修复酮古龙酸菌辅因子代谢缺陷提高2-酮基-L-古龙酸生产能力的方法

摘要

本发明公开了一种在维生素C二步混菌发酵过程中，通过添加辅因子—泛醌（CoQ

说明书

技术领域:

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种通过对微生物生长因子的选择与优化，使酮古 龙酸菌产2-KGA(2-酮基-L-古龙酸)能力提高的方法，以及改造维生素C发酵工艺。

背景技术：

维生素C(VC)是人体必需的一种维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具有 广泛的生理作用，在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其 应用范围广阔，市场规模巨大。

目前，全球90％以上的VC生产，均利用我国发明的“二步发酵法”。其第一步发酵是在 氧化葡萄糖酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。第二步是在一种混合菌系的作用下 将L-山梨糖进一步氧化成VC的重要中间体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。最后经过化学转 化使2-KGA生成VC。

“二步发酵法”的主要特点是在第二步发酵过程中，由于芽孢杆菌Bacillus sp.(俗称大菌) 的伴生作用，酮古龙酸菌Ketogulonigenium sp.(俗称小菌)的生长和2-KGA的产率得到很 大提高，但大菌没有任何产生2-KGA的能力，其主要作用是辅助小菌生长。故小菌作为 2-KGA产生菌，对其代谢能力的增强一直是学者们的研究热点。

本发明前期分别完成了维生素C二步发酵工业菌株大菌与小菌的基因组测序及其代谢 网络的构建工作，进一步通过对大小菌代谢网络进行交互分析发现，小菌的泛醌(CoQ₁₀) 及甲基萘醌(VK₂)合成途径存在代谢缺陷，而大菌体内存在小菌缺陷的功能基因，故认 为大菌在形成芽孢释放胞内内容物的过程中，可以通过为小菌提供CoQ₁₀前体对羟基苯甲 酸、VK₂及VK₂前体分支酸和异分支酸等物质促进小菌生长代谢。

虽然大部分革兰氏阴性菌中泛醌(CoQ)存在形式为CoQ₈，但是亦有部分以辅酶吡 咯喹啉醌(PQQ)存在为代表的革兰氏阴性菌，如副球菌属(Paracoccus sp.)、葡糖杆菌属 (Gluconobacter sp.)及红杆菌属(Rhodobacter sp.)等，其泛醌形式以CoQ₁₀的形式存在， 并且该泛醌的结构与人体内存在的CoQ₁₀相同。由于小菌体内存在PQQ，亦属于红杆菌科 (Rhodobacteraceae)，并且泛醌代谢途径相关酶基因均与红杆菌对应酶基因具有较高的同 源性，故认为小菌体内泛醌形式亦为CoQ₁₀。

基于小菌代谢网络分析及大小菌代谢交互分析发现，小菌CoQ₁₀的前体来源于对氨基 苯甲酸与聚丙烯二磷酸(Polyprenyl diphosphate)，但是由于小菌不能独立合成对氨基苯甲 酸，故认为大菌可通过为小菌提供对氨基苯甲酸，满足小菌自身CoQ₁₀的合成。

另一方面，小菌体内缺乏VK₂合成的部分酶系统，但大菌可以将分支酸转化为异分支 酸进而完整的合成VK₂，故认为在混菌发酵体系中，通过补充分支酸(异分支酸)可以提 高大菌VK₂的积累，进一步满足小菌的代谢需求。

由于CoQ₁₀在小菌体内作为呼吸链中NADH氧化酶与琥珀酸脱氢酶的电子受体参与 电子传递；VK₂亦作为小菌细胞膜中的重要组成成份，参与多种电子传递过程，例如作为 琥珀酸脱氢酶的电子传递体，故通过对上述物质的补充，将对提高小菌的基础代谢水平， 提高菌体数量起到关键的作用。同时，小菌在利用以PQQ为辅酶的山梨糖脱氢酶(SDH) 将底物L-山梨糖转化为2-KGA的过程中，L-山梨糖脱氢释放的电子亦经过呼吸链与氧气结 合，故上述物质的补充，在增强小菌呼吸链呼吸功能的同时，亦可促进其产2-KGA的速率。

本发明基于大、小菌的生理代谢基础研究，发现并验证了上述物质在产2-KGA发酵过 程中，可以增强小菌菌体数量并明显降低发酵周期。同时本发明公开前，未见有将上述物 质应用于维生素C二步发酵产2-KGA过程中的报道。

发明内容：

本发明的目的在于利用微量的小菌代谢缺陷物，添加到常规的产2-KGA种液及发酵培 养基中，用以增强小菌代谢能力，降低发酵周期，从而提高酮古龙酸菌产2-KGA能力。

实际上，本发明涉及一种通过对小菌代谢缺陷途径的修复，使酮古龙酸菌产2-KGA能 力提高的方法。

进一步说，对小菌代谢缺陷途径的修复，既为在产2-KGA种液及发酵培养基中添加小 菌不能直接合成的物质，包括：CoQ₁₀、VK₂(包括氧化型及还原型)、对羟基苯甲酸及分 支酸、异分支酸中的一种或几种。

本发明还提供了用于制备种液的培养基及用于发酵的培养基，该培养基包括制备种液 及发酵液的常规培养基，其特征在于：培养基中包括所述小菌代谢缺陷物质的至少一种物 质，所述的小菌代谢缺陷物质在培养基中出现的方式包括直接加入也包括以其它混合物形 式间接加入。

上述培养基中，所述小菌代谢缺陷物质加入量分别为：20μg/L-500μg/L CoQ₁₀，10μg/L -35μg/L VK₂，5μg/L-30μg/L对羟基苯甲酸，5μg/L-50μg/L分支酸及异分支酸。当添加量低 于下限对代谢促进作用不明显，当添加量高于上限时，对产2-KGA出现抑制，亦造成原料 的浪费。确定的加入常规种液培养基中的最佳缺陷代谢物组合为：50μg/L CoQ₁₀，10μg/L  VK₂，5μg/L对羟基苯甲酸及10μg/L分支酸；确定的加入常规发酵液中的最佳缺陷代谢 物组合为：10μg/L VK₂，25μg/L对羟基苯甲酸及10μg/L分支酸。

上述常规种液及发酵培养基一般来讲，既为目前VC二步发酵工业生产中使用的培养 基，具体由下列成份组成：

1.常规种液培养基：1-3％L-山梨糖，0.3-1％玉米浆，0.1-0.5％葡萄糖，0.05-0.3％尿 素，0.1-0.3％碳酸钙，pH 6.7-7.0，121℃灭菌20min。

2.常规发酵培养基：8-12％L-山梨糖、0.3-3％玉米浆、0.05-0.2％磷酸二氢钾,0.05-0.5％ 尿素，0.005-0.02％硫酸镁，0.1-0.5％碳酸钙，pH6.7-7.0，其中碳源(L-山梨糖)和氮源 分开灭菌，灭菌条件为121℃，20min。

在常规种液培养基及发酵培养基中加入上述至少一种小菌代谢缺陷物质是本发明的重 点。这些物质既可以在培养基配制的时候添加，也可以在发酵开始后以补料方式加入。

小菌代谢缺陷物质的加入方法如下：

1.CoQ₁₀：以丙酮为溶剂，制成5％溶液，过滤除菌后加入灭菌后的培养基；

2.VK₂：以无水乙醇为溶剂，制成1％溶液，直接加入灭菌后的培养基；

3.对羟基苯甲酸：方法同VK₂；

4.分支酸：与培养基中其它组分同时加入，灭菌备用。

5.异分支酸：与培养基中其它组分同时加入，灭菌备用。

本发明的技术方案如下：

方案1.常规种液培养基中添加小菌代谢缺陷物质，提高发酵过程中2-KGA产率

将常规方法制备的大小菌混合培养的斜面(混菌斜面)，接种于添加了不同小菌代谢缺 陷物质的常规种液培养基中，28-34℃培养16-28h制成种液，5-15％接种于常规发酵培养 基中，28-34℃培养至底物L-山梨糖小于1mg/L。

方案2.发酵液中添加小菌代谢缺陷物质，提高发酵过程中2-KGA产率

混菌斜面接种于常规种液培养基中，28-34℃培养16-28h制成种液，5-15％接种于添 加了不同小菌代谢缺陷物质的基础常规发酵培养基中，28-34℃培养至底物L-山梨糖小于 1mg/L。

方案3.在种液及发酵液中均添加小菌代谢缺陷物质提高发酵过程中2-KGA产率

参见方案1与方案2。

在种液中添加小菌代谢缺陷物质能明显提高种液中小菌的数量，并在进一步的发酵过 程中降低发酵周期，但转化率较对照组相比提升不大。

在发酵液中添加小菌代谢缺陷物质亦可提高小菌数量，且发酵周期与方案1相比进一 步降低，但转化率相较对照组提升不大。

在种液及发酵液中均添加小菌代谢缺陷物质，与方案2相比周期进一步缩短，且转化 率与对照组持平。

本发明揭示了在添加小菌代谢缺陷物质后，可以增强菌体的代谢效率，明显提高菌体 生长及产2-KGA速率，该发明将对工业水平上进一步提高产率，降低生产成本起到积极的 作用。通过修复酮古龙酸菌(小菌)辅因子代谢缺陷，改善呼吸链电子传递效率，提高菌 体代谢水平，增加维生素C二步发酵中2-KGA产量。

附图说明

下面结合图1及具体实施方式对本发明做进一步详细说明：

图1是基于大小菌代谢交互分析构建的大小菌泛醌及萜类醌生合成代谢网络交互图。其中实线框里的 物质代表本发明涉及到的小菌缺陷代谢物，虚线框里的物质代表小菌上游存在的代谢途径，实线细箭头 代表小菌存在的代谢反应，实线粗箭头代表小菌缺陷而大菌存在的代谢反应，虚线细箭头代表省略的小 菌体内存在的代谢步骤，虚线粗箭头代表省略的大菌存在而小菌缺陷的代谢步骤，箭头上的数字代表该 反应酶的EC编号。

具体实施方式：

为了更好的阐明通过对小菌代谢缺陷功能的修复提高产2-KGA效率的应用，下面将描 述本发明的四个实施例，但本发明的内容包括但不局限于此。

实施实例1：单因素条件下考察种液中添加小菌代谢缺陷物质对产2-KGA能力的影响

常规种子培养基为：2％L-山梨糖，0.5％玉米浆,0.2％葡萄糖,0.1％尿素0.2％碳酸 钙，pH6.7-7.0。

常规发酵培养基为：8％L-山梨糖,1.5％玉米浆,0.1％磷酸二氢钾,0.1％尿素，0.01％硫 酸镁，0.5％碳酸钙，pH6.7-7.0。

培养条件：混菌培养的斜面接种于常规种液培养基中，30℃220转/分，摇瓶培养20h 制成种液，10％接种于分别添加了不同小菌代谢缺陷物质的常规发酵培养基中，30℃220 转/分，摇瓶培养至底物L-山梨糖小于1mg/L发酵结束。

在常规种液培养基中分别添加的小菌代谢缺陷物质的浓度及发酵结果见表1.

表1.单因素条件下种液中添加小菌代谢缺陷物质对发酵的影响.

[注]加粗字体为最适浓度活性物质对发酵的影响.

由表1可知，上述5种小菌代谢缺陷物质均对小菌生长具有显著的促进作用，并在进 一步发酵过程中显著的降低了发酵周期，当CoQ₁₀浓度为100μg/L，VK₂浓度为20μg/L， 对羟基苯甲酸浓度为15μg/L，分支酸浓度为25μg/L，异分支酸浓度为25μg/L时，对发酵 周期的降低作用最为明显，分别降低发酵周期9.27％，10.30％，6.19％，5.15％，6.19％，但 转化率较对照组相比提升不大。

实施实例2：单因素条件下考察常规发酵液中添加小菌代谢缺陷物质对产2-KGA能力的影 响

在常规发酵培养基中分别添加的小菌代谢缺陷物质，浓度见表2.

常规种子培养基：参见实例1.

常规发酵培养基为：参见实例1.

培养条件：参见实例1.实验结果见表2.

表2.单因素条件下发酵液中添加小菌代谢缺陷物质对发酵的影响.

[注]加粗字体为最适浓度活性物质对发酵的影响.

由表2可知，上述5种小菌代谢缺陷物质均在促进小菌生长的同时，显著的降低了发 酵周期，其中以100μg/L CoQ₁₀，20μg/L VK₂，15μg/L对羟基苯甲酸，25μg/L分支酸及25 μg/L异分支酸对发酵周期的降低作用最为明显，分别降低发酵周期14.43％，13.40％， 10.31％，9.28％，10.31％，但转化率较对照组相比略有下降。

实施实例3：优化后的小菌代谢缺陷物质位组合添加到种液或发酵液中对产2-KGA能力的 影响

常规种子培养基：参见实例1.

常规发酵培养基为：参见实例1.

培养条件：参见实例1.

利用正交分析法在种液中添加不同代谢缺陷物质组合，以发酵液发酵周期为结果，考 察种液中添加不同活性物质组合对最终发酵周期的影响，实验结果见表3.

表3.L₁₆(4^5)4水平5因素正交分析结果.

[注]加粗字体为最适浓度活性物质对发酵的影响.

由表3.可知，加入常规种液培养基中的最佳缺陷代谢物组合为：50μg/L CoQ₁₀，10μg/L  VK₂，5μg/L对羟基苯甲酸及10μg/L分支酸。

由于CoQ₁₀与异分支酸原料价格比较昂贵，故认为其不适于在发酵过程中添加，所以 在发酵培养基中，拟利用正交分析法，考察添加较为廉价的VK₂，对羟基苯甲酸及分支酸 配方组合对发酵周期的影响，实验结果见表4.

表4.L₉(3^4)3水平4因素正交分析结果.

[注]加粗字体为最适浓度活性物质对发酵的影响.

由表4.可知，加入常规发酵培养基中的最佳缺陷代谢物组合为：10μg/L VK₂，25μg/L 对羟基苯甲酸及10μg/L分支酸。

进一步考察三种情况下碳源组合对产2-KGA的影响：

实验组1：只在种液中添加缺陷代谢物组合；

实验组2：只在发酵液中添加缺陷代谢组合；

实验组3：在种液及发酵液中均添加缺陷代谢组合。

结果见表5.

表5.优化后的缺陷代谢组合添加到种液或发酵液中对发酵能力的影响.

由表5可知，无论是只在种液中添加缺陷代谢物组合还是在发酵液中添加缺陷代谢物 组合均较只添加单一组分对产2-KGA的促进作用强。体现为虽然转化率并未见显著提升， 但明显的降低了发酵周期，实验组1,2,3分别降低发酵周期为10.31％，14.43％及15.46％。

实施实例4：将优化后的缺陷代谢物组合应用于采用流加工艺的5L发酵系统中对产2-KGA 能力的影响

常规种子培养基：参见实例1.

常规流加工艺发酵培养基：

(1)基液：2％L-山梨糖，2％玉米浆，0.1％磷酸二氢钾,0.12％尿素，0.01％硫酸镁， pH6.7-7.0。

(2)流加液1：30％L-山梨糖

(3)流加液2：25％碳酸钠

(4)流加液3：5％泡敌

进一步优化工艺，确定种子培养基添加物质与实例3一致。发酵液中基液中添加的最 佳缺陷代谢物组合为：10μg/l VK₂及15μg/l对羟基苯甲酸；流加液1中添加的最佳缺陷代 谢物组合为：10μg/l对羟基苯甲酸及10μg/l分支酸。

培养条件：将制好的种液(种液的制备参见实例3)10％接种于5L发酵罐基底中，培 养8h后，开始流加底物L-山梨糖(流加液1)，流加期间保证L-山梨糖的浓度为2-4％，流 入的总糖量为终点发酵液的10％。发酵期间，溶氧(DO)控制在20-30％，利用流加液2 控制在pH 6.7-7.0，温度维持在28-30℃，当底物L-山梨糖小于1mg/L发酵结束。

分别考察三种情况下代谢缺陷物质组合对产2-KGA的影响：

实验组1：只在种液中添加代谢缺陷物质组合；

实验组2：只在发酵液中添加代谢缺陷物质组合；

实验组3：在种液及发酵液中均添加代谢缺陷物质组合。

实验结果见表6.

表6.优化后的代谢缺陷物质组合在5L发酵罐中对产2-KGA能力的影响.

由表6可知，无论是只在种液中添加缺陷代谢物组合还是在发酵液中添加缺陷代谢物 组合对发酵效率的促进趋势与应用实例3一致。体现为实验组1,2,3虽然转化率并未见显著 变化，但发酵周期分别降低了6.73％，13.46％，15.38％，其中种液及发酵液中均添加代谢 缺陷物后对产2-KGA发酵效率的提高最为显著(周期降低15.38％)。故提示该发酵工艺具 有良好的应用价值。

本发明所选用的代谢缺陷物质均为普通工业生产原料，且用量极低，使用成本低廉且 添加方便，故有望在实际工业发酵过程中进一步提高2-KGA收率，降低成本。