BCR-ABL(Breakpoint Cluster Region-Abelson Leukemia Virus)融合基因激酶区T315I突变质粒的构建

摘要

目的：构建BCR-ABL融合基因激酶区T315I突变型和野生型质粒。
　　方法：在我院确诊的CML患者伊马替尼治疗后发生耐药,经基因测序证实存在T315I点突变。1.取患者血液标本后通过分离白细胞提取RNA;2.应用第一链cDNA合成试剂盒对RNA逆转录获得cDNA;3.针对T315I突变区域设计特定PCR引物,通过PCR反应大量扩增DNA;4、应用T4DNA连接酶将目标片段与pGEM-T质粒载体连接;5.应用细菌转化技术将目标转入JM109感受态大肠杆菌,在含氨苄青霉素的LB培养液中培养大肠杆菌后在含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上培养;6.含有重组质粒的转化子在具有生色诱导的培养基上只能形成白色菌落,通过蓝白筛选挑选单克隆菌落;7.将挑取的单克隆菌落在含氨苄青霉素的LB培养液中增殖大量复制转化质粒;8.用质粒抽取试剂盒提取培养后的菌液质粒;9.将对应菌落所得的菌落送生物测序公司,应用质粒测序技术检测单克隆菌落转化后质粒DNA序列;10.挑取存在T315I点突变的质粒和野生型菌落再次培养后提取制备大量质粒。
　　结果：构建了单纯发生BCR-ABL融合基因激酶区T315I突变和野生型的质粒,为后续试验建立一种检测BCR-ABL融合基因激酶区T315I突变的简便的检测方法提供基础。
　　结论：随着TKI治疗CML患者发生耐药突变增多,目前针对点突变的检测方法主要为测序法,其检测程序繁琐,操作周期长,检测费用高昂,另有些其他检测方法仍因技术、设备等原因未实现普及。本实验中在明确质粒DNA序列后,挑选突变型和野生型菌落培养后抽取质粒,成功制备T315I突变型和野生型质粒,以期在后续实验中能够建立一种具有操作简便,操作要求低,花费少的一种针对已知突变的快速筛查方法,能够用于临床CML患者治疗失败后是否发生已知的常见的点突变检测,进而指导临床治疗方案的调整。

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主要符号表

第1章 前言

第2章 材料与方法

一、材料

1.ABL基因详细信息参考genbank数据库，基因序列收录号NM-005157。

2.血液标本

3.实验试剂

4.实验仪器设备

5.主要试剂配制配方

二、方法：

1. 提取总RNA

2. 总RNA测定

3. cDNA第一链的合成

4. cDNA测定

5. PCR扩增

6. PCR产物检测定及DNA胶回收纯化

7. T4DNA连接

8. 质粒载体大肠杆菌转化

9.质粒提取

10. 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测

11. DNA测序

12. 大量质粒DNA提取

第3章 结果

一、RNA标本琼脂糖凝胶电泳检测

二、RNA反转录合成cDNA

三、PCR扩增

四、质粒转化

五、质粒DNA测序

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

综述

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢