犬瘟热病毒单克隆抗体的筛选与双抗体夹心ELISA的建立

摘要

犬瘟热（canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）引起的一种病毒性传染病，在全世界范围内广泛发生。其传统宿主主要包括大部分食肉目动物。CDV感染犬科、猫科、浣熊科、鼬科、小熊猫科、大熊猫科已被多次报道。 截至2013年年底，全国野生大熊猫种群数量达1864只，圈养大熊猫种群数量达到375只。2014年12月至2015年4月，陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心22只大熊猫中先后有6只CDV核酸检测阳性，并且5只抢救无效相继死亡。目前，RT-qPCR和胶体金试纸条是犬瘟热最常用的检测手段，但是RT-qPCR成本高、技术复杂、容易污染。而胶体金试纸条大多是针对感染犬的犬瘟热病毒，并没有针对犬瘟热的试纸条。因此，有必要建立一种敏感性强且特异性好的犬瘟热病毒检测技术，从而能够准确、快速地诊断感染大熊猫的犬瘟热病毒，对保护我国珍稀动物有着重大意义。本实验构建了犬瘟热病毒楼观台毒株F蛋白的原核表达质粒，表达了犬瘟热病毒融合蛋白胞外区，以此作为抗原，制备了针对犬瘟热病毒的单克隆抗体，然后用HRP标记单克隆抗体，建立了针对犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA方法。其结果如下： 1.犬瘟热病毒重组F蛋白的原核表达与纯化 参照犬瘟热病毒楼观台毒株F蛋白的基因序列，构建了包含犬瘟热病毒F蛋白胞外区的重组质粒，转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)，在37℃，1mmol的IPTG的条件下诱导6h，超声裂解大肠杆菌，然后经过Ni Resin亲和层析，通过SDS-PAGE与Western Blot分析，CDV-F蛋白成功表达，得到预期大小为40Kda蛋白，并且表达的CDV-F蛋白具有良好的反应原性，用经纯化的CDV-F蛋白免疫小鼠，通过采集小鼠血清进行间接ELISA分析，小鼠血清的抗体滴度达到10-5，说明原核表达的CDV-F蛋白具有良好的免疫原性。 2.单克隆抗体的制备、纯化与HRP标记 用纯化的CDV-F作为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用传统的细胞融合与亚克隆技术成功制备了三株单克隆抗体1A5，1A5和7D5，通过向腹腔注射杂交瘤细胞制备单克隆抗体，收集腹水通过Protein G亲和层析进行纯化，浓度分别为1.2mg/mL，1.2mg/mL，1.8mg/mL。然后用氧化还原法标记HRP，直接ELISA方法检测三株抗体的效价为1∶100000-1∶1000000。 3.犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立 首先利用犬瘟热病毒作为抗原，通过竞争ELISA对单克隆抗体抗原表位进行分析，结果显示，三株单克隆抗体均识别不同的表位，通过捕获抗体与检测抗体的确定，结果显示1A5作为捕获抗体，7D5-HRP作为检测抗体时检测病P/N值最高，非特异性反应最弱，然后通过棋盘滴定法确定了双抗体夹心ELISA方法的最佳反应条件，其中捕获抗体包被量为800ng/孔、HRP-7D5稀释比例为1∶100。 4.敏感性评价：用现有的商品化试纸条与双抗体夹心ELISA方法分别犬瘟热病毒感染的vero细胞的上清。结果显示，两种方法均能检测到logTCID50=1.8的病毒样本，上述结果说明，建立的双抗体夹心ELISA方法的敏感性与现有的商品化试纸条相同。 5.特异性评价：利用CPV（犬细小病毒）、ICHV（犬传染性肝炎病毒）、CPIV（犬副流感病毒）三种病毒感染细胞的上清来评价双抗体夹心ELISA方法的特异性。结果显示，CPV、ICHV、CPIV细胞培养的上清均不反生反应，因此本方法具有良好的特异性。 6.与商品化试纸条一致性评价：13份临床大熊血清与30份临床犬血清分别用商品化试纸条与建立的双抗体夹心ELISA方法检测，临床大熊猫血清中均没有检到犬瘟热病毒，临床犬血清两种方法均检到6份阳性，两种方法的一致性为100%，说明双抗体夹心ELISA方法与现有的商品试纸条一致性高。 综上所述，本课题建立了一种快速检测犬瘟热病毒的双抗体夹心ELISA方法，与商品化试纸条具有很高的一致性，可以用来检测犬瘟热病毒。

目录

声明

文献综述:第一章 文献综述

1.1 犬瘟热病毒的生物学特征

1.2 犬瘟热在我国的流行情况

1.3 犬瘟热病毒感染大熊猫

1.4 犬瘟热的检测、预防与治疗

1.5 本研究目的与意义

第二章 犬瘟热融合蛋白重组质粒构建与原核表达

2.1 材料

2.2实验步骤

2.3 实验结果及分析

2.4讨论

第三章 犬瘟热F蛋白单克隆抗体的制备、纯化与HRP标记

3.1 材料

3.2 方法

3.3 实验结果及分析

3.4 讨论

3.4 小结

第四章 双抗体夹心ELISA方法的建立

4.1 材料

4.2 方法

4.3实验结果

4.4 讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历