镰形扇头蜱抗凝血分子基因的克隆表达和产物活性分析

摘要

蜱是一类专性吸血的节肢动物，不仅是动物重要的外寄生虫，还是仅次于蚊子的人和动物疾病的第二传播媒介。与其它的吸血动物相比，蜱的吸血时间特别长，一般在10-14天才能达到饱血状态。在蜱吸血过程中，宿主会发生微血管收缩、血小板凝集和血液凝固等凝血反应。蜱通过唾液腺分泌抗凝血分子以克服宿主的凝血反应，达到成功吸血的目的。蜱源抗凝血分子的研究，不仅有助于了解蜱的吸血及病原传播的复杂机制，开拓蜱及蜱传疾病新型防治技术。而且在开发人类心血管疾病的新型生物制剂上具有潜在价值。 镰形扇头蜱是我国南方优势蜱种，我们以吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础，克隆出一个抗凝血分子编码基因C18。该基因全长580bp，编码164个氨基酸，预测分子量为18.04kDa(包括信号肽)。该蛋白分子在5’端有一个18个氨基酸构成的信号肽序列，并含有一个典型的抗凝血Kunitz功能域。经同源性比较该基因与组织通道抑制因子同源。用RT-PCR方法分析了C18在镰形扇头蜱吸血前后的表达情况，结果表明C18为蜱吸血后诱导表达。成功构建了重组表达载体pGEX-4T-1-C18，并转化到表达菌BL21中，经IPTG诱导，结果表明C18可以在原核表达系统中高效表达，应用GST融合蛋白纯化系统，可获得纯化的目的蛋白。通过血浆复钙时间试验和血浆部分凝血酶激活时间试验对重组蛋白的抗凝血活性经行检测，发现重组蛋白同时对内源性和外源性的凝血具有明显抑制作用。 同时以镰形扇头蜱吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础，应用RACE方法从镰形扇头蜱体内克隆出另一个抗凝血基因C201的全长序列，该基因全长693bp，开放阅读框编码195个氨基酸，预测分子量为22.62kDa，该蛋白分子在5’端有一个20个氨基酸构成的信号肽序列，并含有一个典型的抗凝血Kunitz-BPTI功能域。经同源性比较该基因与组织通道抑制因子II基因序列高度同源。 综上所述，本研究首次克隆了镰形扇头蜱C201抗凝血蛋白基因，为该基因的进一步研究打下了基础。首次克隆并表达了镰形扇头蜱C18抗凝血分子，分析它的表达特点，并对其抗凝活性进行了初步研究，为蜱抗凝血基因的进一步研究打下了良好基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章 蜱及蜱抗凝血分子的研究进展

1.1蜱类简介

1.2蜱抗凝血分子研究进展及应用前景

第二章 材料与方法

2.1材料与试剂

2.2镰形扇头蜱的实验室饲养

2.3镰形扇头蜱总RNA的提取及鉴定

2.4镰形扇头蜱C18、C201基因EST序列的获取

2.5镰形扇头蜱C201基因的克隆

2.6 RT-PCR分析C18基因的表达特点及分布情况

2.7镰形扇头蜱C18基因的克隆

2.8镰形扇头蜱抗凝血蛋白(C18)基因的原核表达

2.9融合蛋白的纯化

2.10 Western-blot分析蛋白质免疫原性

2.11 C18抗凝血活性的鉴定

第三章 结果与分析

3.1镰形扇头蜱的实验室饲养

3.2总RNA的提取

3.3 EST序列结果及序列分析

3.4目的基因5’端的克隆

3.5 C201全长基因的克隆结果及C201基因的分析

3.6 C18基因在蜱吸血前后的表达情况

3.7基因的原核表达

3.8重组蛋白浓度的测定

3.9 Western-blot分析

3.10 C18的活性鉴定

第四章 讨论

4.1镰形扇头蜱的实验室饲养

4.2 RNA提取及检测

4.3 RACE方法克隆C201基因

4.4 RT-PCR方法分析C18基因表达模式

4.5开发蜱源抗凝药物的探索

4.6抗凝血分子的活性实验

结论

参考文献

附录

致谢

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