克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一酶联免疫法及专用试剂盒与试剂盒的检测法

摘要

本发明公开了克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇一次性检测的酶联免疫检测方法，在酶标板上预包被上单克隆抗体，待检测样品中的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺和酶标抗原竞争结合包被的单克隆抗体后，用显色剂显色，待检测样品中的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇含量与待检测样品的百分吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出待检测样品中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺含量，专用于前述检测方法的检测试剂盒，包括酶标板、标准品溶液、浓缩酶标记物、酶标记物稀释液、显色液、浓缩洗液、终止液。本发明运用直接竞争酶联免疫技术，同时对三种瘦肉精即盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇做一次性分析检测，使用简便，特异性高，检测范围为0.1ng/mL-2μg/mL。

说明书

技术领域

本发明涉及β兴奋剂检测技术领域，具体来说是一种克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇一次性检测的酶联免疫法及其专用检测试剂盒与试剂盒的检测方法。 

背景技术

随着人们的生活水平的不断提高，人们开始对自己的身体健康也越来越关注，在日常生活中，人们会经常烹食肉类食品，来增强自身的免疫性和补充营养，但在烹食肉类食品时，人们往往会担心一个问题——“肉类食品中是否含有β兴奋剂(瘦肉精)”，β兴奋剂是一种能够促进瘦肉生长的药物添加剂，例如盐酸克伦特罗即盐酸盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。其能使猪提高生长速度，增加瘦肉率，且可使猪毛色红润光亮，卖相好；屠宰后，肉色鲜红，脂肪层极薄，往往是皮贴着瘦肉，瘦肉丰满，但对人体会产生副作用，轻则导致心律不整，严重一点就会导致心脏病。 

目前检测β兴奋剂主要有方法有色谱技术和免疫分析技术等方法。 

色谱法包括高效液相色谱法和气质联用色谱法。高效液相色谱(HPLC)法的优点是检测精密度高，假阳性率低，但存在样品处理时间长、检测过程繁琐、仪器昂贵、难于操作等缺点，在实际应用中受到一定的限制。而气质联用法(GC-MS)检测前需要对分子上的羟基、氨基等极性基团衍生化，难以作为常规方法应用，不能进行现场检测。 

免疫分析技术包括放射性免疫分析技术、金标免疫分析和酶免疫分析技术技术等。放射性免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、准确、快速、操作简便、易于标准化等优点，但其所用仪器昂贵，且使用的放射性同位素存在辐射和污染，其废弃物不易处理，限制了此种方法的广泛应用；金标免疫分析技术能对大量样品进行筛选，但其假阳性率较高，检测灵敏度欠缺，稳定性不足，无法提供准确的结果。 

发明内容

本发明的目的是提供一种克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇一次性检测的酶联免疫法及 其专用检测试剂盒与试剂盒的检测方法，以克服目前现有技术存在的上述不足，灵敏度高、稳定性好，准确可靠，大大简化操作步骤和反应时间，且降低成本，适合大量样品的筛查。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 

一种克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇一次性检测的酶联免疫检测方法，其特征在于：在酶标板上预包被上单克隆抗体，待检测样品中的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，还有酶标抗原一起竞争结合包被的单克隆抗体后，用显色剂显色，待检测样品中的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇含量与待检测样品的百分吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出待检测样品中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺含量，所述标准曲线是以克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品浓度百分吸光度值为纵坐标，以克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品浓度的对数值为横坐标绘制而成，所述预包被的单克隆抗体能同时对克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇发生交叉反应，所述百分吸光度值按下式计算： 

其中B是标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；B0是第一个标准溶液的平均吸光度值。 

所述酶标抗原是通过辣根过氧化物酶HRP标记克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺而得到，所述待检测样品为待检猪尿、猪肝或血液血清的待检测样品，猪尿待检测样品若是清亮尿样，就直接测定，如尿样浑浊须过滤或离心直至清亮，暂不使用尿样待检测样品应冷冻保存，避免反复冻融采取，所述酶标抗原是通过辣根过氧化物酶HRP标记克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺而得到，所述血液血清待检测样品处理方法为：取血清，加入酶标记物稀释液稀释，震荡混合均匀即可。 

一种专用于前述检测方法的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：1)权利要求1所述的预包被上单克隆抗体的酶标板；2)权利要求1所述的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一标准品溶液；3)浓缩酶标记物；4)酶标记物稀释液；5)显色液；6)浓缩洗液；7)终止液；所述酶标记物是在低pH条件下直接氧化辣根过氧化物酶HRP，辣根过氧化物酶HRP经NaIO₄氧化后形成的醛化酶与克伦特罗、沙丁 胺醇、莱克多巴胺三种物质的抗原分子的氨基相连，形成斯夫氏碱，进一步用NaBH₄还原生成稳定物质。 

所述预包被的单克隆抗体由合成好的完全抗原免疫小鼠，经骨髓细胞融合，培养，筛选出分泌抗体的杂交细胞株，杂交细胞株进行克隆化得到。 

所述检测试剂盒的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇交叉反应率分别为：100％、80％、80％，所述检测试剂盒检测尿液和血清的回收率都为60～140％。 

所述检测试剂盒检测尿液和血清的灵敏度分别为0.1ppb、0.3ppb。 

所述检测试剂盒标准品的最低检测下限为0.1ppb，最高检测上限为2ppb，超出此浓度的待检测样品需经适量稀释后再进行检测。 

所述检测试剂盒具有如下特性： 

1)建立标准曲线：用试剂盒中的酶标板和标准品溶液做直接竞争ELISA(酶联免疫吸附测定)的标准曲线，以药物浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作图得到ELISA试剂盒的标准曲线，ELISA中文意思是酶联免疫吸附测定； 

2)批内和批间差异：取同一批产品，做平行的标准曲线，计算各个药物浓度的批内变异系数，取批间产品药物浓度为1μg/L做相应个数的平行实验，计算批间变异差异系数，做直接竞争ELISA，对同一批次的检测结果进行分析，得到的批内平均变异系数为4.88％，对不同批次的检测结果进行分析，得到的批间平均变异系数为6.96％，表明本研究方法重复性较好； 

3)取空白尿样，向其中添加不同浓度梯度的标准溶液，用试剂盒检测，计算其回收率，测定不同浓度的尿液，测得其回收率均在80％-120％之间，说明本试剂盒对待检测样品检测的结果比较准确； 

4)各种结构类似物的交叉反应率满足100％的克伦特罗交叉反应率、80％莱克多巴胺的交叉反应率、80％沙丁胺醇的交叉反应率，说明本试剂盒对待检测样品检测的特异性强。 

一种克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一的酶联免疫检测试剂盒的检测方法，其中酶标板制作成酶标板微孔条，包括以下步骤： 

1)使用前将所述试剂盒置于室温20-25℃平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀，取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的酶标板微孔条放入密封袋，保存于2-8℃不要冷冻； 

2)编号：将待检测样品和标准品对应酶标板微孔条上的微孔按序编号，每个待检测样品和标准品均需做2孔平行； 

3)往酶标板微孔条上的微孔中加入标准溶液或试样液50μl/孔，然后加入酶标记物100μl/孔，混匀后，用盖板膜封板，室温避光静置反应30min； 

4)倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体，加入250μl/孔稀释后洗液，将浓缩洗液用蒸馏水稀释10倍，15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板3次； 

5)显色：每孔加入显色剂100μl，轻轻振荡混匀，室温避光显色20min； 

6)测定：每孔加入终止液100μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值。 

所述试剂盒的检测方法，其检测结果判定： 

1)定性判定：用待检测样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出待检测样品所含克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇浓度范围，浓度为单位ng/ml； 

2、定量判定：以标准品百分吸光率为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，将待检测样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出待检测样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为待检测样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的实际浓度。 

本发明的有益效果为： 

1、采用直接竞争酶联免疫技术，特异性强，敏感性高，操作简单快速，检测结果可以定性定量判定，准确可靠，且成本低，投资少，便于对大量样本的筛选； 

2、能够同时对尿液、血液血清中的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇作一次性检测分析，比其他单一品种试剂盒更具优势； 

3、该检测试剂盒灵敏度高，达到0.1ppb，各检测成份的交叉率达到80％以上，线性范围为0.1ng/mL～2ng/mL； 

4、通过标准曲线对检测数据进行分析，能够提高该试剂盒的精密度和准确性。 

总之，本发明运用直接竞争酶联免疫技术，同时对三种瘦肉精即盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇做一次性分析检测，使用简便，特异性高，灵敏度高，稳定性好，大大简化了操作步骤和反应时间，且降低了成本，非常适合大量样品的筛查。 

附图说明

图1本发明专用于前述检测方法的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一的酶联免疫检测试剂盒之ELISA试剂盒的标准曲线。 

具体实施方式

本发明克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇一次性检测的酶联免疫检测方法，是在酶标板上预包被上单克隆抗体，待检测样品中的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，还有酶标抗原一起竞争结合包被的单克隆抗体后，用显色剂显色，待检测样品中的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇含量与待检测样品的百分吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出待检测样品中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺含量，所述标准曲线是以克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品浓度百分吸光度值为纵坐标，以克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品浓度的对数值为横坐标绘制而成，所述预包被的单克隆抗体能同时对克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇发生交叉反应，所述百分吸光度值按下式计算： 

其中B是标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；B0是第一个标准溶液的平均吸光度值。 

酶标抗原是通过辣根过氧化物酶HRP标记克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺而得到。其中对待检测样品的处理：尿样样品若是清亮尿样，就直接测定，如尿样浑浊须过滤或离心10min(15℃，4000r/min)直至清亮，暂不使用样本应冷冻保存，但避免反复冻融采取。血液血清样品处理方法为：取0.25mL血清，加入0.5mL酶标记物稀释液以1∶2稀释，震荡混合均匀后，取50μL加入到酶标板孔内进行检测分析。 

本发明专用于前述检测方法的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一的酶联免疫检测试剂盒，包括：1)前述的预包被上单克隆抗体的酶标板；2)前述的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一标准品溶液，克伦特罗即是盐酸克伦特罗；3)浓缩酶标记物；4)酶标记物稀释液；5)显色液；6)浓缩洗液；7)终止液。其中酶标记物是在低pH条件下直接氧化辣根过氧化物酶HRP，辣根过氧化物酶HRP经NaIO₄氧化后形成的醛化酶与克伦特罗、沙丁胺醇、莱克 多巴胺三种物质的抗原分子的氨基相连，形成斯夫氏碱，进一步用NaBH₄还原生成的稳定物质。 

其中预包被的单克隆抗体由合成好的完全抗原免疫BALB/C小鼠，经骨髓细胞融合，培养，筛选出分泌抗体的杂交细胞株，杂交细胞株进行三次克隆化得到。检测试剂盒的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇交叉反应率分别为100％、80％、80％。检测试剂盒检测尿液和血清的回收率都为60～140％。检测试剂盒检测尿液和血清的灵敏度分别为0.1ppb、0.3ppb。检测试剂盒标准品的最低检测下限为0.1ppb，此浓度的吸光值与阴性标准溶液(0ppb)的吸光值有明显的差异。最高检测上限为2ppb，超出此浓度的检品需经适量稀释后在进行检测。 

本发明检测试剂盒采用直接竞争酶联免疫技术，能同时对盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇(β兴奋剂)作一次性检测分析，检测操作时间不到60分钟。 

所述检测试剂盒具有如下特性： 

1)建立标准曲线：用试剂盒中的酶标板和标准品溶液做直接竞争ELISA的标准曲线，以药物浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作图得到ELISA试剂盒的标准曲线； 

2)批内和批间差异：取同一批产品，做平行的标准曲线，计算各个药物浓度的批内变异系数，取批间产品药物浓度为1μg/L做相应个数的平行实验，计算批间变异差异系数，做直接竞争ELISA，对同一批次的检测结果进行分析，得到的批内平均变异系数为4.88％，对不同批次的检测结果进行分析，得到的批间平均变异系数为6.96％，表明本研究方法重复性较好； 

3)取空白尿样，向其中添加不同浓度梯度的标准溶液，用试剂盒检测，计算其回收率，测定不同浓度的尿液，测得其回收率均在80％-120％之间，说明本试剂盒对待检测样品检测的结果比较准确； 

4)各种结构类似物的交叉反应率满足100％的克伦特罗交叉反应率、80％莱克多巴胺的交叉反应率、80％沙丁胺醇的交叉反应率，说明本试剂盒对待检测样品检测的特异性强。 

本发明克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三合一的酶联免疫检测试剂盒的检测方法，其中酶标板制作成酶标板微孔条，包括以下步骤且下述步骤中的各值是严格遵循的： 

1)使用前将所述试剂盒置于室温20-25℃平衡30min以上，注意每种液体 试剂使用前均须摇匀，取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的酶标板微孔条放入密封袋，保存于2-8℃不要冷冻； 

2)编号：将待检测样品和标准品对应酶标板微孔条上的微孔按序编号，每个待检测样品和标准品均需做2孔平行； 

3)往酶标板微孔条上的微孔中加入标准溶液或试样液50μl/孔，然后加入酶标记物100μl/孔，混匀后，用盖板膜封板，室温避光静置反应30min； 

4)倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体，加入250μl/孔稀释后洗液，将浓缩洗液用蒸馏水稀释10倍，15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板3次； 

5)显色：每孔加入显色剂100μl，轻轻振荡混匀，室温避光显色20min； 

6)测定：每孔加入终止液100μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值。 

前述试剂盒的检测方法，其检测结果判定： 

1)定性判定： 

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇(β兴奋剂)浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.892；0.1ppb为1.501；0.25ppb为1.175；0.5ppb为0.751；1ppb为0.421；2ppb为0.198。则样品1的浓度范围是1ppb-2ppb；样品2的浓度范围是0.25ppb-0.5ppb。(再乘以相应的稀释倍数) 

2)定量判定： 

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式见前述百分吸光度值计算式。 

以标准品百分吸光度值为纵坐标，以盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇(β兴奋剂)标准品浓度(ng/ml)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇(β兴奋剂)实际浓度。 

标准曲线建立：用试剂盒中的板条和试剂做直接竞争ELISA的标准曲线。以药物浓度的对数为横坐标，抑制率即百分吸光度值为纵坐标，作图。ELISA 试剂盒的标准曲线如图1所示，R²＝0.994，线性范围为0.1～2μg/L。 

批内和批间差异：取同一批产品，做6个平行的标准曲线，计算各个药物浓度的批内变异系数。取5批产品中的药物浓度为1μg/L的做5个平行实验，计算批间变异差异系数。 

做直接竞争ELISA，对同一批次的检测结果进行分析，如下批内和批间检测结果表所示，得到的批内平均变异系数为4.88％，对不同批次的检测结果进行分析，得到的批间平均变异系数为6.96％，表明本研究方法重复性较好。 

批内和批间检测结果表： 

精密度和准确度：取空白尿样，向其中添加不同浓度梯度的标准溶液，用试剂盒检测，计算其回收率。 

测定不同浓度的尿液，测得其回收率均在80％-120％之间，说明本试剂盒对样品检测的结果比较准确。 

特异性：各种结构类似物的交叉反应率如下表所示。 

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。 

下面更详细举例说明本发明检测试剂盒： 

检测试剂盒组份： 

酶联板：8孔/条，12条/板； 

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺(β兴奋剂)标准溶液(1ml/瓶)：0ppb、0.1ppb、0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb； 

150倍浓缩酶标记物0.15ml；酶标记物稀释液50ml；显色剂12ml；终止液13ml；10×浓缩洗液50ml； 

检测试剂盒技术指标： 

试剂盒灵敏度：0.1ppb 

样本检测下限：尿样0.1ppb；血液血清0.3ppb。 

交叉反应率：克伦特罗(Clenbuterol)100％；沙丁胺醇(Salbutamal)80％；莱克多巴胺(Ractopamine)80％。 

回收率：尿样100％±40％；血液血清100％±40％。 

所需仪器：微孔酶标仪、氮气吹干装置、打印机、均质器、振荡器、离心机、恒温箱、天平(感量0.01g)、刻度移液管、微量移液器(单道20μl-200μl、100μl-1000μl、多道250μl)。 

所需试剂：蒸馏水。 

试剂盒使用注意事项： 

1)用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃(至少回温40分钟)。 

2)用完后立即将所有试剂放回2-8℃冰箱。 

3)清洗液的配制：用蒸馏水将10×浓缩洗液以1∶9的比例稀释(即1mL10×浓缩洗液+9mL蒸馏水)。注：必须确定回温后使用，并检查是否完全溶解。 

4)酶标抗体的配制：用用蒸馏水将150倍浓缩酶标记物以1∶149的比例稀释(即0.1mL150倍浓缩酶标记物+14.9mL蒸馏水)注：稀释后请尽快使用，若保存于-20℃，保存期为7天。 

5)在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。 

6)所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。 

7)室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD值偏低。 

8)在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 

9)混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。 

10)反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 

11)不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。 

12)不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 

13)显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。 

样本处理前须知：1)实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头；2)实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。 

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。