亚洲玉米螟肠道免疫关键基因OfPGRP6及其应用

摘要

本发明公开了亚洲玉米螟肠道免疫关键基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及基因工程领域，具体涉及亚洲玉米螟肠道免疫关键基因

背景技术

亚洲玉米螟是一种危害范围广，影响范围大的农业害虫，对玉米和高粱等经济作物造成严重危害。而亚洲玉米螟作为昆虫缺乏脊椎动物特有的获得性免疫系统，主要依靠自身的天然免疫系统抵抗外来病原体的入侵，包括细菌、真菌、病毒或寄生虫，具体过程由模式识别受体对多种病原体相关分子模式的特异性识别而触发的。其中，模式识别受体中的肽聚糖识别蛋白是一类从哺乳动物到昆虫都保守的信号转导受体，能特异性识别肽聚糖，触发昆虫天然免疫反应，杀死和清除病原体。

由于亚洲玉米螟在玉米等经济作物上危害严重，所以科研工作者一直希望找到影响亚洲玉米螟天然免疫系统的关键基因，以提高对玉米等作物的保护，增加农作物产量。通过基因组和转录组数据筛选并鉴定可能的

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了亚洲玉米螟肠道免疫关键基因

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

亚洲玉米螟肠道免疫调控的关键基因

ATGGCCCGTCTTACATTAGCTGTTGTTATCATTAGTTTCATCTTCAGCTGCTCGACACACCCTACAAACAAATTGGCGAAGACCAGCCCCTATAACTTCCCGTTCGTGACGAAAGAAGAATGGGAAGGCAGGCCCCCCACAGATGTATTCCCCATGGAAACTCCAGTACCATACGTGGTGATTCACCATACGTACATACCTGACGTGTGCTATACGTCAGATGAGTGCAAATCCGCTATGCGGGGCATGCAGAACTTCCACCAGTTGACAAACGGATGGGCGGATATTGGATACAGTTTTGCGGTGGGCGGAGATGGCAAGGTATACGAAGGTCGCGGATGGGAAGCAGTTGGCGCCCACGCTGTAGGTGTGAATACCAGGAGTATCGGGATCGCTCTCATTGGAGACTTTGTTTCAAAATTGCCGTCGGAAACTCAACTAGCCCCAGTACATAAGCTGATCGCTACAGGAGTCGAACTCGGGTACATCAGGCCCGACTACACTCTCATCGGCCACCGCGCGGTGTCCGCTACCGAGTGTCCTGGAGGAGCCCTATTCCAGGAGATCAGCACGTGGCCCCACTTTGACAAAGAAGTATCCGAAAACCAACCGACGACTGAGGCTGTTACACAATTAAATTAA。

作为改进的是，所述

MARLTLAVVIISFIFSCSTHPTNKLAKTSPYNFPFVTKEEWEGRPPTDVFPMETPVPYVVIHHTYIPDVCYTSDECKSAMRGMQNFHQLTNGWADIGYSFAVGGDGKVYEGRGWEAVGAHAVGVNTRSIGIALIGDFVSKLPSETQLAPVHKLIATGVELGYIRPDYTLIGHRAVSATECPGGALFQEISTWPHFDKEVSENQPTTEAVTQLN。

上述的亚洲玉米螟肠道免疫关键基因

步骤1，设计引物序列

正向引物F：5'-TACATATGCACCCTACAAACAAATTGGC-3'，

反向引物R:5'-TACTCGAGATTTAATTGTGTAACAGC-3'，

步骤2，PCR扩增

以亚洲玉米螟的全虫或组织的 cDNA 为模板进行扩增，PCR 反应条件为 ：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s、57℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共 30 个循环，最后72℃延伸 10 min ；琼脂糖凝胶电泳分析扩增的PCR产物并通过胶回收试剂盒（OMEGA）进行胶回收；

将回收后的PCR产物与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明

一种重组质粒，所述重组质粒含有所述的关键基因

一种重组载体，表达上述的重组质粒。

上述的重组载体的构建方法，其特征在于：以pET28a空载体,选用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ为酶切位点，酶切位点后添加6×His标签，将获得的含有目的基因的T克隆和pET28a空质粒分别用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，分别回收目的片段，以T4连接酶连接并转化BL21感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，获得正确的pET28a-His-OfPGRP6的重组质粒。

上述的关键基因

作为改进的是，所述药物包括化学药物或靶向生物药物。

有益效果：

与现有技术相比，本发明亚洲玉米螟肠道免疫关键基因

附图说明

图1是通过RT-PCR检测

图2是通过ELISA实验检测OfPGRP6蛋白对于不同菌体的不同细胞壁成分的结合能力；

图3是通过凝集实验检测OfPGRP6蛋白对不同微生物菌体是否具有凝集作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

需要交代的是，本发明所用菌株均为本领域市售菌株。

实施例1：

1. 通过 qRT-PCR 检测

以5龄1天亚洲玉米螟的中肠、脂肪体、血、头、血和表皮的cDNA 作为模板，以基因的特异引物PGRP6-qF：TATGCGGGGCATGCAGAACT，PGRP6-qR：CCCATCCGCGACCTTCGTAT进行 RT-PCR 检测，PCR扩增条件为 ：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，每隔5 s产生58 ℃至95℃的熔融曲线，以玉米螟核糖体蛋白

此处需要说明的是，本发明亚洲玉米螟为江苏省镇江市润州区野外采集的。

2. 通过 qRT-PCR 检测

选择同一批次生长状态相同的亚洲玉米螟幼虫分别注射2 μl浓度为1×10

3. 结果

如图 1 所示检测结果表明该基因在亚洲玉米螟中肠中的表达量极高，经过大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的诱导，其转录水平显著上升，其组织特异性和诱导性确实说明它在亚洲玉米螟对外源微生物感染的免疫应答中具有重要的功能。

实施例2：

（1）设计引物：

正向引物F：5'-TACATATGCACCCTACAAACAAATTGGC-3'，

反向引物R:5'-TACTCGAGATTTAATTGTGTAACAGC-3'，

步骤2，PCR扩增

以亚洲玉米螟的全虫或组织的 cDNA 为模板进行扩增，PCR 反应条件为 ：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s、57℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共 30 个循环，最后72℃延伸 10 min ；琼脂糖凝胶电泳分析扩增的PCR产物并通过胶回收试剂盒（OMEGA）进行胶回收。

将回收后的PCR产物与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明

（2）将获得的含有目的基因的T克隆和pET28a空质粒分别用

实施例3：OfPGRP6重组蛋白的功能研究

1. 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白OfPGRP6与不同菌体细胞壁成分的结合能力

具体实验设计为：使用枯草芽孢杆菌(

2. 将获得纯化后的OfPGRP6蛋白进行凝集试验的功能研究，具体实验设计为：

收集过夜培养的大肠杆菌（

3. 结果

如图2所示包被枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)和藤黄微球菌(M.luteus)的肽聚糖（PGN）和大肠杆菌0111：B4(Sigma)的脂多糖（LPS）的实验组的吸光度值比未包被（No-coated）的对照组的吸光度值高，说明重组蛋白OfPGRP6对来自不同菌体的不同细胞壁组分具有结合能力，其中与革兰氏阳性菌的藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌的细胞壁组分PGN具有较强的结合能力，而与革兰氏阴性菌的大肠杆菌的细胞壁组分LPS结合能力较弱。

如图3所示以BSA作为对照组的大肠杆菌、藤黄微球菌和毕赤酵母的不同菌体呈均匀分散分布，OfPGRP6在无Zn

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 江苏科技大学

<120> 亚洲玉米螟肠道免疫关键基因OfPGRP6及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcccgtc ttacattagc tgttgttatc attagtttca tcttcagctg ctcgacacac 60

cctacaaaca aattggcgaa gaccagcccc tataacttcc cgttcgtgac gaaagaagaa 120

tgggaaggca ggccccccac agatgtattc cccatggaaa ctccagtacc atacgtggtg 180

attcaccata cgtacatacc tgacgtgtgc tatacgtcag atgagtgcaa atccgctatg 240

cggggcatgc agaacttcca ccagttgaca aacggatggg cggatattgg atacagtttt 300

gcggtgggcg gagatggcaa ggtatacgaa ggtcgcggat gggaagcagt tggcgcccac 360

gctgtaggtg tgaataccag gagtatcggg atcgctctca ttggagactt tgtttcaaaa 420

ttgccgtcgg aaactcaact agccccagta cataagctga tcgctacagg agtcgaactc 480

gggtacatca ggcccgacta cactctcatc ggccaccgcg cggtgtccgc taccgagtgt 540

cctggaggag ccctattcca ggagatcagc acgtggcccc actttgacaa agaagtatcc 600

gaaaaccaac cgacgactga ggctgttaca caattaaatt aa 642

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 蛋白序列(Protein Sequence)

<400> 2

Met Ala Arg Leu Thr Leu Ala Val Val Ile Ile Ser Phe Ile Phe Ser

1 5 10 15

Cys Ser Thr His Pro Thr Asn Lys Leu Ala Lys Thr Ser Pro Tyr Asn

20 25 30

Phe Pro Phe Val Thr Lys Glu Glu Trp Glu Gly Arg Pro Pro Thr Asp

35 40 45

Val Phe Pro Met Glu Thr Pro Val Pro Tyr Val Val Ile His His Thr

50 55 60

Tyr Ile Pro Asp Val Cys Tyr Thr Ser Asp Glu Cys Lys Ser Ala Met

65 70 75 80

Arg Gly Met Gln Asn Phe His Gln Leu Thr Asn Gly Trp Ala Asp Ile

85 90 95

Gly Tyr Ser Phe Ala Val Gly Gly Asp Gly Lys Val Tyr Glu Gly Arg

100 105 110

Gly Trp Glu Ala Val Gly Ala His Ala Val Gly Val Asn Thr Arg Ser

115 120 125

Ile Gly Ile Ala Leu Ile Gly Asp Phe Val Ser Lys Leu Pro Ser Glu

130 135 140

Thr Gln Leu Ala Pro Val His Lys Leu Ile Ala Thr Gly Val Glu Leu

145 150 155 160

Gly Tyr Ile Arg Pro Asp Tyr Thr Leu Ile Gly His Arg Ala Val Ser

165 170 175

Ala Thr Glu Cys Pro Gly Gly Ala Leu Phe Gln Glu Ile Ser Thr Trp

180 185 190

Pro His Phe Asp Lys Glu Val Ser Glu Asn Gln Pro Thr Thr Glu Ala

195 200 205

Val Thr Gln Leu Asn

210

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacatatgca ccctacaaac aaattggc 28

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tactcgagat ttaattgtgt aacagc 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatgcggggc atgcagaact 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccatccgcg accttcgtat 20