阻断二氮嗪后处理对大鼠心肌线粒体蛋白质表达谱变化的影响

摘要

目的:利用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型及蛋白质组学技术,观察5-羟葵酸阻断二氮嗪后处理对大鼠心肌线粒体蛋白质表达谱的变化,为寻找药物后处理的作用靶点,为潜在的临床应用提供理论依据.方法:1.利用Langendorff离体心脏灌流系统建立大鼠心脏缺血再灌注损伤模型:雄性SD大鼠24只,随机分为正常组(Nor)、缺血再灌注损伤组(I/R)、二氮嗪后处理组(DZ)、5-羟葵酸阻断二氮嗪后处理组(5-HD+DZ),每组6只.灌注方案:Nor组:持续灌注Kerbs-Henseleit缓冲液(K-H液)120 min,不作停跳缺血处理.I/R组、DZ组、5-HD+DZ组,在灌注K-H液平衡20 min后,灌注4℃ST.Thomas停跳液,使全心停跳缺血40 min,分别按以下方案行再灌注:I/R组:灌注K-H液60 min;DZ组:灌注KH液前给予50 μmol/L二氮嗪2min,继之K-H液58 min;5-HD+DZ组:灌注100 μmol/L5-羟葵酸3min后,接着灌注50 μmol/L二氮嗪2min,然后灌注K-H液55 min.记录各组平衡末和续灌末心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室舒张末压(LVDEP)、以及最大dp/dt等心脏功能的变化,并收集心室组织用于供线粒体蛋白质的提取;2.差速离心及Nycodenz密度梯度离心提取、纯化大鼠心肌线粒体,并利用透射电镜验证线粒体纯度;3.提取心肌线粒体蛋白质,行双向凝胶电泳(2-DE)、染色、凝胶扫描后获取2-DE图像,用PD-Quest8.0软件分析5-HD+DZ组相对DZ组蛋白点丰度变化,选取差异在2倍以上的蛋白质点,将其挖取、酶解、质谱分析后获得相关差异蛋白质的谱图;采用MALDI-TOF-MS鉴定;4.利用western blot回复验证关键差异蛋白的表达趋势,以判断2-DE结果的可靠性.结果:1.Nycodenz密度梯度离心法能得到富集度较高的线粒体;2.平衡末各组间心功能无明显差异.灌注末Nor组及DZ组的心功能优于I/R组和5-HD+DZ组(P＜0.05).5-HD+DZ组与I/R组间心功能差异无统计学意义;3.将5-HD+DZ组和DZ组线粒体蛋白行2-DE,凝胶图像经PD-Quest软件分析后,得到的图像聚焦良好、重复性高,两组胶平均检测出650±22个蛋白斑点;质谱分析鉴定出符合要求(线粒体蛋白、Mascot score＞60)的蛋白质5个;4.与DZ组比较,5-HD+DZ组表达下调的蛋白点分别为:Spot 2504(琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基,SDHA)、5806(2-酮戊二酸脱氢酶,OGDH)、7204(丙酮酸脱氢酶E1组件β亚基,PDHE1β)、7604(线粒体内膜蛋白,IMMT);表达上调的蛋白为:Spot9101(NADH黄素蛋白亚基2,NDUFV2);5.Western blot回复验证,差异蛋白SDHA及OGDH在5-HD+DZ组中的表达较DZ组低,与2DE结果相吻合.结论:1.二氮嗪后处理能够激活mitoKATP通道产生心肌保护作用,此效应能被5-HD阻断;2.5-HD阻断mitoKATP通道后会造成心功能受损,使与维系线粒体能量代谢和呼吸链稳定有关的四个蛋白(SDHA、OGDH、PDHE1β、NDUFV2)的表达发生变化,这些蛋白可能与mitoKATP通道存在一定的联系.