酶切富集AS-PCR法检测bcr/abl融合基因T315I点突变及临床应用

摘要

目的:
　　慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的克隆性骨髓增殖性肿瘤,90％以上患者可检测到特征性的Ph染色体及其分子标志bcr/abl融合基因,Ph染色体是由位于9q34的abl原癌基因断裂并易位到22q11的断裂点集簇区 bcr融合形成[1]。随着分子靶向治疗药物的广泛使用,bcr/abl融合基因的突变是导致治疗效果不佳的主要原因之一,且在疾病整个治疗与预后中起着重要的作用。研究发现,T315I基因突变是目前治疗CML耐药最难以克服的基因突变[2],国外报道bcr/ablT315I突变在CML患者中的发生率约占15%左右[3]。鉴于目前国内关于bcr/ablT315I突变的研究鲜见报道。因此,本研究拟通过建立一种可行的酶切富集等位基因特异性PCR(酶切富集AS-PCR)检测技术检测T315I基因突变,为CML的分子靶向治疗及后续研究提供理论依据。
　　方法:
　　1.设计包括突变位点在内的两对 PCR扩增引物,以健康人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,分别扩增出野生型abl基因第6号外显子片段和含有T315I突变的abl基因第6号外显子片段,并将其分别克隆至pSG5M-flag载体质粒中,构建含abl基因野生型及T315I突变型重组质粒标准品,并将所获重组质粒分别进行酶切及测序鉴定。
　　2.酶切富集AS-PCR方法的建立。设计一对野生型和突变型abl基因序列的通用引物,分别以野生型和突变型重组质粒作为模板,经PCR扩增出目的片段,将扩增出的片段进行酶切。另设计一对仅针对T315I突变的特异性引物,以酶切产物为模板,进行 AS-PCR检测,对反应体系及反应条件进行优化。分析该方法的灵敏度及特异性。
　　结果:
　　1.通过体外定点突变PCR法成功构建了野生型pSG5M-flag-abl(wild)和突变型pSG5M-flag-abl(T315I)的重组质粒标准品,且经酶切及测序鉴定与预期结果一致。
　　2.成功运用了酶切富集AS-PCR法检测bcr/abl基因T315I点突变,该方法的灵敏度为0.18%,实验至此并未出现假阳性,该方法特异性好。
　　结论:
　　1.成功构建了野生型 pSG5M-flag-abl(wild)和突变型 pSG5M-flag-abl(T315I)重组质粒。
　　2.建立了检测abl基因T315I突变的酶切富集AS-PCR方法,为临床检测该基因突变提供了一种灵敏度高、特异性好的方法。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

第3章 结果

3.1 获取野生型和含T315I点突变的abl基因片段

3.2 重组质粒酶切鉴定

3.3 重组质粒测序鉴定

3.4 重组质粒标准浓度的测定

3.5 PCR反应条件的优化

3.6 酶切反应条件的优化

3.7 酶切富集AS-PCR条件的优化

3.8 酶切富集AS-PCR方法的检测限分析

3.9 酶切富集AS-PCR法的灵敏度分析

3.10直接AS-PCR法检测T315I基因突变检测限分析

3.11 临床样本检测结果

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综 述

参考文献