D-同型半胱氨酰-L-苯丙氨酸类二肽衍生物在制备新德里金属-β-内酰胺酶1抑制剂中的用途

摘要

本发明涉及D-同型半胱氨酰-L-苯丙氨酸类二肽衍生物在制备新德里金属-β-内酰胺酶1(NDM-1)抑制剂中的用途。具体地，本发明涉及通式I的化合物在制备用于预防和/或治疗感染性疾病的药物和制备NDM-1抑制剂中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及D-同型半胱氨酰-L-苯丙氨酸类二肽衍生物在制备用于预防和/或治疗感染性疾病的药物中的用途。本发明进一步涉及D-同型半胱氨酰-L-苯丙氨酸类二肽衍生物在制备NDM-1抑制剂中的用途。

背景技术

2010年8月11日，医学杂志《柳叶刀》报导，南亚出现了一种特殊的肠杆菌科细菌，对几乎对所有抗生素都有耐药性[1]，被称为“超级细菌”。该细菌的质粒上携带有blaNDM-1基因，其能够表达一种β-内酰胺酶，几乎可以水解所有临床应用的抗生素。因为首个病例在印度新德里被发现，所以这种内酰胺酶称为新德里金属-β-内酰胺酶1(New Delhi metallo-β-lactamase1,NDM-1)。实际上，还有人报道了一些表达NDM-1的细菌或由其导致的病例。例如，2010年3月，在印度孟买发现了22株NDM-1细菌^[3]；2010年5月，英国发现NDM-1大肠埃希氏菌的感染病例^[4]；2010年8月，在美国安大略州发现首例NDM-1肺炎克雷伯氏菌的感染病例^[5]；以及在2010年10月，澳大利亚也发现NDM-1大肠埃希氏菌的感染病例^[6]。目前，世界上已有近三百例NDM-1病菌感染，广泛分布在世界各地，并且新感染的病例数目正在不断上升^[1，7-13]。

blaNDM-1基因位于质粒上，可以在不同菌种之间转移，从而会使得其他菌种也具有耐药性。携带这样的NDM-1基因的菌株主要有大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌，但在变形杆菌、鲍曼不动杆菌、产酸克雷伯菌、普罗威登菌、弗劳地枸橼酸杆菌、屎肠球菌和摩根摩根菌等细菌中也检出过NDM-1的表达^[1-3，9-12]。表达NMD-1的细菌对临床上常用的绝大多数抗生素均有耐药性，例如亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡咯、氨曲南、环丙沙星、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米诺环素等^[1，2，9]。

目前尚无针对NDM-1的有效药物的报道，因此亟需能够针对NDM-1活性的抑制剂或药物以预防或治疗由表达这种酶的病原体如细菌引起的感染性疾病。

发明内容

在第一方面，本发明涉及通式I的化合物或其药学可接受的盐在制备用于预防和/或治疗感染性疾病的药物中的用途，

其中，

R₁选自以下组中：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、-C₁-C₆烷基苯基、-C₁-C₆烷氧基苯基、苯氧基、萘基、含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的单环或二环杂芳基、以及含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的5元或6元杂环基，所述烷基、烷氧基、苯氧基、萘基、苯基、杂芳基和杂环基各自任选地被选自羟基、氨基、羧基、硝基和C₁-C₆烷基的取代基取代；并且

R₂选自以下组中：H和C₁-C₆烷基。

在优选的实施方案中，本发明通式I的化合物的R₁选自以下组中：

和

在优选的实施方案中，R₂选自以下组中：H和-CH₃。

在优选的实施方案中，R₁为含有1个独立地选自N、O或S的杂原子的二环杂芳基，例如吲哚基(如，1H-吲哚基)或异吲哚基；并且R₂为H或C₁-C₆烷基。

在优选的实施方案中，R₁为-C₁-C₆烷氧基苯基，例如苄氧基；并且R₂为H或C₁-C₆烷基。

在优选的实施方案中，R₁为C₁-C₆烷氧基，例如丁氧基(如，叔丁氧基)；并且R₂为H或C₁-C₆烷基。

在一优选实施方案中，所述通式I的化合物为(R)-2-((S)-2-(1H-吲哚-2-甲酰胺)-4-巯基丁酰胺)-3-苯基丙酸。

在另一优选实施方案中，所述通式I的化合物为(R)-2-((S)-2-((苄氧基)羰基)氨基)丁酰胺-4-巯基)-3-苯基丙酸。

在另一优选实施方案中，所述通式I的化合物为(R)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基氨基)-4-巯基丁酰胺)-3-苯丙酸甲酯。

在另一实施方案中，所述感染性疾病由表达NDM-1的病原体如细菌引起。

在第二方面，本发明涉及通式I的化合物或其药学可接受的盐在制备用作NDM-1抑制剂的药物中的用途，

其中，

R₁选自以下组中：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、-C₁-C₆烷基苯基、-C₁-C₆烷氧基苯基、苯氧基、萘基、含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的单环或二环杂芳基、以及含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的5元或6元杂环基，所述烷基、烷氧基、苯氧基、萘基、苯基、杂芳基和杂环基各自任选地被选自羟基、氨基、羧基、硝基和C₁-C₆烷基的取代基取代；并且

R₂选自以下组中：H和C₁-C₆烷基。

在优选的实施方案中，本发明通式I的化合物的R₁选自以下组中：

和

在优选的实施方案中，R₂选自以下组中：H和-CH₃。

在优选的实施方案中，R₁为含有1个独立地选自N、O或S的杂原子的二环杂芳基，例如吲哚基(如，1H-吲哚基)或异吲哚基；并且R₂为H或C₁-C₆烷基。

在优选的实施方案中，R₁为-C₁-C₆烷氧基苯基，例如苄氧基；并且R₂为H或C₁-C₆烷基。

在优选的实施方案中，R₁为C₁-C₆烷氧基，例如丁氧基(如，叔丁氧基)；并且R₂为H或C₁-C₆烷基。

在一优选实施方案中，所述通式I的化合物为(R)-2-((S)-2-(1H-吲哚-2-甲酰胺)-4-巯基丁酰胺)-3-苯基丙酸。

在另一优选实施方案中，所述通式I的化合物为(R)-2-((S)-2-((苄氧基)羰基)氨基)丁酰胺-4-巯基)-3-苯基丙酸。

在另一优选实施方案中，所述通式I的化合物为(R)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基氨基)-4-巯基丁酰胺)-3-苯丙酸甲酯。

在第三方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的通式I的化合物和/或其药学可接受的盐，和/或本发明的抑制剂作为活性成分，以及和药学可接受的赋形剂。

在第四方面，本发明涉及一种预防和/或治疗预防和/或治疗感染性疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体给予本发明的通式I的化合物或其药学可接受的盐、本发明的NDM-1抑制剂或本发明的药物组合物。在一实施方案中，所述感染性疾病由表达NDM-1的病原体如细菌引起。

附图说明

图1为(R)-2-((S)-2-(1H-吲哚-2-甲酰胺)-4-巯基丁酰胺)-3-苯基丙酸抑制NDM-1的IC₅₀曲线图。

图2为(R)-2-((S)-2-((苄氧基)羰基)氨基)丁酰胺-4-巯基)-3-苯基丙酸抑制NDM-1的IC₅₀曲线图。

图3为(R)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基氨基)-4-巯基丁酰胺)-3-苯丙酸甲酯抑制NDM-1的IC₅₀曲线图。

具体实施方式

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，当提及的术语和短语如有与公知含义不一致时，以本文中所列的含义为准。本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。

本文所用的缩略语及其含义如下所示：

NDM-1      新德里金属β-内酰胺酶-1

HEPES      4-羟乙基哌嗪乙磺酸

DMSO       二甲基亚砜

ddH₂O      双蒸水

EP管       Eppendorf微量离心管

BSA        小牛血清蛋白

IC₅₀       半数抑制浓度

除非另外指明，本发明中所用的比例、百分比或浓度均为重量比或基于重量比。

本文所用的术语“C₁-C₆烷基”指具有1-6个(包括1、2、3、4、5或6个)、优选1-4个碳原子(C₁-C₄烷基)、更优选1-3个碳原子(C₁-C₃烷基)碳原子的直链或支化的饱和烷基，其实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基等。所述“C₁-C₆烷基”可以任选地被选自羟基、氨基、羧基、硝基和C₁-C₆烷基的取代基取代。

本文所用的术语“C₁-C₆烷氧基”指“C₁-C₆烷基-O-”基团，其通过氧原子连接至分子的其他部分，并且其中“C₁-C₆烷基”如上文所述。其实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、己氧基等。所述“C₁-C₆烷氧基”可以任选地被选自羟基、氨基、羧基、硝基和C₁-C₆烷基的取代基取代。

本文所用的术语“-C₁-C₆烷氧基苯基”指与苯环连接的上文所述的“C₁-C₆烷氧基”，并且通过所述烷氧基部分(经由-O-)连接至分子的其他部分。其实例包括但不限于苄氧基、苯乙基氧基等。所述“-C₁-C₆烷氧基苯基”可以任选地被选自羟基、氨基、羧基、硝基和C₁-C₆烷基的取代基取代，所述取代基可以位于其中的“C₁-C₆烷氧基”上，也可以位于“苯基”上。

本文所用的术语“-C₁-C₆烷基苯基”指与苯环连接的上文所述的“C₁-C₆烷基”，并且通过所述烷基部分连接至分子的其他部分。其实例包括但不限于苯甲基和苯乙基等。所述“-C₁-C₆烷基苯基”可以任选地被选自羟基、氨基、羧基、硝基和C₁-C₆烷基的取代基取代，所述取代基可以位于其中的“C₁-C₆烷基”上，也可以位于“苯基”上。

本文所用的术语“杂芳基”指包含5-14个环原子、优选5-10个(例如5、6、7、8、9、10个)环原子的单环或双环芳香基团，其包含1、2或3个选自O、S和N的杂原子。其实例包括但不限于吡啶基、咪唑基、苯基吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噁二唑基、噻二唑基、吲唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吲哚基(如1H-吲哚基、异吲哚基)、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、吡咯基、嘌呤基、咔唑基、吖啶基、嘧啶基和吡唑基等，并包括这些基团的所有异构形式。所述“杂芳基”可以任选地被选自羟基、氨基、羧基、硝基和C₁-C₆烷基的取代基取代。

本文所用的术语“杂环基”指包含5个或6个环原子的非芳香杂环基团，其可以包含1、2或3个、优选1或2个选自N、O、S的杂原子。所述“杂环基”可以任选地被选自羟基、氨基、羧基、硝基和C₁-C₆烷基的取代基取代。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指保持化合物的生物学有效性和性质的盐，且其不是生物学或其它方面上不利的。药学上可接受的酸加成盐可以通过无机酸和有机酸来形成。可以衍生得到盐的无机酸包括如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生得到盐的有机酸包括如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。药学上可接受的碱加成盐可以通过无机和有机碱来形成。可以衍生得到盐的无机碱包括如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝的氢氧化物等。可以衍生得到盐的有机碱包括如伯、仲和叔胺、取代的胺(其包括天然存在的取代的胺)、环胺等，如异丙基胺、三甲基胺、二乙基胺、三乙基胺、三丙基胺和乙醇胺等。

本文所用的术语“药学可接受的赋形剂”涵盖各种药学可接受辅料，如填充剂、崩解剂、粘合剂、润湿剂、润滑剂、助流剂、致孔剂、骨架材料和包衣剂等。

本文所用的术语“任选(地)”指可以存在或不存在。例如，当指某基团可以任选地被取代时，其可以是未取代的，也可以被指定的取代基以任何合适的方式取代。

活性测试方法

本发明的活性测试方法以亚胺培南一水合物(Imipenem monohydrate)作为NDM-1的底物进行活性检测。

底物亚胺培南一水合物的母核部分具有O=C-N-C=C共轭结构，从而可以产生紫外吸收。由于NDM-1可以水解β-内酰胺环酰胺键，因此NDM-1与底物反应时可以水解底物的酰胺键，从而破坏共轭结构，使紫外吸收减弱或消失。通过对比NDM-1与底物反应前后的全波长扫描紫外吸收光谱图，发现底物在300nm处有最强紫外吸收。如果化合物对NDM-1具有抑制作用，其会阻止NDM-1对底物的水解，从而导致底物的紫外吸收值降低减慢。

本发明的活性测试方法包括以下6个步骤：

步骤1：NDM-1底物储备液的制备

将亚胺培南一水合物(购自Sigma公司)溶于50mM HEPES(购自BioBasic公司)，配制成10mM的底物储备液备用。

步骤2：化合物的处理

将化合物溶于95%DMSO+5%ddH₂O，配制成100mM浓度的溶液，然后将配制好的化合物溶液放置在1.5mL EP管中，于4℃下保存备用。

步骤3：NDM-1蛋白缓冲液的配制

将NDM-1(由本实验室MDC蛋白纯化组提供，制备方法参见Yu Guo,Jing Wang等，A structural view of the antibiotic degradation enzyme NDM-1form a superbug.Protein&Cell,2011,2(5):384-394)溶于蛋白缓冲液(pH=6.8，含有50mM HEPES、5μM ZnCl₂(购于BioBasic公司)、10μg/mLBSA(购自上海生工工程有限公司))，配制成50nM的NDM-1蛋白缓冲液。步骤4：NDM-1药筛酶活体系的建立

NDM-1药筛酶活体系中包含的成分见表1。

表1NDM-1的药筛酶活体系

体系体积浓度NDM-1100μL50nM底物50μL600μM化合物2μL100mM总计152μL

在检测体系的阴性对照体系中加入2μL95%DMSO代替化合物，用于检测NDM-1的活性。

步骤5：化合物的初步筛选

向96微孔板中的每孔中加入100μL50nM的NDM-1蛋白缓冲液。然后向每孔中加入2μL100mM的相应化合物溶液。振荡，室温下孵育1分钟后，向每孔加入50μL600μM的底物进行反应。每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪(Varioskan Flash,Thermo scientific)检测一次，共测20次。

绘制曲线：取阴性对照曲线斜率的最大处值为V₀，化合物曲线斜率的最大处值为Vi，则NDM-1的剩余活性分数=Vi/V₀。剩余活性越低，表示化合物对NDM-1的活性抑制越强。当NDM-1的剩余活性分数在0.2以内时，将进一步测定该化合物的IC₅₀值。

步骤6：化合物的IC₅₀值的测定

将原始浓度为100mM的化合物溶液用95%DMSO按1:2(体积比)的比例进行等比稀释，共稀释11个浓度梯度。最终浓度依次为1316、658、329、164.5、82.2、41.1、20.6、10.3、5.1、2.6和1.3μM。接着进行化合物的IC₅₀值检测，向96微孔板中的每孔中加入100μL50nM的NDM-1蛋白缓冲液。然后向每孔中加入2μL如上配制11个浓度的各化合物溶液。振荡，室温下孵育1分钟后，向每孔加入50μL600μM的底物进行反应。每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪(Varioskan Flash,Thermo scientific)检测一次，共测20次。然后以化合物浓度对数为横坐标，NDM-1的剩余活性为纵坐标绘制曲线。根据曲线，采用GraphPad Prism version5.0软件计算IC₅₀值。

实施例1：(R)-2-((S)-2-(1H-吲哚-2-甲酰胺)-4-巯基丁酰胺)-3-苯基丙酸抑制NDM-1活性的测定

将上述结构表示的(R)-2-((S)-2-(1H-吲哚-2-甲酰胺)-4-巯基丁酰胺)-3-苯基丙酸(3mg，得自于天津国际生物医药联合研究院)溶于95%DMSO(70.6μL)，配制成50mM的溶液，然后将该溶液放置在1.5mL EP管中，于4℃下保存。

然后按照上面活性测试方法步骤5(化合物的初步筛选)和步骤6(化合物的IC₅₀值的测定)中所述的内容进行操作。以化合物的浓度对数为横坐标，NDM-1的剩余活性为纵坐标绘制曲线(见图1)，根据曲线，采用GraphPadPrism version5.0软件计算，得到的IC₅₀值为262.50±4.12μM。

实施例2：(R)-2-((S)-2-((苄氧基)羰基)氨基)丁酰胺-4-巯基)-3-苯基丙酸抑制NDM-1活性的测定

将上述结构表示的(R)-2-((S)-2-((苄氧基)羰基)氨基)丁酰胺-4-巯基)-3-苯基丙酸(3mg，得自于天津国际生物医药联合研究院)溶于95%DMSO(72.1μL)，配制成100mM浓度的溶液，然后将该溶液放置在1.5mL EP管中，于4℃下保存。

然后按照上面活性测试方法步骤5(化合物的初步筛选)和步骤6(化合物的IC₅₀值的测定)中所述的内容进行操作。以化合物的浓度对数为横坐标，NDM-1的剩余活性为纵坐标绘制曲线(见图2)。根据该曲线，采用GraphPadPrism version5.0软件计算，得到的IC₅₀值为126.50±9.57μM。

实施例3：(R)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基氨基)-4-巯基丁酰胺)-3-苯丙酸甲酯抑制NDM-1活性的测定

将上述结构表示的(R)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基氨基)-4-巯基丁酰胺)-3-苯丙酸甲酯(3mg，得自于天津国际生物医药联合研究院)溶于95%DMSO(75.7μL)，配制成100mM浓度的溶液，然后将该溶液放置在1.5mL EP管中，于4℃下保存。

然后按照上面活性测试方法步骤5(化合物的初步筛选)和步骤6(化合物的IC₅₀值的测定)中所述的内容进行操作。以化合物的浓度对数为横坐标，NDM-1的剩余活性为纵坐标绘制曲线(见图3)。根据该曲线，采用GraphPadPrism version5.0软件计算，得到的IC₅₀值为9.14±0.86μM。

以上实验证实，本发明通式I的化合物对NDM-1具有显著抑制活性，从而可以减少甚至消除NDM-1对底物的水解，因此可以用于抑制NDM-1，并且可以用于预防和/或治疗由表达NDM-1的病原体如细菌引起的感染性疾病。

此外，本领域普通技术人员应当理解，将本发明化合物与其他抗生素药物联合应用，可以进一步地可以提高抗生素疗效，从而治疗由NDM-1引起的多药耐药细菌感染。

上文描述了本发明的一些优选实施方案。应该理解，尽管本文为了说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，但在不背离本发明精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，本发明只受所附权利要求书的限制。可以根据本公开进行和执行本文公开和要求保护的所有实施方案而无需进行过度的实验。

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