白洛神萃取物用于制备提升肌肤保湿的组合物的用途

摘要

本发明公开一种白洛神(Hibiscus sabdariffa cv.)萃取物用于制备提升肌肤保湿的组合物的用途，其中白洛神萃取物是于冰晶裂解白洛神花萼的细胞壁后，以溶剂对裂解后的白洛神花萼进行萃取所得。

说明书

技术领域

本发明涉及一种白洛神萃取物，特别是涉及一种白洛神萃取物制备肌肤保湿的组合物的用途。

背景技术

自有机及天然的饮食概念兴起后，生技公司及食品业者积极投入关于天然植物的相关产品的研发。为使植物相关产品对身体健康帮助有科学验证的基础，植物的活性成分分析及功效评估成为产品开发的重点项目。

白洛神(Hibiscus sabdariffa cv.)又称水晶洛神、白洛神葵、白玉洛神葵或白玫瑰茄，为锦葵科木槿属下的一个种。白洛神为一年生草本植物或多年生灌木植物，生长于热带和亚热带地区，株高约一、二公尺，可用于消暑降火、提神解劳、调节血脂、降血压及降胆固醇。

发明内容

在一些实施例中，一种白洛神(Hibiscus sabdariffa cv.)萃取物用于制备提升肌肤保湿的组合物的用途，其中白洛神萃取物是以冰晶裂解白洛神花萼的细胞壁后，以溶剂对裂解后的白洛神花萼进行萃取所得。

综上，任一实施例的白洛神萃取物其可制备提升肌肤保湿的组合物。换言之，前述的组合物具有提升肌肤保湿的功能。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1为细胞实验中维持皮肤角质细胞结构相关基因相对表现量的结果图。

图2为细胞实验中水通道蛋白基因相对表现量的结果图。

图3为细胞实验中神经酰胺生成相关基因相对表现量的结果图。

图4为细胞实验中玻尿酸合成相关基因相对表现量的结果图。

图5为细胞实验中玻尿酸相对分泌量的结果图。

图6为人体实验中，第0周、第2周及第4周检测肌肤保湿度的结果图。

图7为人体实验中，第0周、第2周及第4周检测经皮水分散失度的结果图。

图8为人体实验中，第0周、第2周及第4周检测肌肤弹性度的结果图。

图9为人体实验中，第0周、第2周及第4周检测皱纹程度的结果图。

图10为人体实验中，第0周、第2周及第4周检测胶原蛋白密度的结果图。

图11为人体实验中，第0周、第2周及第4周肤况问卷调查的自我评估的结果图。

具体实施方式

以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。

在一些实施例中，由白洛神(Hibiscus sabdariffa cv.)的花萼所获得的白洛神萃取物可具有提升肌肤保湿的能力。因此，白洛神萃取物可用于制备具有提升肌肤保湿的能力的组合物。其中，白洛神萃取物是以冰晶裂解白洛神花萼的细胞壁后，以溶剂对裂解后的白洛神花萼进行萃取所得。

在一些实施例中，在萃取程序中，将白洛神的花萼置于-20±5℃下进行冷冻，使冰晶裂解白洛神花萼的细胞壁后，以水于85±5℃下萃取裂解后的白洛神花萼60分钟至90分钟以得到初萃原液。举例来说，将白洛神花萼浸泡在85±5℃的5倍水中60分钟至90分钟。

其中，进行萃取的白洛神花萼可为完整花萼，或为经物理前处理而分离成碎片、颗粒或粉末等型态的花萼。采用的物理前处理可包括下列至少一种：粗碎、切碎、剪碎、捣碎、及研磨。

在一些实施例中，将白洛神的花萼置于-20±5℃下24小时以上进行冷冻，使花萼中所含的水分因急速冷冻形成冰晶。形成的冰晶可破坏花萼的细胞壁后，释放出更多效性物质。

在一些实施例中，在萃取程序中，初萃原液可进一步进行过滤以去除杂质而得到滤液。在一些实施例中，在萃取程序中，滤液可进一步进行浓缩以得到浓缩液。在一些实施例中，在萃取程序中，浓缩液可进一步过滤以得到浓缩过滤液。

在一些实施例中，浓缩步骤的处理温度为60±5℃。

也就是说，可依实际需求以萃取程序所得的初萃原液、滤液、浓缩液或浓缩过滤液作为白洛神萃取物。

在一些实施例中，白洛神萃取物是通过提升维持皮肤角质细胞结构相关基因表现量以达到提升肌肤保湿的效果。

在一些实施例中，维持皮肤角质细胞结构相关基因包含转谷胺酰胺酶1(transglutaminase 1,TGM1)基因以及角蛋白(keratin,KRT)基因。其中，角蛋白基因可为下列至少一者：KRT1基因、KRT10基因及KRT14基因。

在一些实施例中，白洛神萃取物是通过增加水通道蛋白以达到提升肌肤保湿的效果。

在一些实施例中，白洛神萃取物是通过提升水通道蛋白基因表现量以达到提升肌肤保湿的效果。

在一些实施例中，水通道蛋白基因可为水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)基因。

在一些实施例中，白洛神萃取物是通过增加神经酰胺以达到提升肌肤保湿的效果。

在一些实施例中，白洛神萃取物是通过提升神经酰胺生成相关基因以达到提升肌肤保湿的效果。

在一些实施例中，神经酰胺生成相关基因包含葡糖神经酰胺酶(glucosylceramidase,GBA)基因及鞘磷脂磷酸二酯酶1(sphingomyelinphosphodiesterase 1,SMPD1)基因。

在一些实施例中，白洛神萃取物是通过增加玻尿酸分泌以达到提升肌肤保湿的效果。

在一些实施例中，白洛神萃取物系是通过提升玻尿酸合成相关基因表现量以达到提升肌肤保湿的效果。

在一些实施例中，玻尿酸合成相关基因可为玻尿酸合成酶(hyaluronansynthase,HAS)基因。其中，玻尿酸合成酶基因包括HAS2基因及HAS3基因。

在一些实施例中，白洛神萃取物的有效剂量为1.5毫克/天。

在一些实施例中，白洛神(Hibiscus sabdariffa)萃取物可用于制备提升肌肤保湿的组合物，并且制备得的组合物可为医药组合物、食品组合物、或化妆品或保养品组合物。

在一些实施例中，当前述的组合物为医药组合物时，此医药组合物包含有效含量的白洛神萃取物。其中，此医药组合物可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服地、或局部地(topically)投药剂型。

在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)或病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，含有白洛神萃取物的医药组合物可更包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。其中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline，PBS)或含有醇的水性溶液(alcohol containing aqueous solution)。

在一些实施例中，当前述的组合物为食品组合物时，此食品组合物包含特定含量的白洛神萃取物。其中，食品组合物的型态可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体。

在一些实施例中，含有白洛神萃取物的食品组合物可为食品产品或食品添加物(food additive)。

在一些实施例中，含有白洛神萃取物的食品产品可为饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)或膳食补充品(dietary supplements)等。在一些实施例中，含有白洛神萃取物的食品产品可更包括一佐剂。举例来说，佐剂可为麦芽糖糊精(Maltodextrin)、苹果酸、蔗糖素、柠檬酸、水果香料、蜂蜜香料、甜菊糖苷或其组合等。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

在一些实施例中，含有白洛神萃取物的食品添加物可为调味料、甜味料、香料、pH值调整剂、乳化剂、着色料或稳定剂等。

在一些实施例中，前述的组合物为化妆品或保养品组合物。换言之，化妆品或保养品组合物包含特定含量的白洛神萃取物。

在一些实施例中，含有白洛神萃取物的化妆品或保养品组合物可为下列任一种型态：化妆水、凝胶、冻膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉饼、蜜粉、卸妆油、卸妆乳、洗面奶、沐浴乳、洗发精、护发乳、防晒乳、护手霜、指甲油、香水、精华液及面膜。

在一些实施例中，含有白洛神萃取物的化妆品或保养品组合物可视需要更包含外用品可接受成分。在一些实施例中，外用品可接受成分可例如为乳化剂、渗透促进剂、软化剂、溶剂、赋型剂、抗氧化剂、或其组合。

下列范例中的实验步骤若无特别叙明，即在室温(25±5℃)、常压(1atm)下进行。

例一：白洛神萃取物及洛神萃取物的制备

原料：

1.白洛神(学名：Hibiscus sabdariffa cv.)的花萼，产地中国台湾屏东，系采购自在地农家叶俊宏。

2.洛神(学名：Hibiscus sabdariffa Linn.Sp.Pl.)的花萼，产地中国台湾屏东，系采购自在地农家叶俊宏。

3.二次水，又称RO水或二次蒸馏水。

制备流程：

1.将白洛神的花萼移至冷冻库中24小时，使冰晶裂解白洛神花萼的细胞壁。冷冻库的温度设定于-20±5℃。

2.将裂解后的白洛神的花萼以粉碎机(型号：10Speed Blender；厂牌：Osterizer)进行粗碎，并且以40网目(mesh)的筛网进行过筛以得到白洛神粗碎物。

3.将二次水加热至85±5℃后，投入白洛神粗碎物。使白洛神粗碎物于85±5℃下，白洛神粗碎物比二次水以1：5的重量比进行萃取60分钟而得到初萃原液。

4.将初萃原液以400网目(mesh)的滤网对初萃原液过滤而得到滤液。

5.将减压浓缩机(型号：Rotavapor R-100；厂牌：BUCHI)温度设定为60℃，于此情况下，对滤液进行减压浓缩而得到浓缩液。

6.将浓缩液以400网目(mesh)的滤网对浓缩液过滤而得到浓缩过滤液。于此，以浓缩过滤液作为后续实验所使用的白洛神萃取物。其中，浓缩过滤液的糖度为Brix 8.0±0.3。

7.依照上述制备流程步骤1至6，以洛神的花萼制得洛神萃取物。

8.所制得的白洛神萃取物及洛神萃取物于冷冻库中储存以利进行后续的测试。

例二：维持皮肤角质细胞结构相关基因表现量试验

材料与仪器：

1.细胞株：人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermal keratinocytes)，购自ATCC，细胞编号PCS-200-011，以下简称HPEK-50细胞。

2.培养基：角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM)，购自Thermo，产品编号17005042。

3.RNA萃取试剂套组，购自TANBead公司，产品编号6K206。

4.

5.ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，购自Thermo Fisher Scientific公司。

6.KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)Kit，购自KAPA Biosystems公司，产品编号KK4600。

试验流程：

1.将HPEK-50细胞以每孔1×10

2.于培养后，将HPEK-50细胞分为以下三组：空白组、实验组A与实验组B。其中，空白组的培养液不含任何萃取物；实验组A的培养液含有0.25％(v/v)的例一制得的白洛神萃取物；实验组B的培养液含有0.25％(v/v)例一制得的洛神萃取物。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。

3.移除培养后的空白组、实验组A与实验组B的培养液，并以PBS进行润洗。

4.于润洗后，以RNA萃取试剂套组的细胞裂解液破各组的HPEK-50细胞的细胞膜，以形成细胞溶液。

5.使用RNA萃取试剂套组分别萃取各组的细胞溶液内的RNA。

6.每组取2000奈克(ng)所萃取出的RNA作为模板，借由

7.使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix(2X)Kit及表1的组合引子将cDNA分别进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以观察空白组、实验组A及实验组B的HPEK-50细胞的各种目标基因的表现量及其解链曲线(melting curve)。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环。

8.使用2

△Ct＝Ct

△△Ct＝△Ct

倍数变化＝2

表1

9.空白组与实验组的测量结果之间的统计学显著差异是以学生t检验(studentt-test)统计分析得到。(图式中「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。

试验结果：

请参阅图1。在空白组的HPEK-50细胞并未经过白洛神萃取物或洛神萃取物的处理，也就是指其在正常的生理代谢情况下，设定其基因的表现量为1倍。相对于空白组，实验组A(白洛神萃取物)的TGM1基因的表现量为27.73倍，而实验组B(洛神萃取物)的TGM1基因的表现量为0.44倍；实验组A(白洛神萃取物)的KRT1基因的表现量为6.90倍，而实验组B(洛神萃取物)的KRT1基因的表现量为0.81倍；实验组A(白洛神萃取物)的KRT10基因的表现量为11.07倍，而实验组B(洛神萃取物)的KRT10基因的表现量为1.36倍；实验组A(白洛神萃取物)的KRT14基因的表现量为30.38倍，而实验组B(洛神萃取物)的KRT14基因的表现量为1.56倍。

由此可知，不同于洛神萃取物，白洛神萃取物能明显提升TGM1基因与KRT1基因的表现量，而洛神萃取物则是减少TGM1基因与KRT1基因的表现量。此外，白洛神萃取物能明显提升KRT10基因与KRT14基因的表现量，提升效果甚至优于洛神萃取物。

例三：水通道蛋白基因表现量试验

材料与仪器：

1.细胞株：人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermal keratinocytes)，购自ATCC，细胞编号PCS-200-011，以下简称HPEK-50细胞。

2.培养基：角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM)，购自Thermo，产品编号17005042。

3.RNA萃取试剂套组，购自TANBead公司，产品编号6K206。

4.

5.ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，购自Thermo Fisher Scientific公司。

6.KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)Kit，购自KAPA Biosystems公司，产品编号KK4600。

试验流程：

1.将HPEK-50细胞以每孔1×10

2.于培养后，将HPEK-50细胞分为以下三组：空白组、实验组A与实验组B。其中，空白组的培养液不含任何萃取物；实验组A的培养液含有0.25％(v/v)的例一制得的白洛神萃取物；实验组B的培养液含有0.25％(v/v)例一制得的洛神萃取物。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。

3.移除培养后的空白组、实验组A与实验组B的培养液，并以PBS进行润洗。

4.于润洗后，以RNA萃取试剂套组的细胞裂解液破各组的HPEK-50细胞的细胞膜，以形成细胞溶液。

5.使用RNA萃取试剂套组分别萃取各组的细胞溶液内的RNA。

6.每组取2000奈克(ng)所萃取出的RNA作为模板，借由

7.使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix(2X)Kit及表2的组合引子将cDNA分别进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以观察空白组、实验组A及实验组B的HPEK-50细胞的各种目标基因的表现量及其解链曲线(melting curve)。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环。

8.使用2

△Ct＝Ct

△△Ct＝△Ct

倍数变化＝2

表2

9.空白组与实验组的测量结果之间的统计学显著差异是以学生t检验(studentt-test)统计分析得到。(图式中「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。

试验结果：

请参阅图2。在空白组的HPEK-50细胞并未经过白洛神萃取物或洛神萃取物的处理，也就是指其在正常的生理代谢情况下，设定其基因的表现量为1倍。相对于空白组，实验组A(白洛神萃取物)的AQP3基因的表现量为15.36倍，而实验组B(洛神萃取物)的AQP3基因的表现量为1.03倍。

由此可知，白洛神萃取物能明显提升AQP3基因的表现量，提升效果优于洛神萃取物。

例四：神经酰胺生成相关基因表现量试验

材料与仪器：

1.细胞株：人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermal keratinocytes)，购自ATCC，细胞编号PCS-200-011，以下简称HPEK-50细胞。

2.培养基：角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM)，购自Thermo，产品编号17005042。

3.RNA萃取试剂套组，购自TANBead公司，产品编号6K206。

4.

5.ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，购自Thermo Fisher Scientific公司。

6.KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)Kit，购自KAPA Biosystems公司，产品编号KK4600。

试验流程：

1.将HPEK-50细胞以每孔1×10

2.于培养后，将HPEK-50细胞分为以下三组：空白组、实验组A与实验组B。其中，空白组的培养液不含任何萃取物；实验组A的培养液含有0.25％(v/v)的例一制得的白洛神萃取物；实验组B的培养液含有0.25％(v/v)例一制得的洛神萃取物。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。

3.移除培养后的空白组、实验组A与实验组B的培养液，并以PBS进行润洗。

4.于润洗后，以RNA萃取试剂套组的细胞裂解液破各组的HPEK-50细胞的细胞膜，以形成细胞溶液。

5.使用RNA萃取试剂套组分别萃取各组的细胞溶液内的RNA。

6.每组取2000奈克(ng)所萃取出的RNA作为模板，借由

7.使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix(2X)Kit及表3的组合引子将cDNA分别进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以观察空白组、实验组A及实验组B的HPEK-50细胞的各种目标基因的表现量及其解链曲线(melting curve)。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环。

8.使用2

△Ct＝Ct

△△Ct＝△Ct

倍数变化＝2

表3

9.空白组与实验组的测量结果之间的统计学显著差异是以学生t检验(studentt-test)统计分析得到。(图式中「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。

试验结果：

请参阅图3。在空白组的HPEK-50细胞并未经过白洛神萃取物或洛神萃取物的处理，也就是指其在正常的生理代谢情况下，设定其基因的表现量为1倍。相对于空白组，实验组A(白洛神萃取物)的SMPD1基因的表现量为17.22倍，而实验组B(洛神萃取物)的SMPD1基因的表现量为1.83倍；实验组A(白洛神萃取物)的GBA基因的表现量为35.54倍，而实验组B(洛神萃取物)的GBA基因的表现量为1.40倍。

由此可知，白洛神萃取物能明显提升SMPD1基因与GBA基因的表现量，提升效果优于洛神萃取物。

例五：玻尿酸合成相关基因表现量试验

材料与仪器：

1.细胞株：人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermal keratinocytes)，购自ATCC，细胞编号PCS-200-011，以下简称HPEK-50细胞。

2.培养基：角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM)，购自Thermo，产品编号17005042。

3.RNA萃取试剂套组，购自TANBead公司，产品编号6K206。

4.

5.ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，购自Thermo Fisher Scientific公司。

6.KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)Kit，购自KAPA Biosystems公司，产品编号KK4600。

试验流程：

1.将HPEK-50细胞以每孔1×10

2.于培养后，将HPEK-50细胞分为以下三组：空白组、实验组A与实验组B。其中，空白组的培养液不含任何萃取物；实验组A的培养液含有0.25％(v/v)的例一制得的白洛神萃取物；实验组B的培养液含有0.25％(v/v)例一制得的洛神萃取物。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。

3.移除培养后的空白组、实验组A与实验组B的培养液，并以PBS进行润洗。

4.于润洗后，以RNA萃取试剂套组的细胞裂解液破各组的HPEK-50细胞的细胞膜，以形成细胞溶液。

5.使用RNA萃取试剂套组分别萃取各组的细胞溶液内的RNA。

6.每组取2000奈克(ng)所萃取出的RNA作为模板，借由

7.使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix(2X)Kit及表4的组合引子将cDNA分别进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以观察空白组、实验组A及实验组B的HPEK-50细胞的各种目标基因的表现量及其解链曲线(melting curve)。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环。

8.使用2

△Ct＝Ct

△△Ct＝△Ct

倍数变化＝2

表4

9.空白组与实验组的测量结果之间的统计学显著差异是以学生t检验(studentt-test)统计分析得到。(图式中「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。

试验结果：

请参阅图4。在空白组的HPEK-50细胞并未经过白洛神萃取物或洛神萃取物的处理，也就是指其在正常的生理代谢情况下，设定其基因的表现量为1倍。相对于空白组，实验组A(白洛神萃取物)的HAS2基因的表现量为2.77倍，而实验组B(洛神萃取物)的HAS2基因的表现量为0.37倍；实验组A(白洛神萃取物)的HAS3基因的表现量为14.10倍，而实验组B(洛神萃取物)的HAS3基因的表现量为0.59倍。

由此可知，不同于洛神萃取物，白洛神萃取物能明显提升HAS2基因与HAS3基因的表现量，而洛神萃取物则是减少HAS2基因与HAS3基因的表现量。

例六：玻尿酸分泌量试验

材料与仪器：

1.细胞株：人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermal keratinocytes)，购自ATCC，以下简称HPEK-50细胞。

2.培养基：角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM)，购自Thermo，产品编号17005042。

3.人类玻尿酸检测套组(Human Hyaluronic acid,HA ELISA Kit)，购自CusabioBiotech。

4.酵素免疫分析仪(ELISA reader)，购自BioTek公司(美国)。

5.白洛神萃取物及洛神萃取物，由本案例一的制备方式所制得。

试验流程：

1.将HPEK-50细胞以每孔1×10

3.每孔取100μL的培养基，加至预涂(pre-coated)的ELISA盘中，于37℃下培养2小时。

4.移除每孔中的培养基，勿进行清洗。

5.于每孔中添加100μL的生物素抗体(Biotin-antibody)，并于37℃下培养1小时。

6.反应完毕后，移除每孔的培养基，并以200μL的洗涤缓冲液(Wash Buffer)进行清洗，每次清洗静置2分钟，重复此步骤三次。最后一次清洗完成后，通过抽吸除去所有剩余的洗涤缓冲液。

7.于每孔中添加100μL的HRP-抗生物素蛋白(HRP-avidin)，并在37℃下培养1小时。

8.反应完毕后，移除每孔的培养基，并以200μL的洗涤缓冲液(Wash Buffer)进行清洗，每次清洗静置2分钟，重复此步骤五次。最后一次清洗完成后，通过抽吸除去所有剩余的洗涤缓冲液。

9.于每孔中避光添加90μL的TMB底物(TMB Substrate)，并于37°C下避光反应30分钟。

10.于每孔中添加50μL的终止液(Stop Solution)，轻轻敲打培养盘以确保其充分混合。

11.利用酵素免疫分析仪于5分钟内测量每孔450nm的吸光值。

12.空白组与实验组的测量结果之间的统计学显著差异是以学生t检验(studentt-test)统计分析得到。(图式中「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。

试验结果：

请参阅图5。在空白组的HPEK-50细胞并未经过白洛神萃取物或洛神萃取物的处理，也就是指其在正常的生理代谢情况下，设定其所能产生的玻尿酸量为100％。而实验组A的HPEK-50细胞在经过白洛神萃取物的处理后，其相对于空白组所产生的玻尿酸量为120.9％；实验组B的HPEK-50细胞在经过洛神萃取物的处理后，其相对于空白组所产生的玻尿酸量为114.4％。换言之，与空白组相较之下，实验组A及实验组B的相对玻尿酸分泌率皆有提升。其中，实验组A(白洛神萃取物)的相对玻尿酸分泌与空白组相比提升20.9％，而实验组B(洛神萃取物物)的相对玻尿酸分泌与空白组相比提升14.4％。由此可知，白洛神萃取物及洛神萃取物皆可明显促进HPEK-50细胞产生玻尿酸，且白洛神萃取物的提升玻尿酸分泌的能力相较洛神萃取物优异。基此可知，白洛神萃取物具有促进玻尿酸分泌的效果，进而有益于保留皮肤胶原蛋白、增加皮肤含水量，并提供皮肤弹性和柔韧性。

玻尿酸可以防止皮肤自然老化，并保护皮肤免于太阳紫外线、烟草烟雾和空气中污染物质的危害。玻尿酸亦具有帮助增加皮肤水份，使肌肤结构紧密澎润，以减少皮肤细纹和皱纹的出现。另外，玻尿酸在伤口愈合中也起着关键作用，当皮肤细胞需要修复或受损时其浓度亦会增加，且其应用于皮肤伤口已被证明可以减轻伤口的大小且减缓疼痛，亦可帮助降低伤口细胞感染风险。

另外，玻尿酸对于骨关节炎亦具有帮助，实验证实每天食用80-200毫克玻尿酸至少两个月，即可显著减轻骨关节炎患者的膝关节疼痛，亦有助于减轻胃酸反流症状，而玻尿酸具有出色的保湿性，其亦常用于治疗干眼症、减缓骨质疏松及减轻膀胱疼痛症候群等诸多功效。

例七：人体试验-改善肌肤状况试验

令9位25-55岁的健康成人受试者每日饮用一瓶50g白洛神萃取物饮品(其含有1.5g的使用例一所制得的白洛神萃取物)，连续服用4周(即28日)。

受试者于开始服用前(脸部已清洁，第0周)、服用14日(脸部已清洁，第2周)及服用28日(脸部已清洁，第4周)后，进行肌肤检测及肤况问卷调查。肌肤检测为依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录脸部肌肤的数值、并拍摄服用前及服用后的照片。(于服用前及服用后进行检测时，受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致，以减少外界的温湿度等因素会对肌肤所造成的影响)。

将分别对肌肤进行以下检测项目的检测：

1.肌肤保湿效力(skin moisturizing efficacy)

使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司的肌肤含水量检测探头

2.经皮水分散失量(transepidermal water loss，TEWL)

使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司的肌肤水分散失检测探头

3.肌肤弹性(skin elasticity)

使用购自意大利Callegari 1930公司的舒肤特皮肤生理检测仪Soft Plus对同一受试者在服用白洛神萃取物饮品前、服用14日及服用28日后的面部肌肤进行检测。该检测仪系基于吸力和拉伸原理，在皮肤表面产生一个负压，并且将皮肤吸进一个测试探头内，通过光学测试系统检测皮肤被吸进探头内的深度，并以软件分析计算皮肤弹性。

4.肌肤皱纹(skin wrinkle)

使用购自美国Canfield scientific公司的VISIA高阶数字肤质检测仪(VISIAComplexion Analysis System)对同一受试者在服用白洛神萃取物饮品前、服用14日及服用28日后的面部肌肤进行检测。该检测仪系通过高分辨率的相机镜头对面部肌肤进行拍摄，借由标准白光照射、侦测皮肤阴影的变化，即可侦测纹理位置并得到一数值，可代表皮肤的平滑程度。

5.胶原蛋白密度(collagen density)

使用购自丹麦Cortex Technology公司的高频超音波检测探头(HighFreq.Ultrasound Module)(

6.肤况问卷调查：

同一受试者在服用白洛神萃取物饮品前、服用14日及服用28日后进行肤况问卷调查。其中，肤况问卷调查为针对皮肤干痒、皮肤松弛及皮肤缺少弹性项目进行自我评估。

试验结果：

需要特别说明的是，第0周分别与第2周及第4周的量测结果之间的统计学显著差异是以student t-test统计分析得到。图式中「*」代表在与第0周比较下其p值小于0.05、「**」代表在与第0周比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与第0周比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

1.关于受试者的「肌肤保湿效力」的检测结果，其显示于图6。将9位受试者在服用白洛神萃取物饮品前(第0周)以肌肤含水量检测探头

2.关于受试者的「经皮水分散失量」的检测结果，其显示于图7。将9位受试者在服用白洛神萃取物饮品前(第0周)以肌肤水分散失检测探头

3.关于受试者的「肌肤弹性」的检测结果，其显示于图8。将9位受试者在服用白洛神萃取物饮品前(第0周)以舒肤特皮肤生理检测仪Soft Plus所检测出来平均肌肤弹性视为100％。受试者在持续服用2及4周后，其平均肌肤弹性分别为101.9％及109.5％。换言之，相较于服用白洛神萃取物饮品前(第0周)，持续饮用2周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤弹性提升1.9％，而持续饮用4周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤弹性提升9.5％。由此可知，白洛神萃取物确实可促进并改善肌肤弹性的能力。

4.关于受试者的「肌肤皱纹」的检测结果，其显示于图9。将9位受试者在服用白洛神萃取物饮品前(第0周)以VISIA高阶数字肤质检测仪所检测出来平均肌肤皱纹程度视为100％。受试者在持续服用2及4周后，其平均肌肤皱纹程度分别为82.7％及70.3％。换言之，相较于服用白洛神萃取物饮品前(第0周)，持续饮用2周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤皱纹程度减少17.3％，而持续饮用4周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤皱纹程度减少29.7％。由此可知，白洛神萃取物确实可减少肌肤皱纹，并改善受试者肌肤状况，即白洛神萃取物具有抚平细纹的功效。

5.关于受试者的「胶原蛋白密度」的检测结果，其显示于图10。将9位受试者在服用白洛神萃取物饮品前(第0周)以高频超音波检测探头所检测出来平均肌肤胶原蛋白密度视为100％。受试者在持续服用2及4周后，其平均肌肤胶原蛋白密度分别为104.9％及106.6％。换言之，相较于服用白洛神萃取物饮品前(第0周)，持续饮用2周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤胶原蛋白密度提升4.9％，而持续饮用4周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤胶原蛋白密度提升6.6％。由此可知，白洛神萃取物确实可增加肌肤胶原蛋白。

6.关于受试者的「肤况问卷调查」的自我评估结果，其显示于图11。将9位受试者在服用白洛神萃取物饮品前(第0周)自我评估的肤况视为100％。其中，肤况包含肌肤干痒、肌肤松弛及肌肤缺少弹性。受试者在持续服用2及4周后，其肌肤干痒严重度为80.0％及80.0％；其肌肤松弛严重度为72.2％及67.1％；其肌肤缺少弹性严重度为77.1％及71.3％。换言之，相较于服用白洛神萃取物饮品前(第0周)，持续饮用2周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤干痒情况减少20.0％，而持续饮用4周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤干痒情况减少20.0％；持续饮用2周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤松弛情况减少27.8％，而持续饮用4周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤松弛情况减少32.9％；持续饮用2周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤缺少弹性情况减少22.9％，而持续饮用4周含有1.5mL白洛神萃取物的饮品后可使此些受试者肌肤缺少弹性情况减少28.7％。换言之，受试者感觉皮肤干燥、瘙痒、松弛和弹性差的严重程度有所减轻。

综上，任一实施例的白洛神萃取物其可制备提升肌肤保湿的组合物。换言之，前述的组合物具有提升肌肤保湿的功能。在一些实施例中，换言之，白洛神萃取物所制得的组合物还具有下列一种或多种功能：提升维持皮肤角质细胞结构相关基因表现量、增加水信道蛋白、提升水信道蛋白基因表现量、增加神经酰胺、提升神经酰胺生成相关基因、增加玻尿酸分泌以及提升玻尿酸合成相关基因表现量。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

序列表

<110> 大江生医股份有限公司

<120> 白洛神萃取物用于制备提升肌肤保湿的组合物的用途

<150> US 63/143,971

<151> 2021-02-01

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TGM1

<400> 1

gatcgcatca cccttgagtt ac 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TGM1

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

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<220>

<223> KRT1

<400> 3

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<210> 4

<211> 21

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<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 5

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<210> 6

<211> 19

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> KRT14

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 8

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<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AQP3

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<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SMPD1

<400> 11

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<210> 12

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<210> 13

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> GBA

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<213> Artificial Sequence

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<210> 15

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> HAS2

<400> 15

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<210> 16

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HAS3

<400> 17

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<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> HAS3

<400> 18

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