摘要:目的:自体骨髓干细胞移植已经成为急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)治疗的新兴研究方向,但是在梗死后早期移植细胞,由于梗死所引发的炎性反应、凋亡、氧化应激以及缺血/再灌注等因素的打击使得移植细胞的存活率较低,这是影响移植效果的最重要因素之一。而近年来血运重建的进展使得大批患者在AMI早期即获得罪犯冠脉的开通,对于血运重建后心功能仍然较差的部分患者,是干细胞移植的适合人群,但如何改善其移植效果一直是困扰该领域研究的难题。有鉴于此,本研究将祖国传统方药通心络和干细胞移植联合起来,考察通心络的应用能否改善移植细胞在梗死心肌中的存活和促进其发挥效应。目的:本研究目的是探讨:(1)在AMI再灌注后,即刻经心肌内注射自体骨髓来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)能否获益;(2)在围移植期以小剂量通心络易化能否改善移植的MSCs在梗死心脏中的存活率和促进其生物学活性,并由此而产生有功能学意义的获益,另外探讨通心络改善干细胞的在体存活的机制。方法 本研究中,28头中华小型猪分成4组,分别为第1组(对照组,n=7)、第2组(单纯小剂量通心络组,n=7)、第3组(单纯MSCs移植组,n=7)和第四组(小剂量通心络易化+MSCs移植组,n=7)。每只动物均于常规麻醉和抗感染条件下在髂前上嵴抽取骨髓50~80ml,对移植组动物的骨髓进行分离培养,以Percoll(1.077g/ml)密度梯度离心法分离出骨髓单个核细胞,按2×10<'5>/cm<'2>将其接种于75cm<'2>培养瓶,以含10﹪胎牛血清的低糖DMEM培养,每3d换液,到第7~10d时原代MSCs达到80﹪密度即开始消化传代,等细胞数达到3×10<'7>时备用移植。移植前以DAPI(50μg/ml)标记培养的MSCs的细胞核,标记效率为100﹪。开胸手术后通过胶圈套扎冠状动脉左前降支,阻断其血流90min后再灌注造成急性心肌梗死模型,观察30min后进行移植操作。对照组于梗死区和梗死周边区心肌内注射500μl低糖DMEM培养基,第2组于梗死前第3d到梗死后第4d每天给以小剂量通心络(0.05g·kg<'-1>·d<'-1>)口服,第3组于梗死区和梗死周边区心肌内注射500μl细胞悬液(3×10<'7>细胞/动物),第4组于梗死前第3d到梗死后第4d每天给以小剂量通心络(0.05g·kg<'-1·d<'-1>)口服,并于梗死区和梗死周边心肌内注射500μl细胞悬液(3×10<'7>细胞/动物)。于移植后1周(基线)和移植后6周(终点),分别以核磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)和单光子发射电子计算机断层扫描(single photon emission computed tomography, SPECT)检测心功能和灌注缺损面积。6周后处死动物,在梗死区和梗死周边区取材进行组织学检测,以免疫荧光染色后在激光共聚焦显微镜下评价移植MSCs的在体存活和分化潜能。石蜡切片八因子染色于光镜下计数梗死区和梗死周边区毛细血管密度。TUNEL检测梗死周边区心肌凋亡,并测定梗死周边心肌的氧化应激水平。结果 考察终点时HE染色显示在第1,2和3组的动物心脏梗死区有严重纤维化和炎症细胞浸润,未见存活心肌细胞,而在第4组梗死区内纤维化显著减轻、且伴随部分存活心肌细胞。在第4组,梗死区内移植的MSCs存活能力显著高于第3组(308.9±88.2vs 73.2±21.3,P<0.01),成心肌分化效率也显著增强(5.8﹪±5.1﹪vs 8.7﹪±2.4﹪,P<0.01)。第1,2和3组之间在终点时,梗死区和梗死周边区的毛细血管密度无显著差异(梗死区1.8±0.5/HPF vs 2.0±0.6/HPF VS 1.8±0.8/HPF,P>0.05;梗死周边区4.9±1.3/HPF,5.1±0.9HPF,5.2±1.4/HPF,P>0.05),但均显著低于第4组(梗死区3.7±1.0/HPF,梗死周边区8.9±1.9/HPF,P<0.01)。在基线时,MRI各项指标和SPECT确定的灌注缺损面积在4组之间无显著差异(P>0.05);在考察终点时,第2和3组的各项心功能指标和对照组比较,未见显著差异(P>0.05);但第4组左室射血分数增加至50.0﹪±10.1﹪,运动障碍节段数减少至(4.9±1.8)个,室壁增厚率增加至35.9﹪±10.8﹪,左室质量指数和梗死面积均显著减小,和对照组有显著差异(P<0.05)。第2和3组的灌注缺损面积在终点时和对照组无显著差异(P=0.899),但第4组灌注缺损面积由基线时的47.8﹪±11.1﹪减小至终点时的22.1﹪±9.3﹪,和对照组有显著差异(P<0.01)。TUNEL方法检测表明通心络的应用现在抑制梗死周边区心肌的凋亡(P<0.01),并显著增加梗死周边心肌的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量和减轻脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量(P<0.05)。结论 本研究证实:(1)急性心肌梗死后即刻心肌内注射自体骨髓来源MSCs在体存活能力和成心肌分化潜能有限,并未产生功能学意义的获益;(2)在围移植期单独应用小剂量通心络并未产生临床可检测到的功能学获益,但在组织学水平显著抑制梗死心肌的凋亡和氧化应激水平,从而使得移植的MSCs在体存活能力和成心肌分化潜力均得到显著提高,进而显著改善心功能、并抑制左室重塑。