PBMSCs移植治疗兔ONFH的体内存活及局部微环境细胞因子表达研究

摘要

目的:本课题是在课题组既往研究已证实原位移植兔外周血间充质干细胞(PBMSCs)对于液氮冷冻兔股骨头坏死模型具有治疗效应的基础上,进一步提供移植 PBMSCs的体内定植与存活情况以及移植后股骨头病损区域以细胞因子为主的内环境改变情况,为阐明PBMSCs移植治疗股骨头坏死的可能机制提供新的有价值的实验依据。
　　方法:①兔PBMSCs的分离、培养与表型鉴定:选用2~3月龄日本大耳白兔,按30μg/(kg·d)剂量连续于背部皮下注射G-CSF动员6 d,第7 d自主动脉取兔外周血40 ml,采用密度梯度离心法分离出单个核细胞,用红细胞裂解液清除混入的红细胞,用含15％FBS的改良型α-MEM,于37oC、5%CO2饱和湿度环境下进行PBMSCs原代培养,适时换液并弃除未贴壁的其他细胞,待贴壁细胞生长汇合度达80%~90%时,按2~5×105/ml细胞密度进行传代培养。取第2代细胞,以免疫细胞化学染色法对分离培养的兔PBMSCs进行CD90、CD105、CD44、CD34、CD45表型鉴定。
　　②兔股骨头坏死模型的制备:采用3~4月龄日本大耳白兔,使用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉动物(剂量为30 mg/kg),无菌条件下手术逐层钝性分离臀肌以暴露股骨头;无菌棉签蘸取液氮,对股骨头软骨面负重区进行反复冷冻、复温以制备股骨头坏死模型。
　　③动物分组与细胞移植:实验分为正常对照组、模型组、髓芯减压组和髓芯减压+PBMSCs移植组。液氮冷冻后,用直径1.2 mm钻头从髓芯减压组和细胞移植组两组动物股骨颈的内后侧与股骨颈方向呈30度角手动钻入股骨头内5 mm,到达关节软骨下,髓芯减压组在钻孔后即复位股骨头;细胞移植组钻孔后,自减压孔注射入以300μl生理盐水悬浮的第2~3代PBMSCs(细胞数为3~4×106个);术后逐层缝合各组动物创口。移植PKH26标记的PBMSCs的体内定植示踪及股骨头组织损伤区域的组织病理学观察:于术后2 w、4 w、6 w、8 w随机选取各时间点各组实验动物股骨头,沿冠状面剖开股骨头,进行固定、脱钙,制作冰冻切片(厚15μm)及常规石蜡切片(厚10μm),将冰冻切片DAPI复染后,置荧光显微镜下观察移植细胞存活情况,石蜡切片经Masson染色,置光镜下观察组织病理学变化情况。
　　④移植PBMSCs后股骨头局部细胞因子表-达的内环境变化:将部分股骨头样本置于液氮中保存,用于实时聚合酶链反应(RT-PCR),以检测不同时间点各组股骨头内BMP-2、BMP-4、PDGF-β、TGF-β1、VEGF-A及CCL2 mRNA的表达情况。
　　结果:①家兔PBMSCs培养形态与表型特征:原代培养第5 d时,可见较多贴壁细胞,细胞呈梭形、多角形及不规则形,以梭形为主,可达20%~30%融合率,培养到10 d左右时,细胞生长汇合度达80%以上;传代培养的PBMSCs形态均一,呈梭形漩涡状生长。免疫细胞化学染色结果显示,PBMSCs表达CD90、CD105、CD44,不表达CD34、CD45。
　　②移植PKH26标记的PBMSCs的体内定植及存活分析:荧光显微镜下的观察结果显示移植PKH26标记的PBMSCs移植后第2 w、4 w、6 w、8 w兔股骨头移植部位均存在 PKH26标记的阳性移植细胞,且随时间点的推移,移植PBMSCs定植存活细胞的数量逐渐减少。
　　③兔股骨头的Masson染色组织病理学分析:镜下可见正常组软骨下区域的骨小梁完整,排列规律,大部分为红染的成熟骨组织;2 w时模型组骨小梁断裂,排列紊乱,大部分为绿染的新生骨组织,骨小梁中骨细胞空骨陷窝增多,髓芯减压组与移植组也可见被染上绿色的骨小梁;4 w时模型组骨小梁较细,绿染不均匀,新生骨质开始增加,髓芯减压组与移植组部分骨小梁呈现较均匀绿染并出现片状红染;6 w时模型组股骨头软骨下区域的骨小梁大部分为绿染的新生骨组织,髓芯减压组与移植组可见条状绿染的骨小梁;8 w时模型组红染的成熟骨组织区域增大,骨小梁稀疏,软骨下的骨质比较薄,髓芯减压组红染区域扩大,骨小梁稀疏,骨质比较薄,移植组骨小梁呈现红绿相间,骨小梁较另两组密集,其间点状红染区域与绿染区域相间分布。
　　④股骨头局部组织细胞因子表达的RT-PCR检测结果:模型组各观察时间点股骨头内BMP-2 mRNA的表达量均明显低于正常组(P<0.01);细胞移植组各观察时间点股骨头内BMP-2 mRNA的表达量均高于模型组(P<0.01或P<0.05),细胞移植组股骨头内BMP-2 mRNA的表达量与髓芯减压组相比无统计学差异;模型组各观察时间点股骨头内BMP-4 mRNA的表达量均明显低于正常组(P<0.01),细胞移植组各观察时间点股骨头内BMP-4 mRNA的表达量均高于模型组(P<0.01或P<0.05),细胞移植组股骨头内BMP-4 mRNA的表达量在2 w时高于髓芯减压组(P<0.05),随着时间的推移,细胞移植组BMP-4 mRNA的表达量4 w、6 w、8 w呈现出升高后降低的变化(P<0.05);模型组各观察时间点股骨头内PDGF-βmRNA的表达量均低于正常组(P<0.05或P<0.01),细胞移植组在各观察时间点时股骨头内PDGF-β mRNA的表达量均明显高于模型组(P<0.01),细胞移植组股骨头内PDGF-β mRNA的表达量在4 w、8 w时高于髓芯减压组(P<0.05);模型组各观察时间点股骨头内TGF-β1 mRNA的表达量均明显低于正常组(P<0.01),细胞移植组在各观察时间点股骨头内TGF-β1 mRNA的表达量均显著高于模型组(P<0.01),细胞移植组股骨头内TGF-β1 mRNA的表达量在8 w时高于髓芯减压组(P<0.05)随着时间的推移,细胞移植组TGF-β1 mRNA在2 w、4 w时的表达量均呈现出升高的变化(P<0.05);模型组各观察时间点股骨头内VEGF-A mRNA的表达量均明显低于正常组(P<0.01),细胞移植组在各观察时间点股骨头内VEGF-A mRNA的表达量均高于模型组(P<0.05或P<0.01),其中6w、8 w时髓芯减压组股骨头内VEGF-A mRNA的表达量明显均高于模型组(P<0.01),细胞移植组股骨头内VEGF-A mRNA的表达量与髓芯减压组没有统计学差异;模型组各观察时间点股骨头内CCL2 mRNA的表达量均高于正常组(P<0.05),细胞移植组在各观察时间点股骨头内CCL2 mRNA的表达量均明显低于模型组(P<0.01),细胞移植组股骨头内CCL2 mRNA的表达量在各观察时间点均低于髓芯减压组(P<0.05或P<0.01)。
　　结论:移植的兔PBMSCs能够在兔股骨头坏死的原位组织中定植存活至少8 w。移植 PBMSCs所发挥的股骨头坏死修复作用可能与病损局部内环境中参与骨组织损伤修复及改善血供的 BMP-2、BMP-4、PDGF-β、TGF-β1及 VEGF-A等细胞因子的表达变化有关。

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前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要实验仪器及耗材

1.1.4 相关试剂的配制：

1.2 方法

1.2.1 兔PBMSCs的分离与培养

1.2.2 免疫细胞化学染色法鉴定PBMSCs免疫表型

1.2.3 实验动物分组及ONFH模型制备

1.2.4 PBMSCs的体内定植与存活分析

1.2.5 股骨头组织Masson染色病理学观察

1.2.6 股骨头局部组织多种细胞因子的mRNA表达检测

2 结果

2.1 兔PBMSCs培养形态

2.2 兔PBMSCs的免疫表型特征

2.3 PBMSCs的标记情况分析

2.4 股骨头组织Masson染色形态学分析

2.5 股骨头组织多种参与修复再生的因子的mRNA表达分析

3 讨论

4 结论

参考文献

综述

致谢

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