猪蛔虫感染期幼虫差异表达基因的鉴定和全长cDNA的克隆与分析

摘要

猪蛔虫(Ascaris sunm,A.suum)是线虫的一种,在分类上隶属线虫纲蛔目蛔科蛔属,是一种专性寄生虫,在马属动物和反刍动物体内都不寄生。猪蛔虫病感染普遍,感染率很高,呈世界性流行。成虫寄生于猪小肠肠腔内,在猪体内寄生的数量巨大,可达1000条以上,导致肠腔堵塞,严重扰乱了机体的消化吸收等功能,幼虫在猪体内移行,导致各器官损害,猪蛔虫幼虫还会在人体寄生,引起一些幼虫移行症,如眼幼虫移行症。因此,对猪蛔虫病的研究具有重要公共卫生学意义。本研究在前期构建猪蛔虫感染期幼虫消减cDNA文库并经微阵列表达谱筛选差异表达基因的基础上,应用半定量RT-PCR对筛选的基因进行验证和鉴定,并采用末端的快速扩增技术(RACE)对在感染期幼虫表达丰度高的基因进行全长cDNA的克隆和分析。试验结果如下:
　　 1、虫卵和幼虫的收集:猪蛔虫受精卵的收集、感染性虫卵的成功培养以及其它幼虫的收集是整个实验的关键和基础。本实验利用低浓度的琼脂凝胶结合贝尔曼氏法进行分离幼虫的改良方法,获得了大量的高纯度幼虫,从而保证了下一步总RNA提取的质量。提取良好质量的RNA是进行反转录和RACE的关键。
　　 2、感染期幼虫差异ESTs的鉴定:半定量RT-PCR是将总RNA逆转录成cDNA,然后扩增目标cDNA和内参cDNA,根据PCR产物量来计算样品中mRNA的相对数量。半定量RT-PCR因其高度的灵敏性和特异性仍被广泛的运用。本实验在已构建的猪感染期幼虫cDNA文库的基础上,以β-actin基因为内参,利用半定量RT-PCR成功鉴定了8个猪蛔虫感染期幼虫差异ESTs。结果显示,鉴定的基因都在感染期幼虫呈高丰度表达,有些基因只在雌虫不表达,如15G04;有些基因只在雄虫不表达,如2G04;大部分基因都能在肺L3表达。
　　 3、感染期幼虫差异表达基因28A02全长cDNA的扩增、克隆以及生物信息学分析:利用Takara公司的5'和3'RACE试剂盒成功获得了28A02基因的全长序列,并对其进行生物信息学分析,推测其可能与线粒体ATP合酶有关。
　　 研究结果不仅为阐明寄生线虫期特异性发育的分子机制奠定基础,也很可能为猪蛔虫新药的研发和新的基因工程苗的制备找到靶分子。