qPCR

摘要： 为探讨GDF9基因和BMP15基因在单、多羔黔北麻羊性腺轴组织中的mRNA相对表达规律,本实验选取产单羔和多羔的经产母羊各3只,通过qPCR法对GDF9基因和BMP15基因在单、多羔黔北麻羊性腺组织中的相对表达水平进行检测。结果表明:GDF9、BMP15基因mRNA在单、多羔黔北麻羊5个性腺组织中均有不同程度的表达。由组间比较可知,多羔组的GDF9基因在垂体相对表达量极显著高于单羔组,在输卵管中单羔组的相对表达量显著高于多羔组,其他组织之间差异不显著;BMP15基因在输卵管中的表达量呈现为单羔组极显著高于多羔组,在子宫中呈现为单羔组显著高于多羔组,其余组织之间差异不显著。本实验结果表明GDF9基因和BMP15基因在黔北麻羊的单羔组和多羔组性腺轴组织之间的表达趋势大体一致,在卵巢中最高,在子宫中最低,说明2个基因对黔北麻羊的繁殖性能有重要作用。本研究结果可为今后深入探究GDF9基因和BMP15基因对山羊的繁殖机理提供理论依据。

摘要： 叶黄素循环是植物应对环境胁迫进行热耗散的光保护途径之一,紫黄质脱环氧化酶基因(VDE)是叶黄素循环脱环氧化过程的关键基因。本研究采用RACE技术首次克隆了云南逸散紫花苜蓿(Medicago sativa)的MsVDE基因,同时采用实时荧光定量分析干热胁迫下的MsVDE基因表达特征。结果表明,MsVDE全长1678 bp,CDS编码区1608 bp,编码535个氨基酸。氨基酸序列保守区域具有3个VDE基因的特征区,即N-端半胱氨酸富集区、脂质运载蛋白特征区和C-端谷氨酸富集区。进化树分析表明该基因与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)VDE基因的氨基酸序列亲缘关系最近。干热胁迫第4天和第8天时的MsVDE基因表达量分别比正常条件上调了2.13倍和1.97倍;喷洒二硫苏糖醇(1,4-Dithiothreitol,DTT)溶液后MsVDE基因表达量平均下调了55%。本研究初步得出,云南逸散紫花苜蓿MsVDE基因在调控叶黄素循环应对干热胁迫中起作用。

摘要： 马驽巴贝斯虫是一种寄生于马属动物的血液原虫,给马产业造成巨大的经济损失。本研究旨在建立两种高效、可靠的PCR诊断技术,为进一步提高口岸检疫工作效率奠定基础。根据马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计了一对特异性引物和荧光探针,建立了PCR和qPCR检测方法,测试了两种方法的特异性、灵敏性、稳定性。结果显示:建立的两种方法均具有良好的特异性;PCR方法的最低检出限为4.04×10^(2) copies/μL,qPCR方法的最低检出限为4.04×10^(1) copies/μL;对33份马血样品进行检测,结果qPCR检出的阳性样品数为23份(69.7%),而PCR检出的阳性样品数为9份(27.3%)。表明两种方法均可成功用于马驽巴贝斯虫的检验,但是荧光定量PCR方法的灵敏度明显优于PCR方法。

摘要： 灰霉病是月季采后和运输过程中危害最严重的真菌病害。MPK3基因参与植物对逆境的响应。基于古老月季品种‘月月粉’(Rosa chinensis‘Old Blush’Jacq.)全基因组数据,利用RT-PCR技术获得了包含完整ORF区的RcMPK3基因,并对其进行生物信息学分析和功能检测。结果显示:RcMPK3基因ORF序列长1113 bp,编码370个氨基酸,系统进化树分析结果表明RcMPK3蛋白与FvMPK3蛋白聚为一支;对基因全长序列分析发现,RcMPK3由6个外显子和5个内含子构成,启动子序列包含10类响应激素和逆境相关的顺式元件;qPCR分析表明,RcMPK3受SA和JA诱导表达,同时,在灰霉病菌(Botrytis cinerea)侵染过程中,RcMPK3基因表达量也显著提高;VIGS分析发现,基因沉默株系病斑直径显著大于对照组株系,表明RcMPK3基因可能正向调控月季对灰霉病菌的抗性。

摘要： 双锯鱼(Amphiprion)亦称为海葵鱼,又称为小丑鱼,是一类经济价值较高的海水观赏鱼。目前国内在双锯鱼的胚胎发育、人工饲养以及形态学观察等方面已经取得了有效成果,但在分子生物学水平上对其基因表达的研究较少。为了筛选出适用于双锯鱼胚胎不同发育阶段以及成鱼组织的内参基因,分析酪氨酸酶(TYR)基因的表达情况,以眼斑双锯鱼(A.ocellaris)和白条双锯鱼(A.frenatus)为材料,利用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)对18SrRNA、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)、Ef-1α(转录延伸因子基因)和β-actin(β-肌动蛋白基因)这4个候选内参基因的表达水平进行检测,同时通过geNorm和Norm Finder软件对其稳定性进行评估,最后以合适的内参基因作为参考,研究TYR mRNA的表达水平。结果表明,在双锯鱼胚胎的不同发育阶段,18S和β-actin的表达量相对于其他基因较为稳定;在双锯鱼的不同组织中,稳定性依次为18S>β-actin>Ef-1α>GAPDH。以18S作为内参基因时分析发现TYR基因的表达在双锯鱼胚胎发育过程中呈先上升后下降的趋势,在体节期表达量最高;在双锯鱼各组织中均有表达,且在眼、尾和红皮中表达量最高。

摘要： miRNAs在非生物胁迫中起着重要的作用。通过前期对露地菊Small RNA高通量测序数据测得到miR398a成熟体和前体序列,命名为cgr-miR398a和cgr-MIR398a。序列对比显示,cgr-miR398a与其他植物中已经鉴定的miR398a序列高度保守;利用前期露地菊降解组数据获得miR398a预测的靶基因,cgr-miR398a根和叶中的靶基因共有18个,其中有铜/锌超氧化物歧化酶(CSD2)、铜伴侣蛋白(CCS)、类A20/AN1-l锌指家族蛋白(SAP8)等与抗性相关的基因。qPCR结果显示盐胁迫下露地菊miR398a及靶基因在不同组织部位的表达水平存在显著的负相关性。为探究cgr-miR398a响应盐胁迫的功能,克隆cgr-MIR398a并构建过表达载体转化拟南芥。结果表明,拟南芥中过表达cgr-MIR398a降低了盐胁迫下种子发芽率以及成苗期的抗盐性,说明cgr-miR398a在拟南芥响应盐胁迫中起着负调控作用。这为进一步研究露地菊mi398a的功能和露地菊的抗盐机理奠定了基础。

摘要： Tomato(Solanum lycopersicum)is a model plant for research on fruit development and stress response,in which gene expression analysis is frequently conducted.Quantitative PCR(qPCR)is a widely used technique for gene expression analysis,and the selection of reference genes may affect the accuracy of results and even conclusions.Although there have been some frequently used reference genes in tomato,it has been shown that the expressions of some of these genes are not constant in different tissues and environmental conditions.Moreover,little information on genomic identification of reference genes is available in tomato.Here,we mined the publicly available transcriptional sequencing data and screened out fifteen candidate reference genes,and the expression stability of these candidate genes and seven traditionally used ones were evaluated under stress and hormone treatment.The results showed that over half of the selected candidate references were housekeeping genes in tomato cells.Among the candidate reference genes and the traditionally used ones,the most stably expressed genes varied under different treatments,and most of these genes were recommended as preferred reference genes at least once except Solyc04g009030 and Solyc07g066610,two traditionally used reference genes.This study provides some novel reference genes in tomato,and the preferred reference genes under different environmental stimuli,which may be useful for future research.Our study suggests that excavating stably expressed genes from transcriptome sequencing data is a reliable approach to screening reference genes for qPCR analysis.

摘要： 【目的】土传病原真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii严重威胁园林绿化植物正常生长。建立针对这2种土壤病原真菌的快速定量检测方法。【方法】通过筛选2种病原菌特异性引物,优化反应条件。【结果】初步建立了2种病原菌的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR可以分别用于立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR检测,其灵敏度分别达24×10^(6)和22×10^(6)拷贝·L,2次重复反应的变异系数分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%。对上海绿地土壤样品的检测结果表明:立枯丝核菌和齐整小核菌的检出率分别为100%和19%。【结论】建立的qPCR检测方法具有较强特异性、较高灵敏度和较强重复性,可以用于上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、有效定量检测。

摘要： 目的 克隆黄连(Coptis chinensis Franch.)中自然抗性相关巨噬细胞蛋白(Natural ResistanceAssociated Macrophage Protein,NRAMP)的编码基因,并进行生物信息学分析。方法 从黄连基因组中比对NRAMP3基因,并根据比对的基因序列设计特异性引物,经PCR扩增得到的黄连NRAMP3编码序列,进行克隆、测序和生物信息学分析,并利用qPCR技术对黄连NRAMP3基因进行时空表达分析。结果 得到黄连NRAMP3基因cDNA序列,全长1617 bp,编码538个氨基酸,通过与GenBank上的其他蛋白序列比对,将其命名为CcNRAMP3;序列分析显示,黄连NRAMP3基因编码的氨基酸序列包含一个典型的NRAMP结构域(PF01566),有12个跨膜结构域,亚细胞定位于液泡膜上,具有疏水性强的特点。二级结构中肽链构象主要包括α-螺旋与无规则卷曲两部分;三级结构模型具有葡萄球菌锰转运突变体(MntH)的晶体结构。利用系统进化关系分析推测它可能具有转运重金属元素Cd功能。对黄连NRAMP3基因的组织表达分析表明,CcNRAMP3基因在黄连叶片中表达量最高。在遭受镉胁迫时,在须根中表达量先升高后降低,该基因很可能主要在根部对镉进行响应并发挥作用。结论 本研究首次通过克隆得到黄连NRAMP3基因,并运用生物信息学方法对其理化性质、结构特征等进行了分析预测,这些结果将为黄连NRAMP3基因的功能研究以及其对镉转运的调控机制提供理论依据和基因资源。

摘要： 目的高通量测试脂质在社区获得性肺炎合并脓毒症患者血液中的含量,筛选出可能作为社区获得性肺炎合并脓毒症诊断的生物标志物。方法[HTSS]将我院呼吸与危重症医学科确诊的社区获得性肺炎合并脓毒症患者30例及同时段健康体检志愿者16例纳入研究,对外周血进行质谱分析,检测脂质分子的类型、代谢产物的含量变化,并对相关的脂质代谢基因进行定量检测,通过统计学分析,评估脂质分子及相关代谢基因的变化对社区获得性肺炎合并脓毒症的诊断价值。结果[HTSS]社区获得性肺炎合并脓毒症患者血浆中脂质分子LPA18:2、LPA20:4、LPC16:0、LPC18:2、LPE16:0、LPE18:2、LPE18:1、S1P、LPC18:1、LPC18:0及LPE18:0低表达且负相关(均P<0.004);Cer16:0、Cer18:0、Cer20:0高表达且正相关(均P<0.003)。LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0与社区获得性肺炎合并脓毒症相关性较强,模拟预测的准确度为分别为:0.95、0.89、0.87及0.86。社区获得性肺炎合并脓毒症患者血浆中的脂质代谢相关基因ATX、LIPH、LPP、LPEAT2、PLA2表达变化显著(均P<0.001)。结论[HTSS]LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0及脂质代谢相关基因可作为筛查社区获得性肺炎合并脓毒症的候选分子标志物。

摘要： 本文探讨了硒对鸡胚成肌细胞硒蛋白W表达的影响，以不同硒含量(0.0116 μg·mL-1硒含量的分化培养液和添加10-6mol/L Na2seO3的分化培养液)培养液培养原代培养鸡胚成肌细胞，分别在0、1、3、5、7、9、11 d应用实时荧光定量PCR法检测成肌细胞内的selw、SecS及SPS1 mRNA表达水平。结果显示，加硒可提高SelW的表达水平，而在各个时间点，SPS1 mRNA水平变化总与SelW mRNA水平的相反，在SPS1水平提高时，同时间点的SelW的水平出现下降(第9 d除外)；加硒后SecS水平在和对照组比较时，在5 d和7 d时与SelW水平的变化相反，而在9 d和11 d时与SelW水平一致。提示硒能够通过调节与硒蛋白合成与代谢相关分子的mRNA表达水平来调控SelW的转录，补硒能够在不同时间点调节SecS、SPS1 mRNA表达水平，而使SelW的水平提高。

摘要： 本文探讨了硒对鸡胚成肌细胞硒蛋白W表达的影响，以不同硒含量(0.0116 μg·mL-1硒含量的分化培养液和添加10-6mol/L Na2seO3的分化培养液)培养液培养原代培养鸡胚成肌细胞，分别在0、1、3、5、7、9、11 d应用实时荧光定量PCR法检测成肌细胞内的selw、SecS及SPS1 mRNA表达水平。结果显示，加硒可提高SelW的表达水平，而在各个时间点，SPS1 mRNA水平变化总与SelW mRNA水平的相反，在SPS1水平提高时，同时间点的SelW的水平出现下降(第9 d除外)；加硒后SecS水平在和对照组比较时，在5 d和7 d时与SelW水平的变化相反，而在9 d和11 d时与SelW水平一致。提示硒能够通过调节与硒蛋白合成与代谢相关分子的mRNA表达水平来调控SelW的转录，补硒能够在不同时间点调节SecS、SPS1 mRNA表达水平，而使SelW的水平提高。

摘要： 本文探讨了硒对鸡胚成肌细胞硒蛋白W表达的影响，以不同硒含量(0.0116 μg·mL-1硒含量的分化培养液和添加10-6mol/L Na2seO3的分化培养液)培养液培养原代培养鸡胚成肌细胞，分别在0、1、3、5、7、9、11 d应用实时荧光定量PCR法检测成肌细胞内的selw、SecS及SPS1 mRNA表达水平。结果显示，加硒可提高SelW的表达水平，而在各个时间点，SPS1 mRNA水平变化总与SelW mRNA水平的相反，在SPS1水平提高时，同时间点的SelW的水平出现下降(第9 d除外)；加硒后SecS水平在和对照组比较时，在5 d和7 d时与SelW水平的变化相反，而在9 d和11 d时与SelW水平一致。提示硒能够通过调节与硒蛋白合成与代谢相关分子的mRNA表达水平来调控SelW的转录，补硒能够在不同时间点调节SecS、SPS1 mRNA表达水平，而使SelW的水平提高。

摘要： 本文探讨了硒对鸡胚成肌细胞硒蛋白W表达的影响，以不同硒含量(0.0116 μg·mL-1硒含量的分化培养液和添加10-6mol/L Na2seO3的分化培养液)培养液培养原代培养鸡胚成肌细胞，分别在0、1、3、5、7、9、11 d应用实时荧光定量PCR法检测成肌细胞内的selw、SecS及SPS1 mRNA表达水平。结果显示，加硒可提高SelW的表达水平，而在各个时间点，SPS1 mRNA水平变化总与SelW mRNA水平的相反，在SPS1水平提高时，同时间点的SelW的水平出现下降(第9 d除外)；加硒后SecS水平在和对照组比较时，在5 d和7 d时与SelW水平的变化相反，而在9 d和11 d时与SelW水平一致。提示硒能够通过调节与硒蛋白合成与代谢相关分子的mRNA表达水平来调控SelW的转录，补硒能够在不同时间点调节SecS、SPS1 mRNA表达水平，而使SelW的水平提高。

摘要： 本申请涉及qPCR模块及模块化的qPCR装置，其中，qPCR模块包括光学检测模块及热循环模块；光学检测模块具有静态的光源结构及与光源结构相匹配的接收检测结构；热循环模块包括基座及半导体制冷件，基座与半导体制冷件相接触设置，且半导体制冷件用于与散热件相接触设置；基座开设有预定数量的管孔以及光路，各管孔与各光路一一对应设置，接收检测结构用于通过光路接收光源结构所发出的光线。提供了简单、紧凑的模块化的qPCR仪方案，采用了静态光源及静态散热，仪器内部结构简单且无须采用运动部件，易于制造，没有运动部件，稳定可靠；且能快速、稳定地实现PCR扩增，并且形成模块化的设计，能够方便的组合形成各通量的PCR仪。

摘要： 本申请涉及qPCR模块及模块化的qPCR装置，其中，qPCR模块包括光学检测模块及热循环模块；光学检测模块具有静态的光源结构及与光源结构相匹配的接收检测结构；热循环模块包括基座及半导体制冷件，基座与半导体制冷件相接触设置，且半导体制冷件用于与散热件相接触设置；基座开设有预定数量的管孔以及光路，各管孔与各光路一一对应设置，接收检测结构用于通过光路接收光源结构所发出的光线。提供了简单、紧凑的模块化的qPCR仪方案，采用了静态光源及静态散热，仪器内部结构简单且无须采用运动部件，易于制造，没有运动部件，稳定可靠；且能快速、稳定地实现PCR扩增，并且形成模块化的设计，能够方便的组合形成各通量的PCR仪。

摘要： 本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及用于探针法qPCR的Taq DNA聚合酶突变体。本发明中基于探针法qPCR对Taq DNA聚合酶突变体进行设计、表征和筛选，采用快速扩增时间(延伸期1秒)的循环过程，获得了部分Taq DNA聚合酶突变体。与野生型Taq DNA聚合酶相比，本申请提供的突变体具有快速检测扩增结果的特点，这显著降低了qPCR过程所需的总时间，提高了qPCR或实时qPCR的检测效率。因此，本申请提供的突变体具有较大的经济优势。本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体可以用于常规的qPCR检测，包括基因表达分析和其他DNA定量检测。

摘要： 本发明公开了一种单细胞内原位qPCR方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)将细胞消化，吹打成为单细胞悬液，去上清，将细胞沉淀重悬，加入甲醛溶液进行固定，之后加入Triton溶液进行打孔，去上清，将细胞沉淀重悬；(2)采用分子信标探针进行探针法RT‑qPCR。本发明的qPCR方法能看到单个细胞层面表达量的差异；不用将细胞分为单个细胞，不裂解细胞，而是让qPCR试剂和探针进入细胞内部，在细胞内部进行qPCR反应，方法简便快捷易操作。

摘要： 本发明基于TaqMan探针，建立了一套利用qPCR（实时荧光定量PCR）技术快速鉴别美洲大蠊药材的方法，设计了一对特异性引物及一条特异性探针。采用特异性引物组，对美洲大蠊待测样品的基因组DNA进行实时荧光定量PCR，通过探针在反应过程中，荧光信号的变化对样品进行定性和定量的检测。本方法具有操作方便、快速（1.5 h之内）、省时及准确等优势。

摘要： 本发明公开了一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，其特征在于：相关试剂为引物，荧光探针，定量试剂，血清稀释液，包括步骤一，收集样品；步骤二，加入引物；步骤三，加入荧光探针；步骤四，样品扩增；步骤五，荧光定量PCR仪检测；步骤六，对比血清稀释；步骤七，稀释血清PCR仪检测；步骤八，数据对比分析。本发明利用实时荧光定量PCR方法测定血液中病毒核酸的含量，因此不必等到猪体内产生抗体，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定，不仅可以提高一种猪繁殖与呼吸道综合征诊断的准确度还能对病毒的扩增进行预测判断，为后期的治疗提供了一定思路，还能起到推动猪繁殖与呼吸综合征病毒防控工作的效果。

摘要： 本发明公开了一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方法，建立qPCR反应体系，其配制如下，在20μL反应体系中，加入TaqMan Fast Advanced Master Mix、VSVG引物及探针、ALB引物及探针、1μL DNA模板，用去离子水补足至20μL。本发明所提的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方法，能够在同一反应孔中进行2个基因的扩增，可以使用更少的样品体积，减少反应孔间的差异，减少加样误差，节省试剂，节约经费开支。

摘要： 本发明公开一种双通道QPCR仪的系统电路，包括主控板、荧光激发模块、荧光探测模块、温度探测模块、功率驱动模块、与功率驱动模块连接的温控模块，以及为整个系统供电的电源模块；所述主控板上还设有控制处理模块，以及与控制处理模块连接的信号采集转换模块；所述荧光探测模块和温度探测模块均与信号采集转换模块连接，荧光激发模块和功率驱动模块均与控制处理模块连接。本发明将QPCR仪的电路设计高度集成化、精简化，能较大程度地缩短开发周期，降低开发难度，另外，在产品达到高性能水平的同时，能够实现低成本，免维护，更利于QPCR普及使用。

摘要： 本发明公开了一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR‑T细胞产品中RCR阴阳性的方法，其特征在于，包括如下步骤：全血样品抽取DNA，通过合成含有目的基因和内参基因的质粒，用于配制标准曲线和质控样品，并建立多重qPCR反应体系来检测样品中的RCR。特异性强：针对目的基因设计了特异性探针，在特异性评估中验证通过。灵敏度高：反应更灵敏，方法的检测下限能够达到10copies/μL。省时省力：qPCR检测RCR的方法操作简单，更易入手，反应时间只需1小时。

摘要： 本发明公开了一种高通量qPCR(HT‑qPCR)芯片，该芯片含有能检测微生物重金属抗性基因的引物集，本发明针对环境中常见的9种重金属(Cu、Ag、Hg、Cr、Zn、Pb、Ni、Co、Cd)共设计了57个相关抗性基因的引物集。通过验证，该芯片覆盖范围广，特异性好，灵敏度高，重复性强，数据可靠，可成功应用于环境样品中的微生物重金属抗性基因检测和研究，该芯片还具有可精确定量、高通量、成本低等优点，是研究环境中重金属抗性组的可靠手段。