姜黄素通过激活Nrf2活力对鲤鱼肝损伤保护作用的研究

摘要

本发明公开了一种姜黄素通过激活Nrf2活力对鲤鱼肝损伤保护作用的研究，包括三个试验，试验一为研究不同添加量的姜黄素对鲤鱼(Cyprinus carpio)生长性能的影响，试验二为姜黄素对四氯化碳（CCl4）诱导鱼体肝脏损伤的影响，试验三为姜黄素对四氯化碳诱导鲤鱼急性肝脏损伤的恢复作用研究。通过本发明的研究可知，饲料中添加120mg/kg姜黄素可通过提高Nrf2活力促进其向核内转移提高鲤鱼的抗氧化状态，从而提高抗氧化酶活性，最终保护鲤鱼免受CCl4的肝损伤，另外，研究结果还表明，饲料中添加姜黄素对鲤鱼应对急性肝脏损伤具有恢复作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种姜黄素对鲤鱼肝损伤保护作用的研究，具体为一种姜黄素通过激活Nrf2活力对鲤鱼肝损伤保护作用的研究，属于淡水生物应用领域。

背景技术

近年来，水产养殖业在我国的发展逐渐向高密度、集约化养殖模式靠拢，养殖密度迅速提高、人工配合饲料的大量投喂、药物和激素的不规范化使用、养殖水体环境的日益恶化、饲料中存在有害物质以及饲料营养成分缺失与失衡等不利因素越来越多，这对鱼体本身造成巨大压力，使其代谢系统失衡特别是对肝脏功能的损害尤为巨大，最终导致鱼类肝胆综合症的大规模爆发，这对水产养殖业的发展造成前所未见的局限性。此病用药时若不对症，鱼体可迅速大量死亡，死亡率高达60%～80%。因此，了解鱼类肝胆综合症的发病机制并在发病时及时对症下药，这对鱼体肝胆综合症的防治具有重要意义。

目前许多研究表明，部分化学物质如乙醇、四氯化碳(CCl

对于鱼类肝胆综合症的治疗，尚未发现任何特效药物，目前还是多以西药抗生素为主，然而，许多研究发现鱼类内服抗生素不但会引起鱼体本身消化道功能降低，还会对机体肝胆、脾肾等脏器造成损伤，此外，抗生素在机体中会大量残留致使病原菌对药物产生一定耐药性，最终给人类健康造成危害。因此，开发一种绿色的无毒副作用的对鱼体肝脏损伤具有保护和治疗作用的中成渔药已变得至关重要。姜黄素(

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种姜黄素通过激活Nrf2活力对鲤鱼肝损伤保护作用的研究。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种姜黄素通过激活Nrf2活力对鲤鱼肝损伤保护作用的研究，包括研究不同添加量的姜黄素对鲤鱼(

一、试验设计

本试验分为6组,P1组为对照组,P2组为空白对照组,P3、P4、P5、P6为试验组,P1、P2组投喂基础饲料；P3、P4、P5、P6组投喂试验饲料，其中基础饲料不添加姜黄素，试验饲料中姜黄素的添加水平分别为30、60、120和240 mg/kg；

试验一：连续饲养10周后,对P1、P3、P4、P5和P6组进行采样,分析不同添加量的姜黄素对鲤鱼(

试验二：连续饲养10周后,以0.5mL/100g体重的比例,分别对P1、P3、P4、P5、P6组鱼体腹腔注射30%的溶于橄榄油的CCl

试验三：根据试验二，选择P1（阴性对照组）、P2（阳性对照组）、P5和P6组，在养殖试验结束后，将P1、P5（120mg/kg）和P6（240mg/kg）组的鱼体以0.5mL/100g体重的比例腹腔注射30%溶于橄榄油的CCl

二、试验对象的选择与养殖管理

随机选取540尾大小、规格、体质基本一致的鲤鱼鱼苗，分为6个组,每组3个平行,每个平行30尾鱼,分别放入18个循环水养殖桶中进行养殖，每天饱食投喂三次，每次投喂持续30min以上；

三、采样与处理

试验结束后，每桶随机取鱼3尾，用100mg/L的MS-222快速深度麻醉，采尾静脉血及肝脏，血样在抗凝管中以4℃、6000r/min条件离心10min，制备的血浆于‒80℃下冻存备用；采集的肝脏分成两部分，一部分存于波恩氏固定液中以备切片用，另一部分存储在‒80℃冰箱待做进一步分析；

四、生长与形体指标的测定

试验结束后,停喂24h，对每桶分别进行称重，测定每桶鱼的总体重和尾数，计算特定生长率、增重率、饲料系数；随后再从每个养殖桶随机抽取3尾鱼测定体重、体长、内脏重、肝脏重, 用于肥满度、内脏比、肝体比的测定，计算方法如下：

增重率(weight gain, WG/%)=(Wt-W

特定生长率(specific growth rate, SGR/(%/d))=(LnWt−LnW

脏体比(viserosomatic index, VSI/%)=内脏重×100%/Wt

肝体比(hepatosomatic index, HSI/%)=肝脏重×100%/Wt

肥满度(condition factor, CF/%)= Wt×100%/L3

饵料系数(feed conversion ratio, FCR)=F/(Wt-W

式中W

五、血浆肝功能指标测定

采用试剂盒对总蛋白(TP)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)和总抗氧化能力(T-AOC)进行测定；

六、肝脏抗氧化指标测定及组织切片分析

将步骤三中存储在‒80℃冰箱中的肝脏取出并置于4℃冰箱溶解后，用生理盐水冲洗去掉血液, 而后用滤纸吸干, 以生理盐水为介质按照1:9的比例制成匀浆液, 随后3000r/min离心10 min, 取上清液用于谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定；

将步骤三中存储于波恩氏固定液中的肝脏切片并采用光学显微镜在油镜×1000条件下进行观察；

七、肝脏Nrf2mRNA测定

采用Trizol法提取各时间段的鲤鱼肝组织总RNA，测定总RNA纯度；凝胶电泳检测总RNA质量；Sybergreen法检测目的基因的扩增，Nrf2mRNA水平采用2

八、核内Nrf2含量监测

采用western blot技术检测肝脏细胞核内Nrf2含量；

九、数据统计与分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,数据差异显著时,采用Duncan’s检验法进行多重比较,差异水平定为

优选地，所述姜黄素纯度>95%，姜黄素和CCl

优选地，所述鲤鱼鱼苗由山东省淡水渔业研究院良种场提供，试验开始前,先采用通威饲料公司提供的沉性饲料暂养21d后，再进行试验对象的选择操作。

优选地，所述养殖桶内水体积为250L，每组试验所用养殖桶在空间位置上随机分散排布,每天投喂时间分别为8:30、12:30和4:30，整个试验期间水质条件为：水温24.5～27.5℃、溶解氧在6mg/L以上、氨氮在0.1mg/L以下、亚硝酸盐在0.1 mg/L以下、pH 6.8～7.0。

优选地，所述血浆肝功能指标及肝脏抗氧化指标测定中采用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；波恩氏固定液的配制成份为：1.22%的饱和苦味酸75mL，40%的福尔马林溶液25mL，冰醋酸5mL，光学显微镜型号为NIKON DS-Fi1，切片机型号为Leica RM-2255（德国）。

优选地，所述步骤七中采用的试剂盒均购自天根生物科技有限公司。

优选地，所述采样过程中每个抗凝管中收集1.2毫升血液，抗凝管为购自南通医疗有限公司的肝素钠抗凝管，型号为1.5毫升。

本发明的有益效果是：

1、饲料中添加60mg/kg和120mg/kg姜黄素可提高鲤鱼的生长性能，过量添加姜黄素可导致鲤鱼生长性能随姜黄素的逐渐增加而下降；

2、饲料中添加姜黄素在一个养殖期内不会引起鲤鱼肝脏损伤；而鱼体经四氯化碳诱导后，基础饲料中添加一定水平的姜黄素,可使血液中GPT和GOT活力可显著降低，且以120 mg/kg的水平添加时，GPT活力与对照组显著差异，这说明饲料中添加一定水平的姜黄素对鲤鱼肝脏具有保护作用；

3、饲料中添加120mg/kg姜黄素可通过促进Nrf2的释放提高鲤鱼的抗氧化状态，从而提高抗氧化酶活性，最终保护鲤鱼免受CCl

4、饲料中添加姜黄素对鲤鱼应对急性肝脏损伤具有恢复作用，且与高剂量（240mg/kg）组相比，120 mg/kg组鱼体的恢复能力更强。

附图说明

图1A为本发明不同处理组中姜黄素对鲤鱼肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响。

图1B为本发明不同处理组中姜黄素对鲤鱼肝脏中丙二醛(MDA)含量的影响。

图2A为本发明不同处理组中姜黄素对鲤鱼肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响。

图2B为本发明不同处理组中姜黄素对鲤鱼肝脏中谷胱甘肽(GSH)含量的影响。

图3为本发明不同处理组中CCl

图4为本发明不同处理组中CCl

图5A为本发明不同处理组中CCl

图5B为本发明不同处理组中CCl

图6A为本发明四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼血浆肝功指标中谷丙转氨酶(GPT)的影响。

图6B为本发明四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼血浆肝功指标中谷草转氨酶(GOT)的影响。

图7A为本发明四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼肝功中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响。

图7B为本发明四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼肝功中丙二醛(MDA)含量的影响。

图8A为本发明四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼肝功中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响。

图8B为本发明四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼肝功中还原性谷胱甘肽(GSH)含量的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种姜黄素通过激活Nrf2活力对鲤鱼肝损伤保护作用的研究，包括两个试验，试验一为研究不同添加量的姜黄素对鲤鱼(

本试验分为6组,P1组为对照组,P2组为空白对照组,P3、P4、P5、P6为试验组,P1、P2组投喂基础饲料；P3、P4、P5、P6组投喂试验饲料，其中基础饲料不添加姜黄素，试验饲料中姜黄素的添加水平分别为30、60、120和240 mg/kg；

试验一：连续饲养10周后,对P1、P3、P4、P5和P6组进行采样,分析不同添加量的姜黄素对鲤鱼(

试验二：连续饲养10周后,以0.5mL/100g体重的比例,分别对P1、P3、P4、P5、P6组鱼体腹腔注射30%的溶于橄榄油的CCl

试验三：选择P1（阴性对照组）、P2（阳性对照组）、P5和P6组，在养殖试验结束后，将P1、P5（120mg/kg）和P6（240mg/kg）组的鱼体以0.5mL/100g体重的比例腹腔注射30%溶于橄榄油的CCl

以下各实施例中试验数据均采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,数据差异显著时,采用Duncan’s检验法进行多重比较,差异水平定为

实施例一 不同添加量的姜黄素对鲤鱼(

Ⓐ 试验对象的选择与养殖管理

鲤鱼鱼苗由山东省淡水渔业研究院良种场提供。

试验开始前，先用通威饲料公司提供的沉性饲料暂养21d后，再随机选取540尾大小、规格、体质基本一致的鱼苗，将其分为6个组，每组3个平行，每个平行30尾鱼，分别放入18个循环水养殖桶中，养殖桶水体积为250 L。

每组试验所用养殖桶在空间位置上随机分散排布，减少试验组之间因光线等因素造成的误差。

每天饱食投喂3次，投喂时间分别为8:30、12:30和4:30，每次投喂持续30min以上。

每天对养殖桶进行除污以确保水质，日夜连续充气增氧。

整个试验期间水质条件为：水温24.5～27.5℃、溶解氧在6mg/L以上、氨氮在0.1mg/L以下、亚硝酸盐在0.1 mg/L以下、pH 6.8～7.0。

上述养殖试验中姜黄素纯度>95%，姜黄素和CCl

试验饲料在山东省淡水渔业研究院营养与饲料加工研究室制备。

饲料制备过程为，先将饲料原料粉碎并过40目筛，随后采用逐级混匀的方法使原料充分混匀，加水后用小型颗粒机制成直径为2mm的颗粒备用，其中小型颗粒机型号为SLP-45，购自中国水产科学研究院渔业机械研究所，基础饲料配方及营养水平见表1。

表1 试验基础饲料配方与营养水平

Table 1 Formulation and nutrient contents of the experimental diets %

注：1）每千克维生素预混料包含以下维生素：VA，900000IU；VD，200000IU；VE，4500mg；VK3，220mg；VB1，320mg；VB2，1090mg；烟酸，2800mg；VB5，2000mg；VB6，500mg；VB12，1.6mg；VC，5000mg；泛酸，1000mg；叶酸，165mg；胆碱，60000 mg；

2）每千克矿物质预混料包含以下矿物质：FeSO4·7H2O，25g；CuSO4·5H2O，2.0g；ZnSO4·7H2O，22g；Na2SeO3，0.04g；KI，0.026g；MnSO4·4H2O，7g；CoCl2·6H2O，0.1g。

Ⓑ 采样与处理

试验结束后，每桶随机取鱼3尾，用100mg/L的MS-222快速深度麻醉，采尾静脉血及肝脏，血样在抗凝管中以4℃、6000r/min条件离心10min，取上清液，即为血浆，制备的血浆于‒80℃下冻存备用；采集的肝脏分成两部分，一部分存于波恩氏固定液中以备切片用，另一部分存储在‒80℃冰箱待做进一步分析。

上述采样过程中每个抗凝管中收集1.2毫升血液，抗凝管为购自南通医疗有限公司的肝素钠抗凝管，型号为1.5毫升。

Ⓒ 不同添加水平的姜黄素对鲤鱼生长性能和形体指标的影响研究

试验结束后,停喂24h，对每桶分别进行称重，测定每桶鱼的总体重和尾数，计算特定生长率、增重率、饲料系数及蛋白质效率；随后再从每个养殖桶随机抽取3尾鱼测定体重、体长、内脏重、肝脏重, 用于肥满度、内脏比、肝体比的测定，计算方法如下：

增重率(weight gain, WG/%)=(Wt-W

特定生长率(specific growth rate, SGR/(%/d))=(LnWt−LnW

脏体比(viserosomatic index, VSI/%)=内脏重×100%/Wt

肝体比(hepatosomatic index, HSI/%)=肝脏重×100%/Wt

肥满度(condition factor, CF/%)= Wt×100%/L3

饵料系数(feed conversion ratio, FCR)=F/(Wt-W

式中W

表2 日粮中姜黄素的添加量对鲤鱼生长性能和形体指标的影响

Table2. Growth performance of

注: 同行数据肩标不含相同字母的两组平均值之间差异显著(

由表2可知，日粮中添加不同水平的姜黄素可显著影响鲤鱼的增重率和特定生长率(

提高鱼类的生长和抗病能力是最受关注的问题。目前，抗生素在陆生动物养殖中广泛用于促进生长和免疫，导致病原体产生一定程度的耐药性，最终危害人类健康。因此，强调了预防和治疗鱼类疾病的其他环保方法。在水产养殖中，中草药作为抗生素的潜在替代品已受到广泛关注。既往研究表明姜黄素可促进胃肠道运动，提高大鼠(褐家鼠)肠道和胰腺消化酶活性，也有报道姜黄素增加了罗非鱼肠道蛋白酶和淀粉酶的活性，提高了罗非鱼的生长性能。本研究中，10周饲粮中分别添加60和120mg姜黄素kg-1显著提高了鲤幼鱼的增重率（WG）和特定生长率（SGR），这与前人研究结果相似，对这一结果的一个合理解释是，添加姜黄素增强了鱼的免疫反应，从而提高了生长性能。但与添加60和120mg姜黄素kg-1相比，添加240mg姜黄素kg-1显著降低了增重率（WG）和特定生长率（SGR），提高了饲料系数（FCR），其原因可能是过量使用姜黄素引起肠道菌群失衡，扰乱肠道消化吸收。

由此可见，饲料中添加60mg/kg和120mg/kg姜黄素可提高鲤鱼的生长性能，而当姜黄素的添加量为240mg/kg时，鲤鱼的生长性能较60、120mg/kg组显著降低，因而过量添加姜黄素可或导致鲤鱼生长性能随姜黄素添加量的持续增加而降。

实施例二 姜黄素对四氯化碳（CCl

Ⓐ 姜黄素对四氯化碳诱导鲤鱼肝脏损伤后血液肝功指标的影响研究

本研究中采用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

将实施例一中存储在‒80℃冰箱中的血浆取出并置于4℃冰箱溶解后，测定血浆中总蛋白(TP)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)含量以及总抗氧化能力(T-AOC)。

表3CCl

Table3. Effects of dietary curcumin supplementation on the plasmaphysiological indexes of

注: 同行数据肩标不含相同字母的两组平均值之间差异显著(

由表3可知，鱼体未经过CCl

表4CCl

Table 4. Effects of dietary curcumin supplementation on the plasmaphysiological indexes of

注: 同行数据肩标不含相同字母的两组平均值之间差异显著(

由表4可知，鲤鱼经CCl

血浆GOT和GPT被普遍认为是肝损害的指标。

本研究中，与对照组相比，添加姜黄素的饲料中谷丙转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性较低，但差异不显著。这一现象说明，在本实验中添加一定量的姜黄素对鱼的肝脏没有造成损害。CCl

血浆总磷含量是反映机体营养和代谢状况的重要指标，也间接反映机体的抗氧化能力。蛋白质代谢以肝脏为主，当肝脏受损时，血浆TP含量会下降。因此，TP也可以作为检测肝功能的指标进行临床鉴别。有研究认为中药不仅能改善施氏鲟的抗氧化功能，而且能显著提高血浆TP含量，这与我们的研究结果一致。P4和P5组血浆TP含量显著高于对照组。但CCl

以上结果表明，饲料中添加姜黄素在一个养殖期内不会引起鲤鱼肝脏损伤，而鱼体经四氯化碳诱导后，在基础饲料中添加一定水平的姜黄素时, 血液中GPT和GOT活力可显著降低，且以120 mg/kg的水平添加时，GPT活力与对照组显著差异，这说明饲料中添加一定水平的姜黄素对鲤鱼肝脏具有保护作用。

Ⓑ四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏抗氧化酶的影响研究

本研究中采用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

将实施例一中存储在‒80℃冰箱中的肝脏取出并置于4℃冰箱溶解后，用生理盐水冲洗去掉血液，而后用滤纸吸干，以生理盐水为介质按照1:9的比例制成匀浆液，随后3000r/min离心10 min，取上清液用于谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定。

由图1可知, 在日粮中添加姜黄素在一定程度上可提高肝脏SOD活力并降低MDA含量，而鱼体经CCl

由图2可知, CCl

上述结果表明，120mg/kg的姜黄素在一定程度上提高了鱼体抗氧化功能，保护肝脏不受损伤。这可能是因为姜黄素可以通过抑制CCl

Ⓒ四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏组织结构的影响研究

本研究中波恩氏固定液配制成份为1.22 %的饱和苦味酸75 mL，40 %的福尔马林溶液25 mL，冰醋酸5 mL。

所用切片机型号为Leica RM-2255（德国），所用的光学显微镜型号为NIKON DS-Fi1。

将实施例一中存储在波恩氏固定液中进行组织固定的的肝脏取出，然后按照操作规范对固定好的肝脏组织进行水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片()。蜡片制作完成后,将其附贴于用蛋白甘油处理过的载玻片上进行HE染色, 然后用中性树胶封片。封片结束后, 将组织切片置于光学显微镜在油镜(×1000)下观察。

鲤鱼经CCl

诱导后72h，样品在油镜(×1000)下观察, 结果表明，与空白对照组(P2)相比，四氯化碳可引起鱼体肝脏严重损伤，肝细胞出现严重空泡现象及细胞膨大现象，大部分肝细胞的细胞核出现偏移，随着姜黄素添加量的增加，与P1组相比，各试验组肝细胞空泡化和膨大现象均出现不同程度的减轻，其中，P5(120mg/kg)和P6(240mg/kg)组的肝细胞形状较为正常，没有表现出细胞膨大现象，也无明显的脂肪空泡，细胞核大小适中，分布于细胞中间。

既往研究证实肝内空泡变性、坏死和炎症细胞浸润是肝损伤的生物学标志物。而本研究表明，饲料中添加姜黄素可减少肝脏炎症细胞浸润和空泡变性，尤其是P5组。说明姜黄素(120mg/kg饲料)对CCl

这一结果直接验证了姜黄素在鲤鱼中的保肝作用，说明姜黄素对鱼体具有保护肝脏不受损伤的功能, 且以120mg/kg的添加水平效果最佳。这可能是因为姜黄素可以诱导机体产生ROS, 其可使受损细胞的DNA分子损伤, 通过调节细胞凋亡相关基因的表达来达到修复肝脏功能, 但剂量不足或者过量均不能达到最佳效果。

Ⓓ 四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏中Nrf2 mRNA表达量的影响研究

本实施例中采用的试剂盒均购自天根生物科技有限公司。

利用试剂盒采用Trizol法提取鲤鱼肝组织总RNA，测定总RNA纯度，使OD260/OD280为1.8～2.0，并凝胶电泳检测总RNA质量；利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；

根据鲤鱼Nrf2 mRNA 的基因全序列设计引物(详见表5) 并进行实时荧光定量PCR反应，反应条件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，循环40次。

Sybergreen法检测目的基因的扩增，β-actin为内参基因，所有反应均设3个重复。Nrf2 mRNA水平采用2

表5

Table5 Primers for real time PCR analysis of

如图4所示，CCl

Ⓔ四氯化碳诱导后姜黄素对鲤鱼肝脏细胞核Nrf2蛋白水平的影响研究

本研究中Nrf2一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，羊抗兔二抗购自JacksonImmunoResearch。

采用western blot技术检测肝脏细胞核内Nrf2含量。

取鲤肝组织100 mg，用溶液法抽提总蛋白，Bradford法测定蛋白质浓度，变性后电泳，蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用50 g/L脱脂奶粉TBS溶液于室温下封闭2 h，用Nrf2一抗 (1∶1 000) 于4℃下孵育18 ~ 24 h，用洗膜缓冲液TBST（Tris Buffered Saline Tween）洗膜3 次，每次8 min，用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗(1∶10000) 室温下孵育2 h，用TBST同法洗膜3 次，进行2 min的免疫印迹化学发光（ECL）反应，暗室中曝光、显影和定影。用HRP偶联内参GAPDH一抗孵育2 h 后，用TBST洗膜4 次，每次10 min，进行2 min ECL反应，同法曝光、显影和定影。

利用QuantiScan 3.0 软件测量目的蛋白和内参蛋白条带灰度值，相对表达量以Nrf2灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示。

结果如图5所示，经CCl

结合实施例四、实施例六和实施例七的结果进行以下分析：

肝脏内化学物质的代谢主要依靠第一阶段代谢(如GSH)和第二阶段酶代谢(如GPX、SOD)。越来越多的证据表明Keap1-Nrf2复合物是化学预防2期酶诱导剂的关键分子靶点。Keap1是一种细胞质肌动蛋白结合蛋白，是Nrf2的抑制剂，在正常生理条件下将其隔离在细胞质中。然而，诱导剂通过改变Keap1的结构构象来促进胞质抑制剂Keap1释放Nrf2。转录因子Nrf2是碱性亮氨酸拉链NF-E2家族成员，与第二阶段解毒酶启动子区域的抗氧化反应元件(ARE)相互作用。最后，通过调节两相酶的表达，提高机体的抗氧化能力。

本研究表明，适当剂量(60和120 mg kg-1)口服姜黄素可显著提高鲤鱼血浆抗氧化状态，这可能与提高SOD、GPx活性、GSH含量、降低MDA含量有关。CCl4攻毒72 h后，P1组肝脏Nrf2 mRNA水平、SOD、GPX活性、GSH含量均显著低于P2组，MDA含量显著高于P2组。饲粮添加120 mg kg-1姜黄素可显著提高SOD活性、GPX活性和GSH含量，降低MDA含量。同时，随着姜黄素添加量的增加，鲤鱼肝脏细胞核中Nrf2蛋白水平呈先升高后降低的趋势。Nrf2蛋白在核内的表达量以P5组最高。高剂量组Nrf2蛋白水平明显低于P5组。一种合理的解释是，高剂量的姜黄素可能破坏肝细胞的结构，从而抑制Nrf2的转移。此外，姜黄素是一种自由基清除剂和氢供体，具有抗氧化和促氧化活性，在高浓度的姜黄素中，后者占主导地位。上述结果表明，姜黄素可通过促进细胞质抑制剂Keap1释放Nrf2，将Nrf2与SOD和GPX启动子区ARE结合，从而提高鲤鱼的抗氧化状态，最终保护鲤鱼肝脏。

实施例三 姜黄素对四氯化碳诱导鲤鱼急性肝脏损伤的恢复作用研究

Ⓐ 四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼血浆肝功指标的影响研究

本研究中采用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

将实施例一中存储在‒80℃冰箱中的血浆取出并置于4℃冰箱溶解后，测定谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)含量以及总抗氧化能力(T-AOC)。

如图6A和图6B所示，饲料中添加姜黄素饲养一段时间后对鲤鱼应激四氯化碳诱导的急性肝损伤有显著影响，且在一段时间内，因姜黄素的添加量不同鱼体血浆中GPT和GOT活力也不同。经四氯化碳诱导2、3d时，阴性对照组（P1）的GPT和GOT均显著(

Ⓑ 四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼肝脏SOD活力和MDA含量的影响研究

本研究中采用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

将实施例一中存储在‒80℃冰箱中的肝脏取出并置于4℃冰箱溶解后，用生理盐水冲洗去掉血液，而后用滤纸吸干，以生理盐水为介质按照1:9的比例制成匀浆液，随后3000r/min离心10 min，取上清液用于谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定。

如图7A和图7B所示，饲料中添加姜黄素饲养一段时间后对四氯化碳诱导鲤鱼急性肝损伤后的肝脏SOD活力和MDA含量有显著影响，且在一段时间内，因姜黄素的添加量不同鱼体肝脏SOD活力和MDA含量也不同。经四氯化碳诱导3d时，阴性对照组（P1）的SOD活力相较于诱导初期显著降低(

Ⓒ四氯化碳诱导后姜黄素在不同时间点对鲤鱼肝脏GPx活力和GSH含量的影响研究

如图8A和图8B所示，经四氯化碳诱导后鲤鱼肝脏GPx活力和GSH含量也受饲料中姜黄素的添加量显著影响。经四氯化碳诱导3d时，阴性对照组（P1）较四氯化碳诱导初期GPX活力和GSH含量均显著降低(

综上所述，饲粮中添加最佳姜黄素(60和120 mg/kg )可提高鲤鱼的生长性能。饲料中添加120 mg/kg姜黄素可通过促进Nrf2的释放提高鲤鱼的抗氧化状态，从而提高抗氧化酶活性，最终保护鲤鱼免受CCl

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。