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一种亚洲玉米螟Doublesex基因突变体及其构建方法和应用

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本发明属于病虫害防治领域，涉及亚洲玉米螟，特别是指一种亚洲玉米螟Doublesex基因突变体及其构建方法和应用。本发明以鳞翅目害虫亚洲玉米螟为研究对象，结合第三代CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了亚洲玉米螟显微注射体系和基因编辑体系。本发明以亚洲玉米螟重要性别决定基因Dsx为靶标基因，构建了Dsx突变体，通过表型观察和生测确定了，亚洲玉米螟Dsx突变导致蛹期和成虫期外生殖器畸形，成虫期突变体表现为雌雄不育，构建了亚洲玉米螟雌雄不育品系。该发明提供了敲除亚洲玉米螟的技术体系和提供了亚洲玉米螟不育品系，为亚洲玉米螟的绿色防控提供理论基础和应用。

著录项

公开/公告号CN114807144A

专利类型发明专利
公开/公告日2022-07-29

原文格式PDF
申请/专利权人河南大学;
展开▼

申请/专利号CN202210598480.0
发明设计人毕洪论;黄勇平;周树堂;李小卫;徐霞;王耀辉;
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申请日2022-05-30
分类号C12N15/113;C12N15/55;C12N15/89;A01K67/033;
代理机构郑州优盾知识产权代理有限公司;
代理人冉珊敏
地址 450046 河南省郑州市郑东新区明理路北段379号
入库时间 2023-06-19 16:09:34

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2022-07-29

公开

发明专利申请公布

说明书

技术领域

本发明属于病虫害防治领域，涉及亚洲玉米螟，特别是指一种亚洲玉米螟

背景技术

亚洲玉米螟(

随着分子生物学技术的不断发展，缺少高效的染色体和基因组标记手段成为了限制发展的主要瓶颈，而基因组编辑技术也在越来越多的领域发挥作用。基因组编辑是一种用来精确而有效地修饰DNA的技术，它涉及利用工程核酸酶在特定的DNA序列上进行切割，从而达到添加、删除或改变基因组中DNA序列的目的。锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease,ZFNs）作为第一代基因组编辑技术技术自21世纪初开始发挥作用，到2006年发展起来的第二代的类转录激活因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALENs)基因组编辑技术，以及2013年开始兴起的RNA靶向编辑（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats/Cas9，CRISPR/Cas9）技术，使得包括非模式生物在内的诸多生物的基因组编辑成为可能。基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术在诸多非模式物种中发挥功能，有效解决了RNAi技术在鳞翅目昆虫基因功能研究中的不足，并有望在害虫防治和遗传调控中发挥作用。

目前，基于CRISPR/Cas9基因组编辑系统在害虫种群控制方面，主要集中体现在两种方法，基因驱动（Gene Drive）在媒介类害虫蚊子中的应用和可遗传的CRISPR/Cas9介导的性别特异性不育基因应用。前者主要借助于CRISPR/Cas9基因组定点敲入系统，将敲除元件（Cas9和sgRNA）定点整合到sgRNA靶标位点，然后通过稳定表达的敲除元件对等位靶点进行切割，再利用同源修复方式在归巢过程中将敲除元件整合到等位靶点，使得靶标基因的两条染色体都带有了敲除元件。这种超孟德尔遗传定律的遗传方式，使得在冈比亚按蚊(

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种亚洲玉米螟

本发明的技术方案是这样实现的：

一种亚洲玉米螟

（1）提取亚洲玉米螟的总RNA，并反转录获得cDNA，设计sgRNA靶标位点；

（2）构建CRISPR/Cas9敲除体系，分别制备Cas9 mRNA和sgRNA；

（3）将Cas9 mRNA和sgRNA的混合物显微注射到亚洲玉米螟卵中，经培养获得突变体。

进一步，所述步骤（1）中sgRNA靶标位点位于

进一步，所述sgRNA靶标位点的序列为5’-GGTGTCCCTAGAAACCCTGGTGG-3’。

进一步，所述步骤（3）中Cas9 mRNA和sgRNA在混合物中的终浓度均为300 ng/μL。

注射到亚洲玉米螟卵的位置在亚洲玉米螟卵近尖端1/3处。

培养的条件为温度25±2℃，相对湿度50%，光暗周期L：D 为16h：8h。

上述的构建方法制备的亚洲玉米螟

上述的亚洲玉米螟

上述的构建方法在制备雌雄不育的亚洲玉米螟突变体中的应用。

上述的构建方法在防治亚洲玉米螟病害中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明以鳞翅目害虫亚洲玉米螟为研究材料，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，以性别决定关键基因

2、本申请以性别决定关键基因

3、本发明的

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为亚洲玉米螟显微注射示意图。

图2为亚洲玉米螟

图3为亚洲玉米螟

图4为亚洲玉米螟

图5为亚洲玉米螟

图6为亚洲玉米螟

图7为PTD-Cas9质粒的图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1基因时空表达谱的构建

收集适量亚洲玉米螟卵、各龄期幼虫、蛹、成虫（4龄以后雌、雄分开收集）；收集5龄幼虫雌、雄个体，分别解剖收集头、前肠、中肠、后肠、马氏管、脂肪体、表皮、血淋巴、生殖腺（卵巢、精巢）；提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，Nano Drop超微量分光光度计测定RNA浓度；利用TaKaRa PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录获得cDNA，其中

构建CRISPR/Cas9敲除体系

依据GGN

胚胎显微注射

亚洲玉米螟胚胎显微注射利用课题组现有的显微注射仪完成，全部过程应在亚洲玉米螟卵产后2小时内全部完成。收集亚洲玉米螟新卵块并排布于玻璃载玻片，底部加水粘贴吸附，甲醛熏蒸5分钟，进行表面消毒。配制终浓度sgRNA300 ng/μL、Cas9 mRNA 300 ng/μL注射体系，现配现用。

在实验室建立人工饲养亚洲玉米螟室内种群的基础上，申请人根据对亚洲玉米螟产卵情况的不断观察和深入研究，发现亚洲玉米螟成块状产卵，每卵块大约有100枚卵，显微镜下观察发现卵与卵成鳞片状层叠排布，且卵体较弱不易分离，根据这一特点进行亚洲玉米螟胚胎成块依次进行显微注射，如图1所示，注射位点选择于亚洲玉米螟卵近尖端1/3处。注射后的卵放于恒温培养箱中，温度25±2℃，相对湿度50%，光暗周期16：8（L：D）。

突变体的筛选和鉴定

敲除突变体的筛选主要依赖于表型上的变化。首先筛选出在外在表形，如体型、足型、翅型、触角形状、复眼形状等出现显著变化的个体，提取DNA、扩增、测序检测靶点处是否出现碱基插入、缺失等造成的基因移码突变，确认外在表型变化是源于靶标基因的敲除突变。若无显著外在表型变化，则解剖观察5龄幼虫、蛹、成虫的卵巢、精巢等生殖系统器官的变化。表型变化检测首选普通光学显微镜，对复眼、触角等超微结构的变化检测则采用扫描电镜。另外，在基因组水平上进行突变体鉴定后，提取突变个体总RNA，利用qPCR进一步检测突变个体靶标基因的转录水平变化，进而确认基于CRISPR/Cas9系统的基因敲除体系可在鳞翅目害虫亚洲玉米螟中成功使用。

根据sgRNA靶点设计原则，在

分析突变品系遗传稳定性

对可依据外在表型变化鉴定出的突变品系进行遗传稳定性分析。收集获得的亚洲玉米螟成虫突变体并进行单头饲养。与野生型个体杂交，检测是否可正常交配，产卵是否正常，卵表型是否有变化、卵是否正常孵化、后代有无突变表型等。通过连续多代杂交饲养，检测突变品系的遗传稳定性。

如图3所示，亚洲玉米螟在蛹期时，雌雄生殖孔存在明显的二态性，其中雌性的生殖孔呈现Y字形，而雄性的生殖孔两侧则有两个明显的点状凸起。当

如图4所示，亚洲玉米螟成虫的外生殖器也存在明显的二态性，其中雌性具有排列整齐的刚毛，形态规则的腹侧板，雄性具有抱握器，阳茎和爪形钩，雌雄外生殖器的不同则代表雌雄在生殖发育方面存在差异。当

此外，本申请还发现成虫的身体着色有明显的性二态性，如图5所示，雌性成虫体色略浅，翅膀纹路不明显，而雄性成虫体色较深，翅膀纹路明显。

为了验证

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南大学

<120> 一种亚洲玉米螟

<141> 2022-05-30

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)

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<213> 亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)

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