RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白在制备进行肝细胞癌预后或辅助性TACE预后的试剂中的应用

摘要

本发明涉及RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白(RMP)在制备进行肝细胞癌预后或辅助性TACE预后的试剂中的应用。首次揭示了肝细胞癌中RMP高表达预示肝癌切除手术后预后较不理想；同时，其高表达预示术后辅助性TACE具有有效性。因此，本发明建立了一种基于RMP的肝细胞癌的术后预后方法。

说明书

技术领域

本发明属于医学生物工程技术领域；具体的说，本发明涉及RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白(RMP)用于评估原发性肝细胞癌术后预后不良及辅助性TACE疗效的标记应用。 

背景技术

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，中国是原发性肝癌的高发地区，每年约有全球一半的新发病例发生在中国。肝细胞癌(HepatoCellular Carcinoma，HCC)是原发性肝癌中常见的病理类型，所占比例约为70-85%。目前手术切除是原发性肝癌治疗的首选治疗方式。但是原发性肝癌手术切除后的高复发率仍然是导致肝癌患者预后不佳的主要因素。肝癌术后辅助性经导管动脉化疗栓塞(Adjuvant transcatheter arterial chemoembolization，Adjuvant TACE)是临床上常用的预防肝癌手术切除术后的复发的方法之一。但因为其可能影响术后残余肝脏的功能，所以其疗效尚存争议。目前临床上认为存在肝癌复发高危因素的患者(例如，肿瘤直径大于5厘米，有门静脉癌栓形成等)应该接受辅助性TACE，并且可以获益。但是这种分类方法存在一定弊端，有一些患者可能存在肝癌术后复发的危险因素，但是尚未达到应用辅助性TACE的标准，就可能造成遗漏。因此需要更加细致的分子分型，来建立多种指标联合预测的体系，来弥补单一指标的不足(Wang Z，Li Z，Ji Y.Postoperative transcatheter arterial chemoembolization should be recommended in the hepatocellular carcinoma treatment guidelines of the American Association for the Study of Liver Diseases.Hepatology2011;54:1489-149)。 

RMP(RPB5-mediating protein)是RNA聚合酶II(RNA polymerase II，RNAP II)第5亚基的调节蛋白，又名C19orf2或URI。最早由Cheong等采用Far-Western印迹方法，以³²P标记的重组人RPB5探针从肝癌细胞株cDNA文库中筛查得到。已有研究表明，RMP是一个重要的转录调节因子，参与多种基 因的转录调节，并且在卵巢癌(Theurillat JP，Metzler SC，et al.URI is an oncogene amplified in ovarian cancer cells and is required for their survival.Cancer Cell2011；19:317-332)等癌组织中呈现明显的高表达。 

然而，本领域目前不清楚RMP与肝癌术后辅助性TACE的相关性。 

发明内容

本发明的目的在于提供RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白在制备肝细胞癌预后评估或辅助性TACE预后评估的试剂中的应用。 

在本发明的第一方面，提供RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白的用途，用于制备进行肝细胞癌术后预后评估或进行术后辅助性经导管动脉化疗栓塞疗效(预后)评估的诊断试剂。 

在本发明的另一方面，提供一种用于进行肝细胞癌术后预后评估或进行术后辅助性经导管动脉化疗栓塞疗效评估的试剂盒，所述试剂盒中包括：特异性检测RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白表达水平的试剂。 

在一个优选例中，所述的试剂盒中，所述的特异性检测RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白表达水平的试剂是抗RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白的抗体。 

在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的抗体是多克隆抗体。 

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：携带有可检测信号分子的检测抗体(二抗)。 

在另一优选例中，所述的可检测信号分子选自(但不限于)：生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。 

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：免疫组化试剂。 

在另一优选例中，所述的免疫组化试剂包括：显色试剂，二甲苯，乙醇，H₂O₂甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂。 

在本发明的另一方面，提供特异性检测RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白表达水平的试剂的用途，用于制备进行肝细胞癌术后预后评估或进行术后辅助性经导管动脉化疗栓塞疗效评估的试剂盒。 

在一个优选例中，所述的特异性检测RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白表达水平的试剂是抗RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白的抗体。 

在本发明的另一方面，提供一种进行肝细胞癌术后预后评估的方法，所述方法包括： 

(1)应用所述的试剂盒检测受试者离体肝癌组织中测RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白表达水平； 

(2)分析蛋白表达水平； 

若测RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白表达水平高表达，则该受试者预后不理想。 

在本发明的另一方面，提供一种进行术后辅助性经导管动脉化疗栓塞疗效评估的方法，所述方法包括： 

(1)应用所述的试剂盒检测受试者离体肝癌组织中测RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白表达水平； 

(2)分析蛋白表达水平； 

若测RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白表达水平高表达，则该受试者适合进行术后辅助性经导管动脉化疗栓塞。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1、肝癌临床样本中RMP免疫组化结果对比图。 

图1A是利用免疫组化方法，检测在肝癌临床样本(278例)中癌旁组织，癌组织及门静脉癌栓(20例)中RMP的表达情况。 

图1B是各组样本中免疫组化评分情况。 

图2、RMP与肝癌术后生存期的关系。图为根据免疫组化评分结果，肝癌组织中高低表达RMP患者的手术切除后生存曲线。 

图3、RMP可以判断肝癌术后辅助性TACE的疗效。 

其中图3A在RMP高表达的患者中肝癌术后辅助性TACE的疗效；图3B是在RMP低表达的患者中肝癌术后辅助性TACE的疗效。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现肝细胞癌中RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白(RMP)高表达预示肝癌切除手术后预后较不理想；同时，其高表达预示术后辅助性TACE具有有效性。在此基础上，本发明建立了一种基于RMP的肝细胞癌的术后预后方法。 

本发明的首要目的在于提供一种RMP可以用于评估原发性肝细胞癌术后预后不良及辅助性TACE疗效的标记，以解决目前对肝细胞癌的生物学诊断和术后辅助性TACE疗效缺少合适的生物学标记的问题。 

作为本发明的优选方式，建立一种检测试剂盒，所述的试剂盒中含有特异性检测RMP表达水平的试剂。 

作为本发明的优选方式，所述的特异性检测RMP表达水平的试剂是抗RMP的抗体。 

制备抗体的技术是本领域中众所周知的。本发明的抗体可以是对RMP具有特异性的单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。所述单克隆抗体可以利用RMP蛋白或蛋白片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。 

本发明的抗体也可以是对RMP蛋白具有特异性的多克隆抗体。所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的RMP蛋白导入动物中来获得，例如，将RMP蛋白与弗氏佐剂按照适当比例(如1:1)混合后免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、牛等。也可以是商品化的抗体，例如所述的多克隆抗体是Proteintech的产品。 

在获得了特异性检测RMP蛋白表达水平的试剂后，可以方便地制备出用于 特异性检测RMP蛋白的检测试剂盒。所述试剂盒中除了含有所述抗体以外，还可以包含：携带有可检测信号分子的检测抗体(用于与抗RMP抗体结合)，以及疫组化试剂。所述的免疫组化试剂包括但不限于：显色试剂，二甲苯，乙醇，H₂O₂甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂等。 

如本文所用，所述的“可检测信号分子”是指用于确定待检测样品中RMP蛋白的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的特异性抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种可检测信号分子。例如，可检测信号分子可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。 

当采用如上所示的一些酶作为可检测信号分子时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导可检测信号分子的存在情况或者存在量。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的可检测信号分子的种类和特性，选择适宜的底物。 

基于本发明的新发现，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中RMP蛋白的表达量，这些方法均被包含在本发明中。在一个实施例中，所述方法包括步骤：通过免疫组化检测切除的肝细胞癌患者术后石蜡包埋的肝癌及癌旁正常肝组织中RMP表达水平并对染色结果评分，根据其免疫组化评分结果，判断该患者预后及肝切除术后辅助性TACE的疗效，指导肝癌患者术后的个体化治疗。 

综上，根据RMP的表达水平，对肝癌患者预后进行评估。本发明首次提出利用RMP的表达水平进行检测并预测肝细胞癌手术后复发转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1、RMP在肝癌组织样品中的表达 

在东方肝胆外科医院选取278例肝细胞癌手术切除样本和20例门静脉癌栓样本。278例样本的特征参数如表1所示。 

表1、试验组患者的特征参数 

使用多克隆兔源RMP抗体(1:75，Proteintech)，利用免疫组织化学方法检测组织中RMP蛋白表达水平。免疫组织化学方法包括步骤通过免疫组织化学方法检测原发性肝细胞癌患者手术切除术后石蜡包埋的肝细胞癌及癌旁正常肝组织中RMP的表达水平。抗原修复2分钟，一抗使用多克隆兔源RMP抗体1:75，proteintech，4℃孵育过夜，以正常兔源IgG抗体1：75作为阴性对照；生物素标记的二抗37℃孵育1小时，DAB显色。 

获得的结果依据IRS评分系统进行免疫组化评分。 

结果显示，癌旁组织，癌组织及门静脉癌栓(20例)中RMP的表达情况代表性的免疫组化图如图1A。临床样本中，在癌旁组织中RMP多数呈现低表达，而肝癌组织样品中RMP表达水平较高，在门静脉癌栓中多数呈高表达状态。 

因此，RMP抗体可以用于肝细胞癌的病例免疫组化检测，并且可以区分肝癌细胞的恶性程度，具有良好的特异性和敏感性。 

根据前述免疫组化方法获得组织中RMP蛋白表达水平，进行IRS评分，方法如下：在所有标本的每张切片随机选择五个视野，每个视野计数100个细胞；根据计数细胞的百分比，RMP的表达被划分4个等级：1分为1-25%，2分为26-50%，3分为51-75%，4分为76%以上；再根据细胞着色的强度RMP的表达划分为4个等级：0分为无着色，1分为浅黄色颗粒，2分为黄褐色颗粒，3分为深褐色颗粒。每张切片对应一个百分比分数和着色分数，两者相加即为该切片的最后得分(组织芯片只进行强度评分)(Wang Q，Tan YX，Ren YB，et al.Zinc finger protein ZBTB20expression is increased in hepatocellular carcinoma and associated with poor prognosis.BMC Cancer2011;11:271.)。 

结果如图1B所示。 

实施例2、Kaplan-Meier方法比较RMP高低表达术后生存时间 

根据IRS评分，将样本分成RMP高表达组和低表达组(根据免疫组化着色强度评分，0，1分定义为低表达；2，3分定义为高表达)，如表2。 

表2、试验组中RMP蛋白表达和临床病理特性的相关性(n=278) 

表2中P值表示，RMP的表达水平与性别明显相关，RMP的表达水平与静脉侵犯明显相关，RMP的表达水平与肿瘤大小明显相关，RMP的表达水平与BCLC分期明显相关，RMP的表达水平与TNM分期明显相关。具体来说就是，RMP在男性患者中表达水平更高；RMP表达水平越高，患者静脉侵犯概率越高；RMP表达水平越高，肿瘤直径越大；RMP表达越高，BCLC分期越高；RMP表达越高，TNM分期越高。 

应用SPSS18.0分析软件，绘制生存曲线，结果如图2。 

结果显示，肝癌组织中高表达RMP的患者术后生存时间明显短于低表达RMP的患者，如图2。 

由图2可见，肝癌组织中RMP的表达水平与原发性肝癌术后生存期明显相关。根据免疫组化打分结果显示，高表达RMP组患者预后明显较差，低表达RMP组患者预后明显较好。 

上述结果进一步提示，RMP的高表达与肿瘤的生物学行为相关。 

实施例3、不同的RMP表达水平可以判断术后辅助性TACE的疗效 

在实施例2的患者中，收集术后实施辅助性TACE的情况，依据RMP免疫组化评分进行分层，应用SPSS18.0分析软件绘制预后生存曲线，结果如图3A-B。 

结果显示，在高表达RMP的这部分患者中，术后辅助性TACE可以明显的延长患者生存时间，疗效明显好于对照组患者的疗效；而在低表达RMP的患者中，术后辅助性TACE并不能改善患者预后。 

实施例4、检测试剂盒的临床应用 

获得5位临床肝细胞癌患者的术后肝癌组织，如实施例1的方法制备免疫组化切片，进行免疫组化检测，并对检测结果进行评分。将切片的着色强度评分与着色范围评分相加，小于4分认为RMP低表达；大于或等于4分认为RMP高表达。 

结合RMP表达水平，去预测患者的预后。结果如下： 

2位患者RMP低表达，认为肝细胞癌术后预后较好；但需定期回访检查，必要时进行治疗。 

3位患者RMP高表达，认为肝细胞癌术后预后不理想，建议后续进行积极检查和治疗；同时，认为适合接受辅助性TACE。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。