一种镰形扇头蜱的抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列和重组表达与应用

摘要

本发明提供了镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列及其在大肠杆菌中的重组表达方法。通过构建镰形扇头蜱雌蜱吸血前后的唾液腺消减文库和测序分析，从镰形扇头蜱克隆到一个抗凝血分子Rhipilin-1的全长编码基因，核苷酸全长620bp，开放阅读框编码164个氨基酸残基，预测分子量为18kDa，在N-端有一个18个氨基酸构成的信号肽序列，并含有一个典型的Kunitz功能域，该分子与抗凝血分子之一的组织通道抑制因子显著同源。将该基因亚克隆到pGEX-4T-1表达载体，转化到BL21(DE3)宿主菌中，经IPTG诱导，重组GST融合蛋白以可溶性的形式高效表达。以纯化的重组蛋白进行兔血浆复钙时间和部分凝血酶激活时间实验，证实Rhipilin-1分子具有抗凝血生物活性，可用于制备抗凝血生物制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1的血生物基因序列、Rhipilin-1基因在大肠杆菌中的重组表达以及在制备抗凝制剂中的应用。

背景技术

在生物进化过程中，哺乳动物形成了一个复杂的凝血系统来阻止血液的流失，而很多以血液为生的生物体内往往存在很多抗凝血蛋白以对抗宿主的凝血功能。蜱是一类以吸血为生的体外寄生虫。与其他吸血节肢动物相比，蜱的吸血时间特别长，如硬蜱的吸血时间一般在10-14天(Sonenshine，1993)。蜱的长时间吸血过程，必然引起宿主一系列止血反应，如血管收缩、血小板凝集和血液凝固。为了进行持续的吸血，蜱必须克服宿主的止血反应，自从Waxman(1990)鉴定出第一个蜱的抗凝血分子以来，研究人员发现蜱的唾液腺在吸血过程中分泌产生多种抗止血分子，蜱唾液腺分泌的前列腺素D2和I2可以诱导血管收缩和抑制血小板凝集(Bowman，1995)，几种血小板凝集抑制蛋白分子也从硬蜱和软蜱中鉴定(Mans，2002)；针对血液凝固的抗凝血分子，如凝血酶(thrombin)抑制蛋白分子、凝血因子Xa(FXa)抑制蛋白分子和组织因子通路抑制蛋白分子(TFPI)已在美洲花蜱、变异革蜱、间突硬蜱、具尾扇头蜱、微小牛蜱等多种国外优势蜱体内被发现(Maritz-Olivier，2007)。尽管已报道的蜱抗凝血分子多达20多种，但完全鉴定的还很少，获得编码这些蛋白分子的基因序列不超过8个。从目前的结果分析，蜱抗凝血分子多数属于Kunitz家族丝氨酸酶特异性抑制分子，特征性含有1个或2个KU结构功能域和高度保守的半胱氨酸残基，在进化上可能来自同一祖先(Lai，2004)。

由于血栓引起的人心、脑血管疾病严重威胁着人类健康，目前可用的抗栓制剂有限，因此，抗栓药物的研究一直是十分关注的领域(Bates and Weitz，2006)。根据水蛭(蚂蝗)抗凝血分子合成的抗凝血多肽Hirudin已被应用于医学临床(Turk，2006；Bates and Weitz，2006)。在已经鉴定的蜱抗凝血分子中，有2个分子在动物模型实验中具有抗血栓治疗作用，其中1990年鉴定的TAP分子为凝血因子Xa(FXa)抑制剂，重组表达的TAP在多个动物模型上都显示了良好的抗血栓作用，由于抗原性等原因目前还未能在人体临床上使用(Bates and Weitz，2006)，但利用TAP分子的结构和作用机制设计更小的、没有抗原性的抗栓药物，或者构建新型重组抗栓药物分子正在研究并取得进展，例如，应用TAP功能区序列和锚定蛋白Annexin V序列构建一个新的重组抗凝血蛋白分子，其抗血栓活性比单个锚定蛋白Annexin V的活性提高10倍(Chen，2005)。另一个蜱抗凝血分子Ixolaris，是近年从间突硬蜱鉴定的分子，与人的组织通道抑制因子(TFPI)同源，抑制凝血因子VIIa/组织因子复合体，在大鼠模型中，显示了很强的抗血栓作用(Monteiro，2005；Nazareth，2006)。这些研究表明，蜱的抗凝血分子可能开发为新型抗血栓药物。

镰形扇头蜱属于硬蜱，主要分布于南亚及中国南方，是优势蜱种，在牛、羊、狗、兔等多种动物吸血寄生，也可侵袭人体叮咬吸血，但是还未见关于其抗凝血分子的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究镰形扇头蜱抗凝血分子，开发新型抗凝血生物制剂。

本发明提供了镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列，其基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列如下：

镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1的核苷酸序列：

aatattggaa aaacttcagc gagcagaaaa caaccaaagg caatgaagat tttacaatac  60

gcgctcttgg cttgtcttct cgtctcgata ttaggcgatg atgatgacga agaaaacgag  120

ggtgcggcgg ggagtgatga tgcgggcgca acgcctacag cactgtcgaa gccagcagcc  180

acttctgcgg aaggaaacac cgcagcaaaa aactcaggtg gtgacatcaa gcaaccgaaa  240

caagaactgc ccgaaccgtc ctcaaaaggc caaaagaaac cgagactacc caagagatgc  300

ttattcaagc cagaacaggg aaactgcgca ggttctcgtt tccttcctag atggtggtat  360

aacccagaaa ctgagagctg cgaaccattc acttatccag tgtgcaataa gaaaaacgaa  420

gcattcgtat catgtacact gtgcatgaac atgtgcatga ggaataagag gggcagggag  480

aaggctaaat ggattagaaa agtttgtaga aaaagtccga aagtaaaatc tggatgaatg  540

tagttggctc tgccacttct tctgccataa aatattcgaa aacatttgtt atgaataata  600

aaattatcaa aaaaaaaaaa                                              620

镰形扇头蜱蜱抗凝血分子Rhipilin-1氨基酸序列

Met Lys Ile Leu Gln Tyr Ala Leu Leu Ala Cys Leu Leu Val Ser Ile

1               5                   10                  15

Leu Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asn Glu Gly Ala Ala Gly Ser Asp

            20                  25                  30

Asp Ala Gly Ala Thr Pro Thr Ala Leu Ser Lys Pro Ala Ala Thr Ser

        35                  40                  45

Ala Glu Gly Asn Thr Ala Ala Lys Asn Ser Gly Gly Asp Ile Lys Gln

    50                  55                  60

Pro Lys Gln Glu Leu Pro Glu Pro Ser Ser Lys Gly Gln Lys Lys Pro

65                  70                  75                  80

Arg Leu Pro Lys Arg Cys Leu Phe Lys Pro Glu Gln Gly Asn Cys Ala

                85                  90                  95

Gly Ser Arg Phe Leu Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Ser

            100                 105                 110

Cys Glu Pro Phe Thr Tyr Pro Val Cys Asn Lys Lys Asn Glu Ala Phe

        115                 120                 125

Val Ser Cys Thr Leu Cys Met Asn Met Cys Met Arg Asn Lys Arg Gly

    130                 135                 140

Arg Glu Lys Ala Lys Trp Ile Arg Lys Val Cys Arg Lys Ser Pro Lys

145                 150                 155                 160

Val Lys Ser Gly

                                                            。

本发明通过构建镰形扇头蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库，对所有克隆进行末端测序分析，共获得247个有效EST序列。对其中一个抗凝血分子同源性基因的克隆，进行了全序列测定和生物信息学分析，发现其为完整编码基因，命名为Rhipilin-1基因。该基因全长为620bp，在3’端有polyA和polyA的信号序列AATAAAA，含有有一个完整的开放阅读框，从第43个碱基到536个碱基，编码164个氨基酸，预测分子量为18kDa。蛋白质信号肽分析，在N-末端有一个18个氨基酸构成的信号肽序列；蛋白质功能域分析，在第84个氨基酸至第139个氨基酸为一典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂Kunitz功能域。Blast分析发现该分子与抗凝血分子之一的组织通道抑制因子显著同源。

本发明的另一目的是提供了所述镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1在大肠杆菌中的重组表达方法。

根据镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1基因生物信息学分析结果，将不包含信号肽序列的实际编码区亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX-4T-1/Rhipilin-1，转化到BL21(DE3)表达菌后，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示，重组GST融合蛋白获得高效表达，GST-融合蛋白为44kDa，与预期重组蛋白的大小一致，进一步分析表明，重组融合蛋白多数以可溶性蛋白形式存在。

本发明的又一目的是提供了所述镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1在制备抗凝血生物制剂中的应用。

本发明以纯化的镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1重组蛋白，进行兔血浆复钙时间(Recalcification Time，RT)和部分凝血酶激活时间(Activated PartialThromboplastinTime，APTT)实验，证实了该分子具有抗凝血活性。

附图说明

图1镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列分析

其中ATG为起始密码子；下划实线序列为信号肽序列；箭头为信号肽的切割位点；下划虚线序列为Kunitz功能域；TAG为终止密码子；AATAAA为加尾信号。

图2镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1的表达和纯化

M，为标准分子量蛋白；1和2分别为含空载体细菌诱导前和诱导后蛋白带，3和4分别为含重组载体细菌诱导前蛋白带、诱导后蛋白带；5、6、7分别为诱导细菌的不溶性蛋白、可溶性蛋白和纯化的重组蛋白

图3镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1血浆复钙时间实验结果

a为对照GST蛋白(浓度18.75～300nM)；b为生理盐水；c、d、e、f、g分别为浓度为18.75nM、37.5nM、75nM、150nM、300nM的重组Rhipilin-1样品

图4镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1对兔血浆部分凝血酶激活时间的影响1为对照GST蛋白(浓度15.625～250nM)；2为生理盐水；3、4、5、6、7分别为浓度为15.625nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM的重组Rhipilin-1样品

具体实施方式

实施例1镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1的基因克隆和序列分析

1.材料与方法

1.1实验动物：镰形扇头蜱采自湖北水牛，由本实验室繁殖保存。新西兰大白兔购自中科院上海实验动物中心。

1.2试验菌种、质粒及试剂：大肠杆菌菌株DH5α购自博大泰克公司，质粒pGEM-TEasy、T4DNA连接酶购自Promega公司，质粒pGEX-4T-1购自Amersham PharmaciaBiotech；TRIZOL试剂购自Invitrogen公司；DNA胶回收试剂盒购自赛百盛公司；Taq DNA聚合酶、DNA Marker购自TaKaRa公司；PCR SelectTM cDNA SubtractionKit，SMART PCR cDNA Synthesis Kit，PCR Purification Kit为Clontech公司产品。

1.3镰形扇头蜱唾液腺的制备

镰形扇头蜱未吸血成蜱按雌雄1∶1混合接种兔耳，接种后4-5天，取出半饱血雌蜱，解剖镜下分离唾液腺，-70℃保存备用；同一蜱群未吸血雌蜱的唾液腺按同样方法分离。

1.4蜱唾液腺总RNA的提取

采用Invitrogen公司的Trizol试剂，按实验说明操作，分别提取镰形扇头蜱未吸血雌蜱和半饱血雌蜱总RNA，溶于无RNase的水中，测定总RNA浓度，然后保存于-70℃冰箱备用。

1.5双链cDNA的合成

采用Clontech公司的SMART PCR cDNA Synthesis Kit，分别以总RNA为模板，用Olig(dT)18引物在M MLV逆转录酶作用下合成第一链cDNA(ss cDNA)，并用长距离PCR(LD-PCR)扩增cDNA第二链(ds cDNA)；

1.6抑制性消减杂交

应用Clontech PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit。本试验以半饱血雌蜱唾液腺为Tester，以未吸血雌蜱唾液腺为Driver；步骤如下：分别将Adaptor1-Tester cDNA和Adaptor 2R-Tester cDNA与Driver cDNA混合，68℃温育8h，进行第1轮杂交；将上述两个反应产物混合，并再次加入足量的Driver cDNA，68℃过夜，进行第2轮杂交；对消减杂交的产物进行两轮PCR扩增，分别以加接头未消减的半饱血雌蜱的cDNA做对照。PCR的引物序列对应于Adaptor 1和HAdaptor 2R的序列(Clontech PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit)。

1.7消减文库的建立、阳性克隆的筛选、EST序列测定与分析

PCR扩增后的消减杂交产物经PCR Purification Kit纯化，与pGEM-T-easy载体连接，转化到感受态细胞DH5α筛选蓝白斑，挑取全部白色克隆，以巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R进行扩增，将阳性克隆送上海基康生物技术公司测序，测序结果在GenBank上进行同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；

1.8抗凝血分子Rhipilin-1的全长基因序列测定和分析

根据EST序列信息，挑选一个编号为48的EST序列，进行全序列测定和生物信息学分析，结果为完整编码抗凝血分子同源性基因，命名为Rhipilin-1基因。

2.结果与分析

镰形扇头蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库成功构建，对所有克隆进行末端测序分析，共获得247个有效EST序列。对其中一个抗凝血分子同源性基因的克隆，进行了全序列测定和生物信息学分析，发现为完整编码基因，命名为Rhipilin-1基因。该基因全长为620bp，在3’端有polyA和polyA的信号序列AATAAAA，含有有一个完整的开放阅读框，从第43个碱基到536个碱基，编码164个氨基酸，预测分子量为18kDa，蛋白质信号肽分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)发现在N-末端有一个18个氨基酸构成的信号肽序列，蛋白质功能域分析(http://smart.embl-heidlberg.de/smart/job_status.)发现在第84个碱基至139个碱基处有一典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂Kunitz功能域。Blast分析发现该分子与抗凝血分子之一的组织通道抑制因子显著同源。

实施例2镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1基因的重组表达和抗凝血活性验证

1.材料与方法

1.1实验动物：新西兰大白兔购自中科院上海实验动物中心。

1.2试验菌种、质粒及试剂：大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)购自博大泰克公司，质粒pGEM-T Easy、T4DNA连接酶购自Promega公司，质粒pGEX-4T-1购自Amersham Pharmacia Biotech；DNA胶回收试剂盒购自赛百盛公司；Taq DNA聚合酶、DNA Marker、EcoRI和Xhol内切酶购自TaKaRa公司。GST·BindTM试剂盒购自Novagen；APTT试剂盒购于太阳生物技术有限公司；BCA蛋白分析试剂盒为PIERCE公司产品；引物由赛百盛公司合成。

1.3镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1基因的重组表达质粒构建

根据镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1基因生物信息学分析结果，将不包含信号肽序列的实际编码区亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，上游引物为：

5’GAATTCGATGATGATGACGAAGAAAACGAG3’下游引物为：

5’CTCGAGTCATCCAGATTTTACTTTCGGACT3’，5’端和3’端分别引入EcoRI和Xhol I酶切位点，斜体字母表示酶切位点，方框中为保护性碱基。以重组克隆载体pGEM/Rhipilin-1为模板进行PCR扩增；该程序为：94℃2min后，以94℃45s，53℃45s，72℃60s循环30次后，最后72℃延伸10min。将PCR产物回收、酶切、纯化，同时将载体pGEX-4T-1用相应的酶作双酶切，将酶切后纯化的PCR产物和载体连接，转化DH5α，经PCR和酶切鉴定阳性菌落，按试剂盒说明书操作抽提阳性菌的重组质粒pGEX-4T-1/Rhipilin-1；

1.4镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1的重组表达与纯化

将重组质粒转化到BL21(DE3)，37℃、200r/min振荡培养，当菌液OD600在0.6～0.8左右时，向培养基中加入IPTG，使终浓度为1mmol/L，继续培养4h后，离心收集菌体，用12％SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况，重组GST融合表达蛋白，用GST·Bind^TM试剂盒纯化，BCA法测蛋白浓度。

1.5镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1对兔血浆复钙时间的影响

用健康实验兔全血按照9∶1加入3.8％柠檬酸钠，3000r/min离心5min，制成兔柠檬酸钠血浆中。在96孔板中分别加入0.1mL待测血浆，然后加入0.1mL溶解于生理盐水的不同浓度的重组Rhipilin-1样品，样品与生理盐水进行倍比稀释(终浓度为0.15nm/mL-2.4nm/mL)。37℃保温15min；加入0.1mL 0.025mol/L的CaCl₂溶液，于405nm处，0-10min内每隔25s测定一次OD值，OD值的增加反映血浆凝结程度。对照分别加入同样体积的生理盐水和GST蛋白。每次实验做三复孔。

1.6镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1对兔部分凝血酶激活时间的影响试验

将待测血浆0.1mL加入0.1mL鞣花酸部分凝血活酶溶液和0.1mL不同浓度的Rhipilin-1，37℃孵育5min，立即加入0.025mol/L CaCl₂溶液0.1mL，同时开始计时，当溶液出现混浊时停止计时，此时间即为鞣花酸部分凝血活酶激活时间(APTT)。同时分别加入0.1mL生理盐水和GST蛋白代替Rhipilin-1作为对照测定未加RhAP的鞣花酸部分凝血酶激活时间(APTT)。

2.结果与分析

2.1镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1基因的表达与纯化

镰形扇头蜱抗凝血分子Rhipilin-1重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中，经IPTG诱导成功表达。SDS-PAGE结果表明，空质粒pGEX-4T-1表达的GST蛋白为26kDa，重组质粒表达的GST-融合蛋白为44kDa，与预期重组蛋白的大小一致。进一步分析表明，重组融合蛋白多数以可溶性蛋白形式存在，经GST·Bind^TM试剂盒纯化，得到纯化的重组Rhipilin-1(图2)。

2.2重组Rhipilin-1对兔血浆复钙时间的影响

结果如图3所示，加入镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1后，兔血浆复钙时间随浓度增加而延长，当镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1浓度达到75nM以上时，对于血浆凝集的抑制作用差异显著，对照重组GST在不同浓度条件下均无抑制血浆凝集作用；生理盐水对照也无抑制血浆凝集作用，结果表明重组Rhipilin-1对兔血浆有抗凝作用，并具有浓度依赖特征。

2.3重组Rhipilin-1对兔血浆部分凝血酶激活时间的影响

兔血浆部分凝血酶激活时间(APTT)的实验结果如图4所示，与对照生理盐水和重组GST相比，当镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1终浓度为15.625nM以上时，可显著延长兔血浆鞣花酸部分凝血酶激活时间(APTT)，并随着浓度增加激活时间越长，说明镰形扇头蜱抗凝血分子重组Rhipilin-1的抗凝作用十分明显并具有浓度依赖特点。APTT的实验结果也表明重组Rhipilin-1不仅从内源凝血系统抑制血液凝固，对外源凝血途径也有明显的抑制作用。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>一种硬蜱的抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列和重组表达

<130>说明书、权利要求书

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>620

<212>DNA

<213>抗凝血分子Rhipilin-1的核苷酸序列

<400>1

aatattggaa aaacttcagc gagcagaaaa caaccaaagg caatgaagat tttacaatac  60

gcgctcttgg cttgtcttct cgtctcgata ttaggcgatg atgatgacga agaaaacgag  120

ggtgcggcgg ggagtgatga tgcgggcgca acgcctacag cactgtcgaa gccagcagcc  180

acttctgcgg aaggaaacac cgcagcaaaa aactcaggtg gtgacatcaa gcaaccgaaa  240

caagaactgc ccgaaccgtc ctcaaaaggc caaaagaaac cgagactacc caagagatgc  300

ttattcaagc cagaacaggg aaactgcgca ggttctcgtt tccttcctag atggtggtat  360

aacccagaaa ctgagagctg cgaaccattc acttatccag tgtgcaataa gaaaaacgaa  420

gcattcgtat catgtacact gtgcatgaac atgtgcatga ggaataagag gggcagggag  480

aaggctaaat ggattagaaa agtttgtaga aaaagtccga aagtaaaatc tggatgaatg  540

tagttggctc tgccacttct tctgccataa aatattcgaa aacatttgtt atgaataata  600

aaattatcaa aaaaaaaaaa                                              620

<210>2

<211>164

<212>PRT

<213>蜱抗凝血分子Rhipilin-1氨基酸序列

<400>2

Met Lys Ile Leu Gln Tyr Ala Leu Leu Ala Cys Leu Leu Val Ser Ile

1               5                   10                  15

Leu Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asn Glu Gly Ala Ala Gly Ser Asp

            20                  25                  30

Asp Ala Gly Ala Thr Pro Thr Ala Leu Ser Lys Pro Ala Ala Thr Ser

        35                  40                  45

Ala Glu Gly Asn Thr Ala Ala Lys Asn Ser Gly Gly Asp Ile Lys Gln

    50                  55                  60

Pro Lys Gln Glu Leu Pro Glu Pro Ser Ser Lys Gly Gln Lys Lys Pro

65                  70                  75                  80

Arg Leu Pro Lys Arg Cys Leu Phe Lys Pro Glu Gln Gly Asn Cys Ala

                85                  90                  95

Gly Ser Arg Phe Leu Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Ser

            100                 105                 110

Cys Glu Pro Phe Thr Tyr Pro Val Cys Asn Lys Lys Asn Glu Ala Phe

        115                 120                 125

Val Ser Cys Thr Leu Cys Met Asn Met Cys Met Arg Asn Lys Arg Gly

    130                 135                 140

Arg Glu Lys Ala Lys Trp Ile Arg Lys Val Cys Arg Lys Ser Pro Lys

145                 150                 155                 160

Val Lys Ser Gly

                                                              。