基于S-POLY(T)plus实时荧光定量PCR技术在肝癌相关miRNA检测中的应用研究

摘要

目的:
　　建立一种基于S-Poly(T)plus的实时荧光定量PCR法，为检测血清miR-122和miR-199提供更为灵敏且便捷的方法，并探讨其在肝细胞癌诊断中的应用价值。
　　方法:
　　1.设计S-poly（T）plus法扩增miRNA的特异性引物和探针；
　　2.建立S-poly（T）plus荧光定量PCR法检测组织和血清miRNA，并对实验条件进行优化，确立其线性范围，进行灵敏度、重复性等方法学评价；
　　3.选择2017年2月至2017年12月福建医科大学附属第一医院住院初诊为肝细胞癌的患者50例，作为实验组，同时选择性别、年龄与实验组相匹配，各项体检结果正常且无肿瘤家族史的健康人为对照组。采用S-poly（T）plus荧光定量PCR法检测各组血清miR-122和miR-199表达水平，与Poly（A）加尾法比较，并进行ROC曲线分析；
　　4.根据实验组AFP水平分为A组（AFP＜20ng/ml），B组（20＜APF＜400ng/ml），C组（AFP＞400ng/ml）三个亚组，分析血清miR-122和miR-199表达水平与AFP水平的相关性。
　　结果:
　　1.建立一种基于S-poly（T）plus荧光定量PCR检测micro RNA的方法。采用S-poly（T）plus法和Poly（A）加尾法检测micro RNA，测得各组Ct值分别为：实验组miR122（26.73±2.48）和（32.84±2.28）（P＜0.05），对照组miR122（27.87±2.66）和（32.12±1.84）（P＜0.05），实验组miR199（33.62±1.6）和（34.53±1.13）（P＞0.05），对照组miR199（30.71±3.21）和（35.25±0.83）（P＜0.05），实验组cel-miR-54（29.43±1.37）和（33.79±0.77）（P＜0.05），对照组cel-miR-54（31.88±2.39）和（33.38±0.61）（P＜0.05），以上对应组两两比较结果表明S-poly（T）plus法灵敏度高于Poly（A）加尾法。
　　2.S-poly（T）plus法批间CV值为2.59％，小于Poly（A）加尾法的3.52%。S-poly（T）plus法线性相关系数R2（0.984）大于Poly（A）加尾法R2（0.957）。
　　3.采用S-poly（T）plus法检测实验组和对照组miR-122和miR-199的相对表达量，得出实验组miR-122（10.89±11.99），对照组miR-122（2.11±3.26）,肝细胞癌患者血清中miR-122水平显著高于健康志愿者，P＜0.01。而实验组mi R-199（0.2±0.2），对照组miR-199（0.92±0.93），肝细胞癌患者血清中miR-199水平显著低于健康志愿者，P＜0.01。
　　4.ROC曲线分析得出miR-122的的曲线下面积（AUC）为0.82（95%CI0.732-0.908，P＜0.001，cut-off为1.32，诊断敏感性为81.6%，特异性为68.2%），而miR-199的曲线下面积（AUC）为0.807（95%CI0.714-0.900，P＜0.001，cut-off为0.226，诊断敏感性为73%，特异性为71.4%）。
　　5.血清miR-122表达水平在A、B、C各实验亚组间随着AFP的增加呈逐渐升高的差异表达，（P＜0.05）。血清miR-199表达水平在A、B、C各实验亚组间随着AFP的增加呈逐渐降低的差异表达，各组相比较P＜0.05。
　　结论:
　　1.建立了基于S-poly（T）plus荧光定量PCR检测micro RNA的方法，该法相比于Poly（A）加尾法灵敏度较高，重复性较好。
　　2.血清miR-122和miR-199与AFP水平有一定的相关性，有望成为肝细胞癌辅助诊断指标。

目录

第一个书签之前

OLE_LINK11

OLE_LINK6

OLE_LINK12

OLE_LINK3

OLE_LINK8

OLE_LINK4

OLE_LINK5

OLE_LINK13

OLE_LINK9

OLE_LINK7

OLE_LINK16

OLE_LINK17

OLE_LINK18