SV40LTag基因诱导永生化大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定

摘要

目的:建立长期传代、形态和生物学特性稳定的永生化HSC.方法:采用Pronase E、Ⅳ型胶原酶原位灌流消化及Nycodenz密度梯度离心分离大鼠原代肝星状细胞(HSC),并进行免疫组化SABC法鉴定和培养.用Effectene(R) Ttansfection Reagent方法将携带SV40LTag基因的质粒PSV3neo(该质粒由意大利学者Giovanni Gaudino PhD惠赠)转染第1代HSC,以G418筛选直至获得阳性克隆细胞,经体外长期培养和传代后,以PCR方法检测其SV40LT抗原mRNA的表达,观察细胞形态学,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖能力,用免疫组化SABC法对α-SMA、SV40LTag、Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen Ⅰ、collagen Ⅲ)、desmin、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生的生长因子受体B型(PDGFRB)进行免疫细胞化学检测,用β-actin做半定量RT-PCR检测I型胶原的表达,对其生物学特性进行研究.结果:本研究通过使用质粒PSV3neo转染正常大鼠HSC,经20 d抗性筛选,获得G418阳性克隆细胞,长期传代后细胞形态和结构保持完好,SV40LTag mRNA的表达检测和免疫组化染色结果阳性,经扩大筛选培养,该HSC细胞系目前已传了50代,保持着星形外观的HSC形态学特征,生长曲线显示转染阳性细胞倍增速度快,MTT法测定570 nm波长下A值显著高于对照组(P＜0.01).半定量RT-PCR法检测collagen Ⅰ mRNA的表达明显高于对照组(P＜0.01).免疫组化染色显示能表达α-SMA、collagen Ⅰ、couagen Ⅲ、desmin、TGF-β1、PDGFRB.结论:利用SV40LTag基因序列诱导建立了永生化大鼠HSC系,新建HSC系在体外可长期传代,倍增速度快,其形态和生物学特性与原代HSC形态相似.