人端粒酶逆转录酶和人白细胞介素18融合基因真核表达载体的构建和功能研究

摘要

目的:以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18(hIL-18)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)融合基因,并观察其生物学功能。方法:健康人单核细胞经RT-PCR扩增hIL-18后、T-A克隆。亚克隆至经N heⅠ、H indⅢ酶切的PCDNA 3.1(+)/hTERT中,限制性内切酶验证后,挑选出含有目标基因的正确克隆。经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中。将hTERT/hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T 3细胞中表达,经W estern-b lot验证目的基因表达产物,同时对转染细胞作免疫荧光染色。以EL ISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌γ干扰素的能力,以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力。结果:hTERT/hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA 3.1(+)构建成功,经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析,该基因片段与NCB I基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99.9%;而细胞转染后经W estern-b lot验证,hTERT/hIL-18融合蛋白的分子量约127 kM r,与预期一致,荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达。此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素,并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能。结论:本实验构建的PCDNA 3.1(+)/hTERT-hIL-18质粒能够在真核细胞中表达,并具有生物学功能,为进一步转染树突状细胞,研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。