二氮嗪后处理对大鼠心肌线粒体蛋白质表达谱的影响

摘要

目的:建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察二氮嗪后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤心脏功能的影响.利用蛋白质组学研究技术,观察二氮嗪后处理对大鼠心肌线粒体蛋白质表达谱的变化,为寻找新的药物后处理作用靶点和潜在的临床应用提供理论依据.方法:1.建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型.18只成年雄性SD大鼠随机分为正常组(Nor)、缺血再灌注损伤组(Con)和二氮嗪后处理组(DZ),每组6只.灌注方案:Nor组:持续灌注Kerbs-Henseleit缓冲液(K-H液)120 min,无缺血再灌注损伤.Con组和DZ组:缺血前先灌注K-H液平衡20 min,灌注4℃ St.Thomas停跳液,使全心缺血40 min后,按以下方案灌注:①Con组:灌注K-H液60min;②DZ组:灌注K-H液前给予50 μmol/L二氮嗪2 min,继之K-H液58 min.观察各组平衡末及灌注末心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室舒张末压(LVDEP)、以及最大dp/dt等心功能的变化.2.差速离心和Nycodenz密度梯度离心分离纯化大鼠心肌线粒体,透射电镜验证其纯度.3.提取线粒体蛋白质,采用双向电泳技术(2-DE)对蛋白质进行分离,利用PDQuest8.0软件分析各组蛋白质表达的差异.选取差异在2倍以上的蛋白质点,采用MALDI-TOF-MS鉴定.4.Western blot法回复验证部分差异蛋白质的表达变化,证实双向电泳结果的可靠性.结果:1.平衡末各组间心功能无明显差异,续灌末Nor组和DZ组心功能明显优于Con组(P＜0.05);2.Westernblothe和透射电镜证实了Nycodenz密度梯度离心法提取的线粒体纯较高;3.对各组线粒体蛋白进行2-DE,每张胶上检测出513±27个蛋白质斑点;PDQuest 8.0软件分析后得到14个差异蛋白质,经MALDI-TOF-MS分析,成功鉴定出6个蛋白;4.DZ组与Con组比较发现:NADH脱氢酶黄素蛋白1(NDUFV1)、2-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)、NADH脱氢酶铁硫蛋白1(NDUFS1)表达升高.有两个蛋白质点被鉴定为ATP合酶a亚基,其中一个蛋白点表达升高(SSP 7704),而另一个蛋白点表达降低(SSP 2017).结论:1.二氮嗪后处理能够减轻心肌缺血/再灌注损伤,有保护心肌、改善心功能的作用.2.①二氮嗪后处理能通过上调NDUFV1和NDUFS1的表达,维系线粒体呼吸链的稳定,促进能量合成,保障心脏的能量供应.②二氮嗪处理通过上调OGDH的表达,促进丙酮酸的氧化脱羧,为乙酰CoA进入三羧酸循环做准备,保障有氧代谢的正常进行.3.缺血再灌注损伤会造成ATP合酶a亚基的降解,而二氮嗪开放线粒体敏感性钾通道以后能在一定程度上缓解这种现象的发生.4.Nycodenz不连续密度梯度离心法可获得较高纯度的心肌线粒体.