基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性

摘要

基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性，主要步骤：（1）采用PVC管进行深播试验，在3cm、15cm和20cm三种播深处理下共同探讨耐深播性与相关性状的关系，筛选出耐深播鉴定指标及适宜的筛选深度。（2）利用隶属函数法评价各自交系的耐深播性大小。（3）利用70对多态性微卫星标记分析51份自交系的耐深播遗传多样性。（4）结合自交系在三种播深下的性状表现，耐深播性评价结果及耐深播种质微卫星标记结果来挖掘玉米耐深播种质类群。此方法从形态学和分子生物角度研究了玉米种质的耐深播性，重复性强，结果可靠，能够大大提高耐深播种质筛选与应用效率。

说明书

技术领域

本发明属于农业新品种选育技术领域，涉及玉米自交系耐深播性鉴定指标的筛选方法，特别涉及基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性。

技术背景

种子萌发阶段是作物能否在干旱条件下完成生育周期的关键时期之一，苗期遇干旱时出苗能力下降，保苗率降低，严重影响田间苗数，从而导致减产。玉米对干旱比较敏感，干旱缺水不仅阻碍玉米生长发育，干扰生理过程，而且严重影响产量，深播是玉米苗期避旱的重要途径之一, 研究玉米种质资源的耐深播特性对干旱地区玉米生产和耐深播育种具有重要意义。

作物的耐深播性是受多种因素综合作用的一个非常复杂的遗传性状，机理极其复杂，且易受环境影响，因此这给作物的耐深播性研究带来了诸多困难。目前玉米的耐深播性虽有报道，学者普遍认为出苗率是耐深播种质鉴定的重要指示指标，但是对玉米其它耐深播种质鉴定指标的筛选罕见报道。

学者已经提出了一些作物耐深播评价方法。张磊等（张磊, 刘志增, 黄亚群, 陈景堂, 祝丽英. 46个玉米自交系耐深播特性分析. 河北农业大学学报, 2007, 30(3): 18-21.）在15cm播深下，利用根茎长评价了玉米自交系的耐深播性；张晓龙等（张晓龙, 陈佳慧, 林琪, 兰进好. 小麦新品系耐深播特性分析. 农业科技通报, 2009, 6: 49-51, 51.）在小麦上利用供试材料的平均地中茎长，并做Duncan多重比较，评价了小麦品系的耐深播性；彭云玲等（彭云玲, 杨芳林, 赵小强, 任续伟. 不同玉米自交系耐深播能力的差异分析.干旱地区农业研究，2014,，32(1)：25-32.）在15cm播深下，利用出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长、根长、根数等7个性状对45份自交系进行聚类分析，评价了各材料的耐深播性。虽然利用这些方法也能评价作物的耐深播特性，但是这些方法只注重了个别指标，或模糊的将材料聚成不同类型，而对材料的耐深播性缺乏全面地评价，也不清楚材料的耐深播性大小，更不清楚玉米耐深播种质类群，因此给玉米耐深播种质筛选和应用带来了很大的盲目性。

微卫星标记，也称为简单重复序列（simple sequence repeats、SSR），作为一种新兴的分子标记，在遗传多样性分析、基因定位、分子标记辅助育种等领域具有重要意义。由于隶属函数法能够综合多种因素对作物的某一性状进行评价，因此该方法对作物的性状评价具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性。以此筛选出广泛适合于玉米耐深播性鉴定的参考指标及适宜的筛选深度；提出一种玉米耐深播性综合评价新方法并进行耐深播性评价；在此基础上，分别结合材料的性状表现及耐深播性评价结果，从分子生物学角度挖掘玉米耐深播种质类群，进一步了解耐深播种质的遗传多样性，为耐深播种质的筛选与应用提供理论依据。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性，包括如下步骤：

（1）收集材料：收集51份玉米自交系材料；

（2）种子清选：在51份材料中分别选取饱满一致、无破损的种子10粒各10份；

（3）深播试验：采用PVC盆栽试验法，往尼龙网封底的高40cm、直径15cm 的PVC管中分层装入蛭石，然后分别将步骤（2）所得的51份自交系的种子10粒均匀地播于蛭石上，再分别盖3cm、15cm和20cm蛭石使管内蛭石高度达40cm。其中3cm为对照处理，15cm和20cm为两个深播处理，每一处理3次重复，播前统一配土、装钵、浇水；在室内条件下萌发10d后统计出苗率，每一处理选取整体一致的幼苗6株测定其胚芽鞘长、中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长；

（4）培养黄化苗：51份自交系各取10粒种子先用ddH₂O清洗2次，再用体积百分比为75%的酒精消毒10min，最后用ddH₂0冲洗3次，将种子放在灭过菌且铺有两层滤纸的培养皿上，浇适量ddH₂O，放置培养箱中25℃进行暗培养，待黄化苗长至3~5cm时迅速剪其黄化苗，装入自封袋中编号，-70℃保存；

（5）DNA提取：用CTAB法提取步骤（4）所得的自交系黄化苗全基因组DNA，用质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用德国IMPLEN微量分光光度仪检测DNA浓度；

（6）PCR扩增：PCR反应在Biometra-T1PCR仪上进行，采用10uL反应体系，包括Mix5.0uL，1mmol/L正、反SSR引物各0.3uL，ddH₂O 3.7uL，50ng/uL DNA0.7uL；PCR反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，50-59℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃结束并保存；扩增产物用质量百分比为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染；

（7）筛选SSR标记：从玉米基因组数据库网站（http://www.MaizeGDB.org）中选择了均匀分布于玉米全基因组的230对SSR引物，由上海生工生物工程有限公司合成；选择黄早四、掖478、丹340、齐319、Mo17和B73这6份国内玉米杂种优势群的标准测验种为多态性SSR引物筛选材料，用步骤（5）所得的这6份自交系的DNA，同时进入步骤（6），若上述6份自交系PCR扩增产物在两份或两份以上自交系间有差异，则认为这对引物为多态性引物，总共筛选出了70对条带清晰、多态性好的SSR引物；

（8）耐深播种质的微卫星标记：用步骤（7）所得的70对SSR引物和步骤（5）所得51份自交系的DNA同时进入步骤（6），分析51份自交系的耐深播遗传多样性；

（9）结果分析：对步骤（3）测得的数据用统计软件SPSS16.0的相关程序进行方差分析、相关分析及描述统计，筛选出玉米耐深播性鉴定指标及适宜的筛选深度，利用隶属函数法对51份自交系的耐深播性进行综合评价，评价每一自交系的耐深播性；用Patentin version3.5软件生成70对多态性SSR引物序列，对步骤（8）统计的数据用NTYSY-pc2.1软件分析51份自交系的耐深播遗传多样性并划分种质类群；最后结合自交系在三种播深下的性状表现、耐深播性综合评价结果及耐深播种质微卫星标记结果来挖掘玉米耐深播种质类群。

本发明以51份玉米自交系为试材，在3cm、15cm和20cm三种播深处理下，进行深播试验来共同探讨出苗率、胚芽鞘长、中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长与耐深播性的关系，以此筛选出广泛适合于玉米耐深播性鉴定的参考指标及适宜的筛选深度；根据耐深播鉴定指标及适宜的筛选深度，用隶属函数法对51份自交系的耐深播性进行综合评价；结合各自交系在三种播深下的性状表现，耐深播性综合评价结果及耐深播种质微卫星标记结果确定了玉米耐深播种质类群。本发明提供的方法在室内进行，重复性好，结果可靠，不仅能综合多种环境、多个耐深播相关性状，从形态学客观、准确地评价玉米种质的耐深播性大小，还从分子生物学角度揭示了耐深播种质类群，因此大大提高了耐深播玉米种质的筛选、应用效率与目的性，为玉米耐深播育种奠定了坚实的基础，具有很高的应用价值。

本领域的技术人员清楚，玉米自交系种子试验材料并非限于51份，本发明以51份玉米自交系种子试验材料为例，是为了清楚描写技术方案的内容。

附图说明

图1是利用UPGMA聚类分析法将51份自交系划分为Ⅰ和Ⅱ两大优势群的图。

具体实施方式

本发明下述实施例中所用方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用器材、试剂均为通过商业途径从试剂公司购买的常规器材、试剂。

基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性，按以下步骤进行：

（1）收集材料：收集黄早四、掖478、丹340、齐319、Mo17与B73等51份自交系。

（2）种子清选：从51份自交系中分别选取饱满一致、无破损的种子10粒各10份，供试验所用。

（3）深播试验：采用PVC盆栽实验法，先往尼龙网封底的高40cm、直径15cm的PVC管中分层装入蛭石，然后分别将51份自交系中饱满一致、无破损的种子10粒均匀地播于蛭石上，再分别盖3cm、15cm和20cm蛭石使管内蛭石高度达40cm。其中3cm为对照处理，15cm和20cm为两种深播处理，每一处理3次重复，播前统一配土、装钵、浇水；在室内条件下萌发10d后统计出苗率，每一处理选取整体一致的幼苗6株测定其胚芽鞘长、中胚轴长、苗长及根长。

（4）培养黄化苗：51份自交系各取10粒种子先用ddH₂O清洗2次，再用体积百分比为75%的酒精消毒10min，最后用ddH₂0冲洗3次，将种子放在灭过菌且铺有两层滤纸的培养皿上，浇适量ddH₂O，放置培养箱中25℃进行暗培养，待黄化苗长至3~5cm时迅速剪其黄化苗，装入自封袋中编号，-70℃保存。

（5）DNA提取：用CTAB法从51份自交系的黄化苗中提取各材料的全基因组DNA，用质量百分比为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用德国IMPLEN微量分光光度仪检测DNA浓度。

（6）PCR扩增：PCR反应在Biometra-T1PCR仪上进行，采用10uL反应体系，包括Mix5.0uL，1mmol/L正、反SSR引物各0.3uL，ddH₂O 3.7uL，50ng/uL DNA0.7uL；PCR反应程序为：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，50-59℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃结束并保存；扩增产物用质量百分比为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染。

（7）筛选SSR标记：从玉米基因组数据库（Maize Genome Database）网站（http://www.MaizeGDB.org）中选择了均匀分布于玉米全基因组的230对SSR引物，由上海生工生物工程有限公司合成；选择黄早四、掖478、丹340、齐319、Mo17和B73这6份国内玉米杂种优势群的标准测验种为多态性SSR引物筛选材料，用步骤（5）所得的这6份自交系的DNA，同时进入步骤（6），若上述6份自交系PCR扩增产物在两份或两份以上自交系间有差异，则认为这对引物为多态性引物，从均匀分布于玉米全基因组的230对SSR标记中筛选出了70对条带清晰、多态性好的SSR多态性引物。

（8）耐深播种质的微卫星标记：用步骤（7）所得的70对多态性SSR引物和步骤（5）所得51份自交系的DNA同时进入步骤（6），分析51份自交系的耐深播遗传多样性。

（9）测定计算下述指标：

出苗率(%) =(出苗数/播种数)*100；

胚芽鞘长(cm) =从胚芽鞘节到胚芽鞘顶端的长度；

中胚轴长(cm) =从种子到胚芽鞘节之间的长度；

中胚轴与胚芽鞘之和(cm) =从种子到胚芽鞘顶端的长度；

苗长(cm) =中胚轴和胚芽鞘接合点以上部分的长度；

根长(cm) =最长根的长度。

（10）耐深播性评价：利用隶属函数法对51份自交系进行耐深播性综合评价，其公式为：

Uij=(Xij-Xj_min)/(Xj_max-Xj_min)(1)

Uij=1-(Xij-Xj_min)/(Xj_max-Xj_min)(2)

式中：Uij表示i材料j指标的耐深播隶属值；Xij表示i材料j指标的测定值；Xj_min表示所有材料j指标的最小值；Xj_max表示所有材料j指标的最大值。若所测指标与材料的耐深播性呈正相关，则采用（1）式计算隶属值，反之则用（2）式。累加各指标的具体隶属值，并求出平均值后进行比较，平均值越大，自交系的耐深播性越强。

（11）实验结果分析

（11.1）玉米耐深播筛选深度的确定

整体而言，随着播深的增加（3cm增加到15cm或20cm），51份自交系的出苗率、苗长及根长呈降低趋势，而中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和呈增加趋势，这些性状在各自交系间变化幅度不同。说明与对照3cm播深相比，15cm和20cm播深更适宜于玉米耐深播性的筛选。

（11.2）玉米耐深播性鉴定指标的筛选

由表1所示，出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长在自交系间差异极显著，说明这6个性状受自交系本身遗传特性的控制，因此在耐深播鉴定时对它们选择是有效的。出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长在播深间差异极显著，根长在播深间差异显著，说明播深极显著影响自交系的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长，显著影响根长，并且这些性状随着播种深度的增加其变化增大。另外，除根长在自交系与播深互作间差异不显著外，其余5个性状在自交系与播深互作间的差异也达到极显著水平，说明自交系的这6个性状对播深的敏感程度不同，出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和，苗长对播深的敏感程度高，而根长对播深的敏感程度低。综上所述，除出苗率作为玉米耐深播性的指示指标外，中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长、根长等也可以作为耐深播性的鉴定指标。

由表2所示，在3cm播深下，出苗率与中胚轴长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长显著正相关，与胚芽鞘长、根长正相关，但不显著；而在15和20cm两种播深下，出苗率与中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长、根长都极显著正相关，说明在播深处理时，中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长是玉米幼苗出土的重要动力，它们共同作用将玉米幼苗送出地表。另外，播深与出苗率、苗长极显著负相关，与中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、根长极显著正相关，综上所述出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长及根长作为玉米耐深播性的重要鉴定指标，这6个性状与玉米的耐深播性都极显著正相关。

（11.3）玉米自交系的耐深播性综合评价

利用隶属函数法对51份自交系的耐深播性进行综合评价。即根据耐深播性鉴定指标（出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长与根长），先分别计算出各自交系在适合于耐深播筛选的两种播种深度，即15cm和20cm播深下的隶属值，再取其平均值作为每一自交系的耐深播性大小，并将51份自交系划分为强耐深播类型（隶属值﹥0.55），中等耐深播类型（隶属值在0.45-0.55之间）和弱耐深播类型（隶属值＜0.45）。由表3所示，51份自交系的耐深播性在0.08-0.75之间，其中6份强耐深播系，11份中等耐深播系，34份弱耐深播系。

（11.4）耐深播玉米种质的微卫星标记及挖掘

用NTSYS-pc2.1软件分析51份自交系的遗传多样性，由表4所示，70对SSR标记在51份自交系间共检测到222个等位基因，每对引物检测到2-6个，平均3.17个；每对引物的多态性信息量（PIC）变化范围为0.265-0.801，平均0.579，说明51份自交系遗传背景复杂，遗传多样性较丰富。并用Patentin version 3.5软件生成了70对SSR引物的序列表，如下：

<110> 彭云玲赵小强

<120> 基于微卫星标记和隶属函数法研究玉米种质的耐深播性

<160>70    

<170> PatentIn version 3.5

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.）

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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<213> 玉米属玉米(zea mays L.)

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由图1所示，利用UPGMA聚类分析法，将51份自交系划分为Ⅰ和Ⅱ两大优势群，共（A-F）6个亚群。即A为四平头亚群，包括黄早四、430、K12、502优、K805、R802A、R802、W182BW、W64A、N192等10份自交系；B为PB亚群，包括齐319、178、T58等3份自交系；C为兰卡斯特亚群，包括Mo17、Va26、自330、01743-2、黄C、ND246、Pa91、Mo22、Mo12、DV、A654、AR234、TS109、H105W等14份自交系；D为旅大红骨亚群，包括丹340、DM、吉853、WN11、综3、Va35、Va35-2等7份自交系；E为Reid亚群，包括B73、K22、CM、B37、B68、CV、B64、H84等8份自交系；F为PA亚群，包括掖478、郑22、Va102、TS164、TS163、TS110、TS161、TS165、TS66等9份自交系。

结合51份自交系在三种播深下6个性状的具体表现，发现四平头亚群、兰卡斯特亚群、旅大红骨亚群的出苗率、中胚轴长、胚芽鞘长、中胚轴与胚芽鞘之和、苗长、根长等指标表现良好，结合51份自交系耐深播性综合评价结果，发现四平头亚群、兰卡斯特亚群、旅大红骨亚群的耐深播性明显强于PA亚群、PB亚群、瑞德亚群，这3个亚群含有较多的强或中等耐深播系。因此四平头亚群、兰卡斯特亚群、旅大红骨亚群是重要的耐深播种质类群。

从上述实例可以看出，此方法在室内进行，重复性好，不仅能综合多种环境、多个耐深播相关性状，客观、准确地评价玉米种质的耐深播性大小，而且从分子生物学角度揭示了耐深播种质类群，因此大大提高了耐深播玉米种质筛选的效率和目的性，为玉米耐深播育种奠定了坚实的基础，具有很高的应用价值。