氢气干预对腹腔镜气腹致大鼠肝损伤保护作用的研究

摘要

随着腹腔镜技术在兽医临床上应用的日益广泛，由腹腔镜气腹所带来的损伤也越来越不容忽视，其中之一便是腹腔镜气腹所造成的肝缺血再灌注损伤。由于缺血再灌注损伤的机制是产生大量的氧自由基、释放炎性因子和发生细胞凋亡等，而氢气又具有选择性抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用，所以本研究的目的是探讨氢气干预对腹腔镜气腹所致肝损伤的保护作用，为兽医临床上减轻腹腔镜气腹损伤提供一种可选择的干预方法。
　　本实验采用45只雄性Wistar大鼠，随机平均分为3组，分别为对照组（C组）、气腹组（P15组）和氢气/气腹组（H2P15组），每组15只。C组仅维持麻醉90min;P15组维持15mmHg的气腹90min;H2P15组于气腹前10min皮下注射0.2mL/kg的氢气，之后维持15mmHg的气腹90min。
　　各组于术后2h、6h和24h分别处死5大鼠，采集血清后使用试剂盒检测肝功能指标及氧化应激指标。开腹采集肝脏样本，分为四部分:一部分用于HE染色进行组织病理学观察;一部分制成组织匀浆后使用试剂盒检测肝功能指标和氧化应激指标及采用ELISA方法检测炎症反应指标;一部分采用荧光定量PCR的方法检测抗氧化、细胞凋亡和炎症反应标志性因子的mRNA表达水平;一部分采用蛋白质免疫印迹的方法检测抗氧化标志性因子和细胞凋亡标志性因子的蛋白表达水平。
　　C组的各项指标均无明显变化。与C组相比，肝功能指标结果显示气腹后P15组和H2P15组的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平均明显升高;与P15组相比，进行氢气干预后H2P15组的血清ALT、AST水平及肝组织匀浆AST水平均在6h时明显降低且差异极显著(P＜0.01)，肝组织匀浆ALT水平在6h时明显降低且差异显著(P＜0.05)。与C组相比，氧化应激指标结果显示气腹后P15组和H2P15组的血清丙二醛(MDA)含量明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量均明显降低;与P15组相比，进行氢气干预后H2P15组的血清MDA含量在6h时明显降低且差异极显著（P＜0.01），SOD含量在2h时明显升高且差异显著（P＜0.05），GSH含量在6h时明显升高且差异显著(P＜0.05);肝组织匀浆中MDA、SOD和GSH的含量变化也呈类似趋势。肝组织病理学检查结果显示P15组有少量肝细胞肿胀和细胞核固缩，存在少量的空泡变性，H2P15组也有类似的病变但较P15组程度轻微。气腹后抗氧化因子核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)和醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA表达量均明显升高，氢气干预使Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA表达量进一步升高且差异极显著（P＜0.01）;Western blot的结果也印证了这一变化。气腹后细胞凋亡因子Bcl相关X蛋白/B细胞淋巴瘤-2(Bax/Bcl-2)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的mRNA表达量均明显升高，氢气干预使Bax/Bcl-2和Caspase-3的mRNA表达量降低且差异极显著(P＜0.01);这一结果也被Westernblot的结果所证实。相比于P15组，进行氢气干预后H2P15组的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的mRNA表达量在6h时均降低且差异极显著(P＜0.01)，白介素-10（IL-10）的mRNA表达量在6h时升高且差异极显著(P＜0.01);使用ELISA方法对其进行检测也得到了类似的结果。
　　结果表明氢气干预可通过抗氧化、减轻细胞凋亡和降低炎性反应减轻腹腔镜气腹所致的肝脏损伤。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 腹腔镜技术及其在兽医临床上的应用

1．1．1 腹腔镜技术在兽医临床上的应用

1．1．2 腹腔镜气腹与器官损伤

1．2 肝缺血再灌注损伤及其机制

1．2．1 肝缺血再灌注损伤

1．2．2 肝缺血再灌注损伤的机制

1．3 氢分子医学

1．3．1 氢气的优点

1．3．2 氢气的作用方式

1．3．3 氢气与缺血再灌注损伤

1．4 目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 制备氢气

2．2．2 动物模型的建立

2．2．3 实验分组

2．2．4 样本的采集

2．2．5 肝功能的测定

2．2．6 肝组织病理学检验

2．2．7 氧化应激指标的测定

2．2．8 炎症指标的测定

2．2．9 Real-time PCR检测基因表达的水平

2．2．10 Western blot检测蛋白表达的水平

2．3 数据处理

3 结果

3．1 氢气干预对腹腔镜气腹致肝损伤中肝功能指标的影响

3．1．1 氢气干预对丙氨酸氨基转移酶的影响

3．1．2 氢气干预对天门冬氨酸氨基转移酶的影响

3．2 氢气干预对腹腔镜气腹致肝损伤中氧化应激指标的影响

3．2．1 氢气干预对丙二醛的影响

3．2．2 氢气干预对超氧化物歧化酶的影响

3．2．3 氢气干预对还原型谷胱甘肽的影响

3．3 氢气干预对腹腔镜气腹致肝损伤中肝组织的病理学变化

3．4 氢气干预对腹腔镜气腹致肝损伤中抗氧化因子的影响

3．4．1 氢气干预对Nrf2表达的影响

3．4．2 氢气干预对HO-1表达的影响

3．4．3 氢气干预对NQO1表达的影响

3．5 氢气干预对腹腔镜气腹致肝损伤中细胞凋亡因子的影响

3．5．1 氢气干预对Bax／Bcl-2表达的影响

3．5．2 氢气干预对Caspase-3表达的影响

3．6 氢气干预对腹腔镜气腹致肝损伤中炎症反应因子的影响

3．6．1 氢气干预对TNF-α表达的影响

3．6．2 氢气干预对ICAM-1表达的影响

3．6．3 氢气干预对IL-10表达的影响

4 讨论

4．1 氢气应用的可行性

4．2 氢气干预对腹腔镜气腹致肝损伤的保护作用

4．2．1 氢气干预对肝功能的影晌

4．2．2 氢气干预对氧化应激指标的影响

4．3 氢气干预对腹腔镜气腹致肝损伤的保护机制

4．3．1 氢气干预对肝脏抗氧化关键因子的影响

4．3．2 氢气干预对肝脏细胞凋亡关键因子的影响

4．3．3 氢气干预对肝脏炎症反应关键因子的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术的论文