靶向SARS-CoV-2 3C蛋白酶的PROTAC分子及其应用

摘要

本发明涉及式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中，M

说明书

技术领域

本申请属于医药领域，具体而言，涉及一类靶向新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 3C蛋白酶的PROTAC(proteolysis targeting chimeras，蛋白降解靶向嵌合体)化 合物、或其药学上可接受的盐、或溶剂化物，还涉及上述化合物的制备方法及其 在制备3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂、特别是抗冠状病毒药物方面的用途。

背景技术

致病病毒SARS-CoV-2主要攻击人体下呼吸道系统，引起病毒性肺炎；也可 能影响胃肠道系统、心脏、肾脏、肝脏和中枢神经系统，严重威胁人类生命健康 安全，给整个社会带来了巨大的负面影响。截至本申请书提交时，全球病例及死 亡人数仍处于急剧上升态势。

从SARS-CoV-2全球各地区爆发的特征来看，该病毒潜伏期长，隐蔽性高(无 症状传染、潜伏期传染、初期症状较轻且与感冒类似)，传染性强(各种传染途 径)，给防治带来了很大的困难。基于该病毒的特征，我们需要做好与SARS-CoV-2 长期共存的准备，在广泛传播之后，该病毒可能在人群中成为地方性流行病。因 此，针对SARS-CoV-2特效药物的研发将是今后一段时间防治新型冠状病毒的重 要方向。

3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3C蛋白酶)，也叫主要蛋白酶，是病毒生命周期 中的关键酶，首先通过自切割多聚蛋白释放蛋白酶本身，进而在肽段上超过11个 位点进行切割，产生复制、转录相关的各类蛋白。3C蛋白酶在调节病毒生活周期、 基因表达中发挥重要作用，同时与人体自身蛋白无明显同源性，所以是抗冠状病 毒药物研发的一个重要靶点。

GC376(CAS 1416992-39-6)是SARS-CoV-2 3C蛋白酶的共价抑制剂，体外 可抑制新型冠状病毒的复制。然而，GC376难以彻底阻断病毒的复制，无法完全 抑制病毒的感染过程。而且现有的对GC376的结构修饰方式通常无法赋予GC376 彻底阻断病毒复制的能力，相反这些修饰方式还可能导致GC376无法进入3C蛋白 酶的活性蛋白结合域、无法与其活性蛋白结合域相互作用、和/或使GC376与3C蛋 白酶的作用机制改变，从而导致GC376与3C蛋白酶的结合能力丧失，无法实现对 3C蛋白酶的有效抑制，更加难以实现彻底阻断病毒复制的目的。

因此，现有技术中亟需一种基于GC376的化合物，这类化合物不仅可以实现 与GC376相当或更强的3C蛋白酶抑制活性，还能够彻底阻断病毒、特别是新型冠 状病毒的复制，抑制其感染过程。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明结合计算化学，充分研究GC376与 SARS-CoV-2 3C蛋白酶的作用方式，在GC376及其系列衍生物的特定位点通过不 同性质的特定连接臂与E3泛素连接酶的配体连接，形成式(I)所示的PROTAC (proteolysis targeting chimeras，蛋白降解靶向嵌合体)分子。本发明通过特定连 接臂的使用以及在GC376的特定位点进行特定基团的修饰，不仅使GC376与3C蛋 白酶的结合能力得以保留，而且还能够使所获得的三元结构的化合物同时与3C蛋 白酶和E3泛素连接酶结合，进而通过E3连接酶招募泛素分子到3C蛋白酶表面，引 起3C蛋白的泛素化降解，从而通过与GC376完全不同的作用机制实现阻断病毒的 复制，抑制其感染过程的目的。本发明通过细胞实验结果发现，本发明的化合物 能够有效抑制抑制新型冠状病毒的活性，而且部分化合物甚至能够实现比GC376 更强的体外抑制新型冠状病毒的活性，EC

具体而言，本发明是通过以下方面实现的：

本发明的第一方面提供了式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂 化物：

其中，M

M

L具有如下式L所示的结构：

-(CH

其中，p为0-5的整数；q为0-5的整数；e为0-6的整数；f为0-3的整数；g为 0-3的整数；h为0-3的整数；i为0-5的整数；j为0-3的整数。

本发明的第二方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：本发明第 一方面所述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物；以及药学上可接受的载体。

本发明的第三方面提供了制备上述式(I)化合物的方法，该方法包括如下步 骤：(1)在3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂上引入末端炔基基团；(2)在E3 泛素连接酶配体上引入叠氮基团；以及(3)使上述末端炔基基团与叠氮基团发生 点击化学反应，以使所述3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂与所述E3泛素连接酶 配体通过共价键连接。

在本发明的第四方面提供了上述式(I)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂 化物在制备3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂、特别是抗冠状病毒药物方面的用途。

具体实施方式

本领域技术人员能够理解的是，下述的实施方式仅作为示例的目的给出，而 并不旨在以任何方式限制本申请的保护范围。

在本文中，除非另有说明，使用的术语“3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂” 是指具有3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制活性的化合物。作为非限制性实例，使用 化合物GC376及其衍生物作为3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂。在本文中，除非 另有说明，使用的术语“3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂部分(M

在本文中，除非另有说明，使用的术语“E3泛素连接酶配体”或“E3泛素 连接酶的配体”是指能够与E3泛素连接酶结合的化合物。不希望被理论所限地， 本领域的E3泛素连接酶配体均可用于本发明。作为非限制性实例，所述E3泛素 连接酶配体可以为VHL配体或CRBN配体。在本文中，除非另有说明，使用的 术语“E3泛素连接酶配体部分(M

在本文中，术语“C

在本文中，除非另有说明，术语“环基”包括脂肪族环基和芳香族环基，是 指由碳原子组成的饱和或不饱和环系。术语“杂环基”包括脂杂环和芳杂环，是 指由碳原子和独立地选自N、O或S中的1-3个杂原子组成的饱和或不饱和环系， 并且可以是取代的或未取代的。作为环基和杂环基的非限制性实例，可列举呋喃 基、噻吩基、吡啶基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、苯基、吡嗪基、嘧啶基、哒 嗪基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环戊烯基和环己烯基，但不仅限于此。

在本文中，术语“三唑部分”是指1,2,3-三唑部分。本领域技术人员将理解这类 三唑部分是在“点击”化学条件下进行的炔/叠氮化物反应环加成反应的产物。可以 通过使用点击化学反应制备本发明的蛋白降解靶向嵌合体类化合物，该化合物在其 连接结构中具有一个或多个三唑部分。术语‘点击化学’是由K.巴里·夏普莱斯教授 (K.BarrySharpless)在2001年创造的，用来描述一系列通过以下各项定义的化学反 应：其模块化性质、高产率、体内产物的稳定性、立体专一性、高原子经济性以及高 热力学驱动力。存在许多‘点击’反应，其中若干种涉及适当官能团之间的环加成反 应以产生稳定的环状结构。

在本文中，除非另有说明，使用的术语“药学上可接受的”是指在合理医学 判断范围内，适用于与人类和动物组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或 其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/ 或剂型。例如，本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指式(I)所示的化合物 与药学上可接受的游离酸或游离碱形成的酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐由以下 酸获得：如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸、亚磷酸、乙酸、 苯甲酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、葡萄糖酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、酒 石酸、富马酸、苹果酸、草酸、琥珀酸等。碱加成盐包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、或镁盐等。

除非另有说明，本文中使用楔形的实线键和虚线键(

除非另有说明，本文提到的立体异构体包括几何异构体和对映异构体，所有这些异构体都在本申请的范围之内。

除非另有说明，本文中使用的其它术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。

本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：

1.式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

其中：

M

M

L具有如下式L所示的结构：

-(CH

其中，p为0-5的整数；q为0-5的整数；e为0-6的整数；f为0-3的整数；g为 0-3的整数；h为0-3的整数；i为0-5的整数；j为0-3的整数。

本发明人结合计算化学发现，通过使M

2.如段落1所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，所述 3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂部分M

其中，R

R

D

3.如段落2所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，R

R

D

4.如段落2或3所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，R

就这方面而言，GC376化合物上的相应结构为HO(NaO

5.如段落2-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其 中，D

6.如段落2-5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其 中，D

7.如段落2-6中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其 中，-D

8.如段落2-7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其 中，-D

本发明人发现，使-D

9.如段落2-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其 中，M

其中，各基团如相应的段落中所定义。

10.如段落1-9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，所述3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶为新型冠状病毒的3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。

不希望被理论所限地，本发明的3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶可以为任何病毒的 3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。作为非限制性实例，3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶为新型 冠状病毒的3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。

11.如段落1-10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，M

12.如段落11所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，M

13.如段落1-12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，所述E3泛素连接酶配体为具有如下结构的VHL配体或CRBN配体：

14.如段落13所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，所述 E3泛素连接酶配体部分M

15.如段落1-14中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，所述化合物具有如下式(II)所示的结构：

其中，各基团如相应的段落中所定义。

16.如段落1-15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，p为1-2的整数；q为0-3的整数；e为2-5的整数；f为0-1的整数；g为0-1 的整数；h为0-1的整数；i为0-2的整数；j为0-1的整数。

17.如段落1-16中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，L中的碳原子总数选自7-9的整数。

本发明人发现，将L中的碳原子总数控制为7-9的整数，使L具有特定长度，有 助于同时确保M

18.如段落1-17中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，L具有如下所示的结构中的一种：

-(CH

-CH

-(CH

19.如段落1-18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，所述化合物具有如下式(III)或式(IV)所示的结构：

其中，各基团如相应的段落中所定义。

20.如段落1-19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，所述化合物具有如下式(V)或式(VI)所示的结构：

其中，各基团如相应的段落中所定义。

21.如段落1-20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物， 其中，所述化合物选自于由如下结构所示的化合物所组成的组：

22.一种药物组合物，所述药物组合物包含：段落1-21中任一项所述化合物 或其药学上可接受的盐或溶剂化物；以及药学上可接受的载体。

23.一种制备段落1-21中任一项所述化合物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)在3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂上引入末端炔基基团；

(2)在E3泛素连接酶配体上引入叠氮基团；以及

(3)使上述末端炔基基团与叠氮基团发生点击化学反应，使所述3-胰凝乳 蛋白酶样蛋白酶抑制剂与所述E3泛素连接酶配体通过共价键连接。

24.段落1-21中任一项所述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或段落 22所述的药物组合物在制备3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶抑制剂方面的用途。

25.段落1-21中任一项所述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或段落 22所述的药物组合物在制备抗冠状病毒药物方面的用途。

除非另有说明，在本文中，术语“患者”、“受试者”和“个体”可互换使 用，并且表示人或非人动物(例如灵长类动物、啮齿动物等)。

除非另有说明，在本文中，代表成分的量或理化性质或者反应条件等的参数 值应当被理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当用术语“约”描述本发明 时，术语“约”表示存在的误差值，例如表示在某一特定值的±10％、例如±1％的 范围内变化。

除非另有说明，在本文中，单数术语涵盖复数术语，并且复数术语涵盖单数 术语。

在本文中，除非另有说明，术语“包含、包括和含有”或等同物为开放式表 述，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分 和步骤。

实施例

接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不仅限于这 些实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述 实施例中所用的试剂、材料和装置等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或可 由本领域技术人员根据本领域的普通技术知识而制备得到。

实施例1：化合物A、B和C的制备

通过如下路线1合成化合物A1、B1和C1，其中化合物4购自上海韶远试剂 有限公司、化合物1和4-O-丙炔苯甲醇购自阿拉丁试剂有限公司。

制备例1-1：化合物A1、B1和C1的合成

步骤1中间体2的合成：化合物1(1.3克，7.60mmol)与4-O-丙炔苯甲醇 (0.9克，5.55mmol)溶于干燥乙腈(30mL)，加入三乙胺1.5mL，室温反应， 2小时后，溶液浓缩，硅胶柱分离，流动相：石油醚/乙酸乙酯＝4/1，得白色固体 1.75克，产率为95％。

步骤2中间体3的合成：化合物2(2.47克，7.73mmol)溶于30mL四氢呋 喃，加入15mL1M的LiOH水溶液，室温搅拌，2小时后，用酸性树脂中和体系 至中性，滤去树脂，浓缩，白色固体直接用于下一步反应。

步骤3中间体5的合成：化合物3(2.1g，6.6mmol)和化合物4(1.23g， 6.6mmol)在氮气保护下溶于30mL干燥DMF，加入HATU(5.0g，13.2mmol) 和DIPEA(1.7g，13.2mmol)，室温反应4小时后，浓缩除去DMF，硅胶柱分离， 流动相：石油醚/乙酸乙酯＝1/5，得白色固体产物2.63g，产率为82％。

步骤4化合物A1的合成：化合物5(1.5g，3.1mmol)在氮气保护下溶于20mL 干燥THF，逐滴滴入LiBH

步骤5化合物B1的合成：化合物A1(400mg，0.90mmol)在氮气保护下溶 于干燥二氯甲烷(5mL)，冰水浴下加入Dess-Martin Periodinane(DMP)(570mg， 1.35mmol)，室温反应，2小时后浓缩，硅胶柱分离。流动相：乙酸乙酯/甲醇＝20/1， 得白色固体产物288mg，产率为70％。

步骤6化合物C1的合成：化合物B1(90mg，0.197mmol)溶于乙酸乙酯(4mL) 和无水乙醇(2.4mL)，加入亚硫酸氢钠(20mg，于185μL H

制备例1-2：化合物A2、B2和C2的合成

按照路线1所示，除了将4-O-丙炔苯甲醇替换为

制备例1-3：化合物A3、B3和C3的合成

按照路线1所示，除了将4-O-丙炔苯甲醇替换为丙炔醇(该化合物购自阿拉丁 试剂有限公司)之外，采用与化合物A1、B1和C1的合成相同的步骤，分别以50％、 40％、32％的收率得到白色固体化合物A3、B3和C3。化合物A2、B2和C2以及 A3、B3和C3的结构如下所示：

实施例2：连接臂与E3连接酶配体(化合物V)的连接

通过如上路线2合成化合物V-C7-N3、V-C8-N3和V-C9-N3以及化合物 R-C7-N3、R-C8-N3和R-C9-N3。其中化合物V和R购自北京百灵威科技有限公 司，连接臂1、2和3购自康龙化成(北京)新药技术股份有限公司，连接臂4、 5和6分别由连接臂1、2和3按照文献(Synthesis，2007，19，3051-3055)的 方法制备得到。

制备例2-1：化合物V-C7-N3、V-C8-N3和V-C9-N3的合成

化合物V(210mg,0.49mmol)与连接臂1(120mg,0.64mmol)溶于干燥DMF (5mL)，加入HATU(370mg,0.97mmol)，室温搅拌40分钟，加入DIPEA(253mg, 1.96mmol)，室温反应2小时后原料反应完全，浓缩，过硅胶柱，流动相：乙酸 乙酯/甲醇＝15/1，得到白色固体235mg，产率为80％。

按照路线2所示，采用与化合物V-C7-N3的合成相同的步骤，分别以85％和82％ 的收率得到白色固体的化合物V-C8-N3和白色固体的化合物V-C9-N3。

制备例2-2：化合物R-C7-N3、R-C8-N3和R-C9-N3的合成

化合物R(250mg,0.92mmol)和连接臂4(282mg,1.37mmol)溶于干燥四氢呋喃(5mL)，溶液回流四小时，然后浓缩，硅胶柱分离，流动相：乙酸乙酯/甲醇＝15/1， 得到白色固体317mg，产率为78％。

按照路线2所示，采用与化合物R-C7-N3的合成相同的步骤，分别以81％和80％ 的收率得到白色固体的化合物R-C8-N3和白色固体的化合物R-C9-N3。

实施例3：模块A/B/C分别通过不同连接基团与E3连接酶的配体相连

制备例3-1：化合物A1-C9-V的合成

化合物A1(15mg，0.03mmol)和V-C9-N3(21mg，0.03mmol)溶于甲醇(2mL) 和二氯甲烷(2mL)的混合溶剂中，加入氯化亚铜(1mg)，室温反应3小时， 浓缩，HPLC分离，分离条件：Angilent C18柱(4μm，9.4×250mm)， 10→70％MeCN，20min，2.5mL/min，在256nm下进行UV监测。得到白色泡沫 状固体26mg，产率为80％。

制备例3-2其它目标化合物的合成：按照路线3所示，采用与化合物A1-C9-V 的合成相同的步骤，分别以其相应的原料得到表1所示的其它目标化合物。

实施例4：本发明的化合物在抗SARS-CoV-2的应用

用DMEM(Gibco，USA)培养基培养非洲绿猴肾Vero细胞，其中DMEM培养 基含有10％胎牛血清(FBS，Gibco，USA)，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的工 作浓度为0.1mg/ml。

所有的感染实验是在生物安全三级(BLS-3)实验室中进行。20mM药物用DMEM (1％双抗)梯度稀释从2μM到0.03125μM，两倍稀释。GC376作为阳性对照，0.1％ 的DMSO作为空白对照。在96孔板加入稀释好的药物，每孔60μL。在已加入60μL 药物的96孔板中，加入60μL200TCID50/100μL的新型冠状病毒(Nature communications，2020，11(1)，1-8)，病毒终浓度100TCID50/100μL。在37℃孵 育1小时细胞洗板，每孔加入100μL孵育后的病毒药物混合液，设置病毒对照(只 加病毒，不加药物)，设置空白对照(不加药物，不加病毒)，设置阳性对照(GC376)， 72小时观察细胞病变情况，根据细胞病变，算出抑制率，利用Graphpad自动求得EC

表2化合物对新型冠状病毒的抑制活性

如表2结果所示，本发明的化合物可以实现与GC376相当或更强的新型冠状 病毒3C蛋白酶抑制活性，能够通过与GC376完全不同的作用机制有效阻断新型 冠状病毒的复制和感染过程。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变 型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。