大鼠Smac基因的克隆及其在心肌细胞H9C2中的表达

摘要

目的:克隆大鼠促凋亡基因Smac,构建真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac,并在心肌细胞中表达.方法:应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠肾组织中扩增到大鼠Smac基因的CDs片段,构建含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac,并将此重组质粒、空载体pcDNA3.1+、pcDNA3.1+-EGFP通过脂质体介导转染大鼠心肌细胞H9C2,荧光显微镜、流式细胞术间接检测转染效率,RT-PCR法检测外源基因的表达.结果:经测序目的基因序列与GenBank(NM_001008292)公布的结果一致,所构建的重组质粒DcDNA3.1+-rSmac经PCR和酶切鉴定所释放的片段大小与预期结果相符.荧光显微镜和流式细胞术检测,细胞转染有效,转染效率达38.36%.转染重组载体pcDNA3.1+-rSmac 48h后,H9C2细胞Smac的mRNA水平明显升高.其中,对照组Smac/β-actin为1.19,空载体组Smac/β-actin为1.31,二者之间差异无显著性(P>0.05);转染pcDNA3.1+-rSmac组Smac/β-actin为1.67,与对照组比较差异具有显著性(P<0.01).结论:克隆大鼠Smac基因成功,成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac,并在转染后的心肌细胞中表达,为研究Smac基因在心肌细胞凋亡过程中的调控作用奠定基础.