g/L以上的ATP。

(四)附图说明

图1为本发明菌株营养菌丝电镜照片(10×4倍)

图2本发明菌株气生菌丝电镜照片(10×4倍)

图3本发明菌株呈总状分枝的孢囊梗电镜照片(10×10倍)

图4本发明菌株囊壁开始消融的孢子囊电镜照片(10×40倍)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

雅致放射毛霉ZGB1(CGMCC No.4313)接种至PDA斜面培养基，28℃培养3～4d，以生理盐水洗涤制成孢子悬液(约10⁶～10⁷cfu/mL)；

孢子悬液以10％(V/V)的接种量接入液体种子培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，pH 6.0～6.5)中，置于28℃，160r/min旋转式摇床中培养12h，得到液体种子液；

液体种子液以10％(V/V)的接种量接入发酵培养基(葡萄糖40g/L，酵母膏3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，NH₄Cl 3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，溶剂为水，pH 6.0～6.5)中，置于28℃，160r/min旋转式摇床中培养12h，发酵结束。

发酵液经抽滤收集菌体，并用无菌水冲洗滤干，滤干菌体再经过恒温干燥箱65℃干燥3h的细胞通透化处理，得毛霉菌体备用。

转化反应液组成：葡萄糖90g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 90g/L，MgCl₂·6H₂O 4g/L，腺嘌呤3g/L，毛霉菌体80g/L。

上述配制的转化反应液于33℃、160r/min旋转式摇床中进行转化反应，10h时以ATP·2Na计的产量为11.14g/L，摩尔转化率可达91.07％。

实施例2：

雅致放射毛霉ZGB1(CGMCC No.4313)固体斜面培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6.0～6.5)，28℃培养3～4d，以生理盐水洗涤制成孢子悬液(约10⁶～10⁷cfu/mL)；

孢子悬液以10％(V/V)的接种量接入液体种子培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，pH 6.0～6.5)中，置于28℃，160r/min旋转式摇床中培养12h，得到液体种子液；

液体种子液以10％(V/V)的接种量接入发酵培养基(葡萄糖40g/L，酵母膏3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，NH₄Cl 3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，溶剂为水，pH 6.0～6.5)中，置于28℃，160r/min旋转式摇床中培养12h，发酵结束。

发酵液经抽滤收集菌体，并用无菌水冲洗滤干，滤干菌体再经过恒温干燥箱60℃干燥3h的细胞通透化处理，得毛霉菌体备用。

转化反应液：葡萄糖90g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 90g/L，MgCl₂·6H₂O 4g/L，腺嘌呤4g/L，毛霉菌体80g/L。

上述转化反应液于33℃、160r/min旋转式摇床中进行转化反应，反应20h时ATP·2Na产量为13.64g/L，ATP·2Na的摩尔转化率83.63％。

                        SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江工业大学

 

<120>  雅致放射毛霉ZGB1及其在微生物合成ATP中的应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  1522

<212>  DNA

<213>  Actinomucor elegans

 

<400>  1

taggattcct cgttgagagc aataattaca atgctctatc cccagcacga tgaagtttca     60

 

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aactgattaa tgagccatcg ca                                            1522