治疗X连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体

摘要

在某些实施方案中，提供了用于治疗X连锁慢性肉芽肿病(X‑CGD)的慢病毒载体。在某些实施方案中，所述载体包含表达盒，所述表达盒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含CYBB启动子或其有效片段；和与所述CYBB启动子或启动子片段可操作连接的编码gp91phox的核酸。

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背景技术

X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)是由编码吞噬细胞NADPH氧化酶(PHOX)复合物的重要亚基的CYBB基因中的突变引起的原发性免疫缺陷。有缺陷的PHOX复合物导致免疫系统的吞噬细胞不能正确消除感染。

患者因此高度易感和罹患复发性危及生命的细菌和真菌感染。在典型的受试者中，免疫系统试图隔离感染但无法消除它，导致肉芽肿的特征性形成，可导致那些组织受损。慢性肉芽肿病的特征通常首先出现在童年期，不过一些个体直到晚年才出现症状。

患有慢性肉芽肿病的人通常每3至4年至少有一次严重的细菌或真菌感染。肺部是最常见的感染区域，并且肺炎是这种疾患的共同特征。患有慢性肉芽肿病的个体可能发生一种类型的真菌性肺炎，称为覆盖物肺炎，在暴露于腐烂的有机材料(比如覆盖物、干草或枯叶)之后引起发热和呼吸急促。暴露于这些有机材料和参与其分解的众多真菌引起患有慢性肉芽肿病的人在其肺部中发生真菌感染。患有慢性肉芽肿病的人的其他常见感染区域包括皮肤、肝脏和淋巴结。

炎症可发生在患有慢性肉芽肿病的人的身体的许多不同区域。最常见的肉芽肿发生在胃肠道和泌尿生殖道。在许多情况下，肠壁发炎，引起一种形式的炎性肠病，其严重程度各不相同，但会导致胃痛、腹泻、血便、恶心和呕吐。患有慢性肉芽肿病的人的其他常见炎症区域包括胃、结肠和直肠，以及口腔、咽喉和皮肤。另外，胃肠道内的肉芽肿可导致组织分解和脓液产生(脓肿)。胃中的炎症可能阻止食物穿行进入肠道(胃出口阻塞)，导致不能消化食物。这些消化问题引起进食后呕吐和体重减轻。在泌尿生殖道中，在肾脏和膀胱中会发生炎症。产生免疫细胞的淋巴结的炎症(淋巴结炎)和骨髓中的炎症(骨髓炎)可导致免疫系统进一步受损。

患有慢性肉芽肿病的人很少发生自身免疫病症，所述病症在免疫系统发生故障并攻击身体的自身组织和器官时出现。

感染和炎症的反复发作降低了患有慢性肉芽肿病的个体的预期寿命。

PHOX复合物由五个不同基因编码的五个不同亚基组成。这些是由CYBB编码的gp91

所述疾病最初被称为“儿童致命性肉芽肿病”，并且未经治疗的患者很少活过他们生命的第一个十年。目前的护理标准利用常规预防性抗细菌和抗真菌疗法，并且产生的平均存活年龄约为30-40岁。这些治疗不提供该疾病的治愈。

一种潜在的治愈性疗法是来自HLA匹配供体的同种异体造血干细胞移植。然而，由于没有适合的匹配供体，这对许多患者来说不是可行的选项。

替代的治愈性疗法是具有离体基因疗法的自体造血干细胞(HSC)移植。在这种方法中，患者充当其自己的供体，从而消除了免疫并发症的风险。采集患者自己的血液HSC，并进行离体遗传工程化以引入感兴趣的基因的功能拷贝，并将基因修饰的细胞重新注入。

先前的基于病毒的疗法利用由脾病灶形成病毒(SFFV)启动子驱动的γ-逆转录病毒载体。这提供了有希望的临床益处。然而，2/2的患者由于插入性肿瘤发生而发生脊髓发育不良。目前更安全的SIN慢病毒载体(pChim-CYBB；又名MSP-Gp91phox-WPRE)采用嵌合“骨髓特异性启动子”(MSP)，并且目前临床试验的初步结果指示了临床益处。然而，pChim-CYBB构建体不能概括Gp91

发明内容

本文描述了用于治疗X-CGD的新型慢病毒载体(LV)的开发。本文所述的载体显示出比当前慢病毒载体更好(更高)的表达。另外，本文所述的载体具有严格的谱系和阶段特异性表达，其模拟天然CYBB基因的表达模式。这与具有脱靶表达且不能概括天然CYBB基因的谱系特异性表达模式的MSP构建体形成对比。

因此，本文考虑的各种实施方案可以包括但不必限于以下一项或多项：

实施方案1：一种用于治疗慢性肉芽肿病的重组慢病毒载体(LV)，所述载体包含：

包含核酸构建体的表达盒，所述核酸构建体包含：

CYBB启动子或其有效片段；以及

编码与所述CYBB启动子或启动子片段可操作地连接的gp91

实施方案2：根据实施方案1所述的载体，其中所述CYBB启动子或其有效片段包含全长内源CYBB启动子(SEQ ID NO:1)。

实施方案3：根据实施方案1所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段包含最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)或由其组成。

实施方案4：根据实施方案3所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段由最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)组成。

实施方案5：根据实施方案1所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段包含最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)或由其组成。

实施方案6：根据实施方案5所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，所述有效片段的序列由最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)组成。

实施方案7：根据实施方案1-6中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2(SEQ ID NO:4)或其有效片段。

实施方案8：根据实施方案7所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2核心(SEQ ID NO:5)或由其组成。

实施方案9：根据实施方案8所述的载体，其中增强子元件2的所述有效片段的序列由增强子元件2核心的序列(SEQ ID NO:5)组成。

实施方案10：根据实施方案7所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2超核心(SEQ ID NO:6)或由其组成。

实施方案11：根据实施方案10所述的载体，其中增强子元件2的所述有效片段的序列由增强子元件2超核心的序列(SEQ ID NO:6)组成。

实施方案12：根据实施方案1-11中任一项所述的载体，其中所述表达盒进一步包含RELA TF结合位点或其有效片段。

实施方案13：根据实施方案12所述的载体，其中所述RELA TF结合位点包含SEQ IDNO:7的核酸序列或由其组成。

实施方案14：根据实施方案1-11中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4或其有效片段。

实施方案15：根据实施方案14所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R或其有效片段。

实施方案16：根据实施方案15所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列包含增强子元件4R核心的核酸序列(SEQ ID NO:10)或由其组成。

实施方案17：根据实施方案15所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列包含增强子元件4R超核心的核酸序列(SEQ ID NO:11)或由其组成。

实施方案18：根据实施方案16所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列由增强子元件4R超核心的核酸序列(SEQ ID NO:11)组成。

实施方案19：根据实施方案1-18中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4L或其有效片段。

实施方案20：根据实施方案19所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4L的有效片段，其中所述片段包含4L核心序列(SEQ ID NO:13)或由其组成。

实施方案21：根据实施方案1-20中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3(SEQ ID NO:14)或其有效片段。

实施方案22：根据实施方案21所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3中间片段，所述中间片段包含SEQ ID NO:15的核酸序列或由其组成。

实施方案23：根据实施方案21-22中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3右片段，所述右片段包含SEQ ID NO:16的核酸序列或由其组成。

实施方案24：根据实施方案1-23中任一项所述的载体，其中编码编码gp91

实施方案25：根据实施方案24所述的载体，其中所述gp91

实施方案26：根据实施方案24所述的载体，其中所述gp91

实施方案27：根据实施方案26所述的载体，其中所述gp91

实施方案28：根据实施方案26所述的载体，其中所述gp91

实施方案29：根据实施方案1-28中任一项所述的载体，其中所述载体包含ψ区载体基因组包装信号。

实施方案30：根据实施方案1-29中任一项所述的载体，其中所述载体包含包括CMV增强子/启动子的5'LTR。

实施方案31：根据实施方案1-30中任一项所述的载体，其中所述载体包含Rev响应元件(RRE)。

实施方案32：根据实施方案1-31中任一项所述的载体，其中所述载体包含中央多嘌呤束。

实施方案33：根据实施方案1-32中任一项所述的载体，其中所述载体包含翻译后调控元件。

实施方案34：根据实施方案33所述的载体，其中所述转录后调控元件是修饰的土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

实施方案35：根据实施方案1-34中任一项所述的载体，其中所述载体不能通过重组使野生型慢病毒重构。

实施方案36：根据实施方案1所述的载体，其中所述载体包含图19中所示的全尺寸2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE的特征，其中mCit被替换为Gp91

实施方案37：根据实施方案1所述的载体，其中所述载体包含图20的图A中所示的UC 2-4R-Int3-pro-coGp91

实施方案38：根据实施方案37所述的载体，其中所述载体包含在图20的图B中表示的载体中所示的特征。

实施方案39：根据实施方案38所述的载体，其中所述载体包含超核心(UC)2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE(SEQ ID NO:22)的核苷酸序列。

实施方案40：根据实施方案1-39中任一项所述的载体，其中所述载体显示在CD33+(大量髓系细胞)中高表达、在CD19+(B细胞)中高表达、在CD66b+CD15+CD11b+CD16+(成熟嗜中性粒细胞)中高表达以及在CD3+T细胞中低表达或无表达。

实施方案41：一种用根据实施方案1-40中任一项所述的载体转导的宿主细胞。

实施方案42：根据实施方案41所述的宿主细胞，其中所述细胞是干细胞。

实施方案43：根据实施方案42所述的宿主细胞，其中所述细胞是来源于骨髓、和/或来自脐带血、和/或来自外周血的干细胞。

实施方案44：根据实施方案41所述的宿主细胞，其中所述细胞是人类造血祖细胞。

实施方案45：根据实施方案44所述的宿主细胞，其中所述人类造血祖细胞是CD34+细胞。

实施方案46：一种治疗受试者中的慢性肉芽肿病(X-CGD)的方法，所述方法包括：

用根据实施方案1-40中任一项所述的载体转导来自所述受试者的干细胞和/或祖细胞；和

将所述转导的细胞或从其来源的细胞移植到所述受试者中，其中所述细胞或从其来源的衍生物表达所述Gp91

实施方案47：根据实施方案46所述的方法，其中所述细胞是干细胞。

实施方案48：根据实施方案46所述的宿主细胞，其中所述细胞来源于骨髓的干细胞。

实施方案49：根据实施方案46所述的方法，其中所述细胞是人类造血干细胞和祖细胞。

实施方案50：根据实施方案49所述的方法，其中所述人类造血祖细胞是CD34

实施方案51：一种编码以下一者或多者的重组核酸：

CYBB启动子或其有效片段；和/或

CYBB内源性增强子元件2(CYBB B细胞增强子)或其有效片段；和/或

CYBB内源性增强子4R(CYBB内源性髓样增强子)或其有效片段；和/或

CYBB内源性增强子4L或其有效片段；和/或

CYBB内源性髓样内含子3增强子或其有效片段；和/或

密码子优化的Gp91

实施方案52：根据实施方案51所述的核酸，其中所述核酸编码包含全长内源性CYBB启动子(SEQ ID NO:1)或由其组成的序列。

实施方案53：根据实施方案51所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段包含最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)或由其组成。

实施方案54：根据实施方案53所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段由最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)组成。

实施方案55：根据实施方案51所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段包含最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)或由其组成。

实施方案56：根据实施方案55所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段由最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)组成。

实施方案57：根据实施方案51-56中任一项所述的核酸，其中所述核酸编码CYBB内源性增强子元件2(CYBB B细胞增强子)的有效片段。

实施方案58：根据实施方案57所述的核酸，其中所述CYBB内源性增强子2的核酸序列包含增强子元件2核心的序列(SEQ ID NO:5)或由其组成。

实施方案59：根据实施方案57所述的核酸，其中所述CYBB内源性增强子元件2的核酸序列包含增强子元件2超核心的序列(SEQ ID NO:6)或由其组成。

实施方案60：根据实施方案51-59中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含CYBB内源性增强子4R(CYBB内源性髓样增强子)的有效片段。

实施方案61：根据实施方案60所述的核酸，其中CYBB内源性增强子4R的所述有效片段的核酸序列包含增强子元件4R超核心的序列(SEQ ID NO:10)或由其组成。

实施方案62：根据实施方案51-61中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含增强子元件4L的有效片段。

实施方案63：根据实施方案62所述的核酸，其中增强子元件4L的所述有效片段包含4L核心序列(SEQ ID NO:13)的序列或由其组成。

实施方案64：根据实施方案51-63中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含CYBB内源性髓样内含子3增强子的有效片段。

实施方案65：根据实施方案64所述的核酸，其中CYBB内源性髓样内含子3增强子的所述有效片段的核酸序列包含元件3中间片段核酸序列(SEQ ID NO:15)或由其组成。

实施方案66：根据实施方案64-65中任一项所述的核酸，其中CYBB内源性髓样内含子3增强子的所述有效片段的核酸序列包含内含子增强子元件3右片段(SEQ IDNO:16)或由其组成。

实施方案67：根据实施方案51-66中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含jCAT密码子优化的CYBB(SEQ ID NO:18)。

实施方案68：根据实施方案51-67中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含表达盒。

实施方案69：根据实施方案68所述的核酸，其中所述表达盒有效地在体内表达Gp91

实施方案70：根据实施方案51-69中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含根据实施方案1-40中任一项所述的慢病毒载体。

“启动子”是指核酸中的启动基因(例如，与启动子可操作地联接的基因)的转录所需的调控序列。

“增强子”是指调控性DNA序列，当其被称为转录因子的特定蛋白质结合时，增强相关基因的转录。

当用于启动子时，“有效片段”(例如，CYBB启动子的有效片段)是指全长启动子的片段，其足以启动与该启动子可操作连接的基因的转录。

当用于增强子时，“有效片段”(例如，CYBB增强子的有效片段)是指全长增强子的片段，当被转录因子结合时其足以提供可操作连接的基因的表达调节。在某些实施方案中，所述调节在由全长增强子提供的表达水平和/或谱系方面是可比较的。

术语“可操作连接”是指被置于与另一个核酸序列的功能关系中的核酸序列。例如，当该启动子被置于允许该启动子启动该基因的转录的位置时，所述启动子与所述基因可操作连接。当该增强子在被适当的转录因子结合时能够调节(例如，上调)该基因的表达时，所述增强子与所述基因可操作连接。

“重组”与其在本领域中的用法一致地用于指这样的核酸序列，所述核酸序列包含不作为单个序列的一部分天然一起存在的部分或相对于天然存在的序列已经重排的部分。通过涉及人工的过程产生和/或由通过人工产生的核酸(例如，通过复制、扩增、转录等的一个或多个循环)生成重组核酸。重组病毒是包含重组核酸的病毒。重组细胞是包含重组核酸的细胞。

如本文所用，术语“重组慢病毒载体”或“重组LV”是指人工产生的多核苷酸载体，其由LV和由于人工干预和操作而产生的多个附加区段组装而成。

关于“有效量”，意指相对于未治疗患者改善或消除疾病症状所需的药剂或包含所述药剂的组合物的量。用于实施本文所述的疾病治疗方法的组合物的有效量取决于施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。这样的量被称为“有效”量。

附图说明

图1展示了gp91

图2展示了用于探测增强子活性的构建体。

图3第16天增强子构建体在CB CD34+分化的嗜嗜中性粒细胞中的表达(CD11b+CD66b+CD15+CD16+)。

图4第16天增强子构建体在CB CD34+分化的单核细胞中的表达(CD11b+CD15+)。

图5显示了增强子构建体在转导的RAMO(B细胞系)D14流中的表达。

图6显示了增强子构建体在转导的Jurkat(T细胞系)D16流中的表达。

图7显示了第16天增强子构建体在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞中的表达(CD11b+CD66b+CD15+CD16+)。

图8显示了第16天增强子构建体在CB CD34+分化的单核细胞中的表达(CD11b+CD15+)。

图9显示了增强子构建体在转导的Jurkat(T细胞系)D16流中的表达。

图10显示了增强子构建体在转导的RAMO(B细胞系)D14流中的表达。

图11显示了E2-E4R-Int3-pro-mCit-WPRE载体(顶部)和其中mCitrine被Gp91

图12显示了第16天尺寸减小的载体在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞中的表达。

(CD11b+CD66b+CD15+CD16+)

图13显示了第16天尺寸减小的载体在CB CD34+分化的单核细胞中的表达。

(CD11b+CD15+)

图14显示了尺寸减小的载体在Jurkat细胞(T细胞系)中的表达。

图15显示了尺寸减小的载体在RAMOS细胞(B细胞系)中的表达。

图16显示了“核心”、“超核心”、“额外核心”和“额外超核心”构建体的原始小规模滴度。

图17显示了通过在PLB-985 X-CGD

图18显示了MSP-Gp91

图19展示了用于治疗X-CGD的慢病毒载体的一个实施方案。为了用于治疗，mCit报道分子将被替换为编码Gp91phox的核酸序列，例如，如本文所述。

图20的图A-B展示了用于治疗X-CGD的优化的慢病毒载体的一个实施方案。图A示意性地展示了UC 2-4R-Int3-pro-coGp91

图21展示了随着载体从原始2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE优化为核心变体和超核心(UC)变体在滴度(上图)和感染性(下图)方面的提高。UC变体(MyeloVec是主要候选载体)。

图22的图A-B显示，MyeloVec能够概括天然CYBB基因分别在血细胞(图A)和骨髓细胞(图B)中的内源性表达模式。

图23显示，MyeloVec能够概括天然CYBB基因在整个嗜中性粒细胞发育过程中的时间表达模式。随着嗜中性粒细胞的成熟，表达变得更高，模仿天然CYBB基因的模式。

图24显示了Gp91

图25显示了氧化酶活性到野生型水平的恢复。

图26显示了在外周血中的嗜中性粒细胞和单核细胞中Gp91

图27显示了在血液嗜中性粒细胞和单核细胞中氧化酶活性接近野生型水平的恢复。

图28显示了高水平的Gp91

图29显示了氧化酶活性的野生型水平的恢复。

图30显示了MyeloVec恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中Gp91

图31显示了MyeloVec恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中的细胞氧化酶活性的野生型水平的能力(DHR测定法)。

图32显示了MyeloVec在平均VCN为1.63时恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中的大量氧化酶活性的野生型水平的能力(细胞色素C测定法)。

具体实施方式

在各种实施方案中，提供了用于治疗(或预防)X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)的慢病毒载体。在某些实施方案中，优化载体以减小载体大小、提高表达水平和滴度。另外，在各种实施方案中，所述载体概括了天然CYBB基因的谱系特异性表达模式，例如，如本文所述(参见，例如，图1)。

如本文所述(参见，例如，实施例1)，基于组蛋白标记、DNA酶超敏反应位点和结合转录因子的序列基序，关于产生吞噬细胞抗微生物氧化酶系统的gp91

在天然CYBB拓扑相关结构域(TAD)中鉴定了十五个推定的内源性增强子元件。为了通过实验鉴定调节CYBB基因的关键增强子元件，将每个推定的增强子元件克隆到内源性CYBB启动子的上游以驱动报告基因(mCitrine)的表达(参见，例如，图2)。为了阐明每个假定的增强子元件的功能，我们测定了每种载体在脐带血(CB)CD34+分化的成熟嗜中性粒细胞和单核细胞以及RAMOS细胞(B淋巴细胞细胞系)中的活性，这些细胞是3个中靶的细胞谱系。

发现增强子元件4在成熟嗜中性粒细胞和单核细胞中驱动高水平表达，而在B细胞中无表达。还发现增强子元件2在B细胞中驱动高水平的谱系特异性表达，而在嗜中性粒细胞中无表达。在Jurkat(T细胞)中没有任何增强子元件表达，表明每个增强子元件的谱系特异性表达。

还发现增强子元件4由两个不同的增强子模块(4L和4R)组成，并且对它们进行评价以确定是否可以消除这些元件之一以减小载体的大小。

另外，制备并评价了增强子元件2、增强子元件4、内含子增强子3和CYBB内源启动子的减小的变体。还评价了Gp91

鉴于这些发现，在各种实施方案中，提供了用于治疗慢性肉芽肿病的重组慢病毒载体(LV)，其中所述载体包含包括核酸构建体的表达盒，所述核酸构建体包含CYBB内源性启动子或其有效片段；和与所述CYBB启动子或启动子片段可操作连接的gp91

在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含增强子元件2(参见，例如，表1，SEQ ID NO:4)或其有效片段。在某些实施方案中，增强子元件2的有效片段的序列包含增强子元件2“核心”的序列或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:5)。在某些实施方案中，增强子元件2的有效片段的序列由增强子元件2核心的序列组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:5)。在某些实施方案中，增强子元件2的有效片段的序列包含增强子元件2“超核心”或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:6)。在某些实施方案中，增强子元件2的所述有效片段的序列由增强子元件2超核心的序列组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:6)。

在某些实施方案中，包含慢病毒载体的表达盒进一步包含RELA TF结合位点或其有效片段。在某些实施方案中，RELA TF结合位点包含表1中的SEQ ID NO:7的核酸序列或由其组成。

在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含增强子元件4(参见，例如，表1，SEQ ID NO:8)或其有效片段。在某些实施方案中，所述表达盒包含增强子元件4R(参见，例如，表1，SEQ ID NO:9)或其有效片段。在某些实施方案中，所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述核酸序列包含增强子元件4R核心的核酸序列或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:10)。在某些实施方案中，所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列包含增强子元件4R“超核心”的核酸序列或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:11)。在某些实施方案中，所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列由增强子元件4R超核心的核酸序列组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:11)。

在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含增强子元件4L(参见，例如，表1，SEQ ID NO:12)或其有效片段。在某些实施方案中，增强子元件4L的有效片段包含4L核心序列的序列或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:13)。在某些实施方案中，增强子元件4L的有效片段由4L核心序列的序列组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:13)。

在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含内含子增强子元件3(参见，例如，表1，SEQ ID NO:14)或其有效片段。在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含内含子增强子元件3中间片段或由其组成，所述中间片段包含表1中的SEQ ID NO:15的核酸序列或由其组成。在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒由内含子增强子元件3中间片段组成，所述中间片段包含表1中的SEQ ID NO:15的核酸序列或由其组成。在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含内含子增强子元件3右片段或由其组成，所述右片段包含表1中的SEQ ID NO:16的核酸序列或由其组成。

在某些实施方案中，gp91

将认识到的是，在慢病毒载体的上下文中，本文所述的表达盒不必限于此上下文。因此，在某些实施方案中，考虑了包含本文所述的任何一种或多种CYBB调控元件的重组核酸。在某些实施方案中，重组核酸包含表达盒，例如在体内有效表达Gp91

表1.如本文所述用于治疗X-CGD的慢病毒载体的各种组分的核酸序列.

在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体(LV)可以具有各种“安全”特征，例如可以包括隔离子(例如，3'LTR中的FB隔离子)的存在。另外地或可替代地，在某些实施方案中，HIV LTR已被选择性启动子(例如CMV)取代，以产生更高滴度的载体，其在包装过程中不包含HIV TAT蛋白。其他强启动子(例如，RSV等也可以使用)。

在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体含有任何一种或多种通常发现于慢病毒载体中的元件。这样的元件包括但不必限于Ψ区载体基因组包装信号、Rev响应元件(RRE)、多嘌呤束(例如，中央多嘌呤束、3'多嘌呤束等)、翻译后调控元件(例如，修饰的土拨鼠转录后调控元件(WPRE))、隔离子等，例如，如下所述。

在各种实施方案中，所述载体是基本上不能通过重组使野生型慢病毒重构的SIN载体。

在某些实施方案中，所述载体包含在图20的图A中所示的“超核心”(UC)2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE的特征。在某些实施方案中，所述载体包含在图20的图B中表示的载体中所示的特征。在某些实施方案中，所述载体包含超核心(UC)2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE(SEQ ID NO:22)。

在各种实施方案中，所述载体显示在CD33+(大量髓系细胞)中高表达、和/或在CD19+(B细胞)中高表达、在CD66b+CD15+CD11b+CD16+(成熟嗜中性粒细胞)中高表达和/或在CD3+(T细胞)中低表达或无表达。在各种实施方案中，所述载体显示在CD33+(大量髓系细胞)中高表达、在CD19+(B细胞)中高表达、在CD66b+CD15+CD11b+CD16+(成熟嗜中性粒细胞)中高表达以及在CD3+T细胞中低表达或无表达。

如上所示，在实施例1中，本文所述的载体有效地以高滴度转导细胞并且还提供Gp91

鉴于这些结果，人们认为本文所述的LV，例如，表达Gp91

如上所述，在各种实施方案中，本文所述的LV可以包含各种安全特征。例如，HIVLTR已被CMV启动子取代，以产生更高滴度的载体，其在包装过程中不包含HIV TAT蛋白。在某些实施方案中，为了安全起见，可以将隔离子(例如，FB隔离子)引入到3'LTR中。还将LV构建为提供有效的转导和高滴度。

应当理解的是，前述元件是说明性的并且不必是限制性的。鉴于本文提供的教导，这些元件的适当取代将被本领域技术人员认识到并且被视为在本文提供的教导的范围内。

如上所述，在各种实施方案中，慢病毒载体可以包含CYBB基因或cDNA。然而，在某些实施方案中，Gp91phox编码核酸是密码子优化的。许多密码子优化方法是本领域技术人员已知的。一种说明性方法是JCat(Java Codon Adaptation Tool)。jCAT工具使基因密码子使用适应大多数已测序的原核生物和各种真核基因表达宿主。与许多工具相比，JCat不需要手动定义高表达基因，因此是一种非常快速和容易的方法。JCat用于密码子适应的其他选项包括避免限制酶和Rho非依赖性转录终止子的不需要的切割位点。JCat的输出为针对输入序列和新适应的序列给出的图形方式并且是密码子适应指数(CAI)值。JCat优化由Grote等人描述于(2005)Nucleic Acids Res.33(增刊2):W526–W531)，并且JCat工具可在www.jcat.de在线获得。

另一种密码子优化工具由GeneArt(来自ThermoFisher

又另一个密码子优化工具是IDT。开发IDT密码子优化工具来优化来自一种生物的DNA或蛋白质序列，以便在另一种生物中表达，这是通过基于每个密码子在所述新的生物中的使用频率重新分配密码子使用来实现的。例如，缬氨酸由4种不同的密码子(GUG、GUU、GUC和GUA)编码。然而，在人类细胞系中，优先使用GUG密码子(分别为46％使用与18％、24％和12％)。所述密码子优化工具将此信息考虑进去，并分配具有相同频率的缬氨酸密码子。另外，所述工具算法消除了频率低于10％的密码子，并将剩余频率重新归一化为100％。而且，所述优化工具降低了可能干扰制造和下游表达的复杂性，比如重复、发夹和极高GC含量。IDT优化工具可从IDT(整合DNA技术公司，Integrated DNA Technologies)(爱荷华州克拉威尔)获得，并可在ww.idtdna.com/CodonOpt找到。

其他密码子优化工具包括但不限于可在codonw.sourceforge.net找到的开源软件程序CodonW和来自GenScript的OptimumGene

在实施例1中说明的一个实施方案中，密码子优化的Gp91

这些密码子优化是说明性的而非限制性的。使用此处和实施例1中提供的教导，可以容易地针对特定应用优化Gp91

为了进一步提高安全性，在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体包含TAT非依赖性自失活(SIN)构型。因而，在各种实施方案中，希望在本文所述的LV中采用相对于野生型LTR具有降低的启动子活性的LTR区域。可以提供这样的构建体，其为有效“自灭活”(SIN)的，以提供生物安全特征。SIN载体是其中在转导细胞中全长载体RNA的产生大大减少或完全消除的载体。这个特征使出现具有复制能力的重组体(RCR)的风险最大限度地降低。此外，它使位于载体整合位点附近的细胞编码序列异常表达的风险降低。

此外，SIN设计使在LTR和驱动所述转基因表达的启动子之间的干扰的可能性降低。SIN LV通常可允许内部启动子的全活性。

SIN设计使LV的生物安全性提高。大多数HIV LTR由U3序列组成。U3区含有增强子和启动子元件，它们调节HIV基因组在感染细胞中的基础和诱导表达并且对细胞活化作出响应。这些启动子元件中有几个对于病毒复制是至关重要的。一些增强子元件在病毒分离物中高度保守，并被认为是病毒发病机制中的关键毒力因子。所述增强子元件可起作用而影响病毒在不同细胞靶标中的复制率

由于病毒转录开始于5'LTR的U3区的3'端，因此这些序列不是病毒mRNA的一部分，并且其来自3'LTR的拷贝用作用于生成在整合的原病毒中的两种LTR的模板。如果在逆转录病毒载体构建体中改变了U3区的3'拷贝，则所述载体RNA仍由生产细胞中的完整5'LTR产生，但不能在靶细胞中再生。转导这种载体导致子代病毒中两个LTR的失活。因此，逆转录病毒是自灭活(SIN)的，这些载体被称为SIN转移载体。

在某些实施方案中，通过在载体DNA(即，用于产生载体RNA的DNA)的3'LTR的U3区中引入缺失来实现自灭活。在RT期间，这种缺失被转移至原病毒DNA的5'LTR。通常，希望消除足够多的U3序列以大大减少或完全消除LTR的转录活性，从而大大减少或消除转导细胞中全长载体RNA的产生。然而，通常希望保留那些涉及病毒RNA多腺苷酸化的LTR元件，其为通常分布在U3、R和U5上的功能。因此，在某些实施方案中，希望从LTR消除尽可能多的转录重要基序，同时保留多腺苷酸化决定簇。

SIN设计详细描述于Zufferey等人(1998)J Virol.72(12):9873-9880，以及美国专利号5,994,136。然而，如其中所述，在3'LTR处的缺失程度有限制。首先，U3区的5'端在载体转移中发挥着另一个重要功能，对于整合是必需的(末端二核苷酸+att序列)。因而，末端二核苷酸和att序列可代表可以缺失的U3序列的5'边界。另外，一些松散定义的区域可以影响R区域中的下游多腺苷酸化位点的活性。从3'LTR过度删除U3序列可以降低载体转录物的多腺苷酸化，对生产细胞中载体的滴度和靶细胞中的转基因表达两者都具有不利影响。

在美国专利公开号2003/0039636中描述了另外的SIN设计。如其中所述，在某些实施方案中，从LTR去除的慢病毒序列被替换为来自非慢病毒逆转录病毒的可比较序列，从而形成杂合LTR。具体而言，LTR内的慢病毒R区可以全部或部分被来自非慢病毒逆转录病毒的R区替代。在某些实施方案中，优选地将慢病毒TAR序列(一种与TAT蛋白相互作用以增强病毒复制的序列)从R区全部去除。然后用来自非慢病毒逆转录病毒的R区的可比较部分替换TAR序列，从而形成杂合R区。可以进一步修饰LTR以去除慢病毒U3和U5区的全部或部分和/或用非慢病毒序列进行替换。

因此，在某些实施方案中，SIN构型提供包含缺乏其TAR序列的全部或部分的杂合慢病毒R区的逆转录病毒LTR，从而消除TAT的任何可能激活，其中所述TAR序列或其部分被替换为来自非慢病毒逆转录病毒的R区的可比较部分，从而形成杂合R区。在具体实施方案中，逆转录病毒LTR包含杂合R区，其中所述杂合R区包含缺乏TAR序列的HIV R区的一部分(例如，包含US 2003/0039636中的SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或由其组成的部分)，以及与HIV R区中缺乏的与TAR序列可比较的MoMSV R区的一部分(例如，包含2003/0039636中的SEQ ID NO:9中所示的核苷酸序列或由其组成的部分)。在另一个具体实施方案中，整个杂合R区包含2003/0039636中的SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或由其组成。

R区从其可衍生的适合的慢病毒包括例如HIV(HIV-1和HIV-2)、EIV、SIV和FIV。非慢病毒序列可以从其衍生的适合的逆转录病毒包括例如MoMSV、MoMLV、Friend、MSCV、RSV和泡沫病毒(Spumavirus)。在一个说明性实施方案中，所述慢病毒是HIV，并且所述非慢病毒逆转录病毒是MoMSV。

在US 2003/0039636中描述的另一个实施方案中，包含杂合R区的LTR是左(5')LTR并且进一步包含杂合R区上游的启动子序列。优选启动子是非慢病毒来源的并且包括例如来自非慢病毒逆转录病毒的U3区(例如MoMSV U3区)。在一个具体实施方案中，所述U3区包含US 2003/0039636中的SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，左(5')LTR进一步包含杂合R区下游的慢病毒U5区。在一个实施方案中，U5区是包括基因组整合必需的HIV att位点的HIV U5区。在另一个实施方案中，所述U5区包含US 2003/0039636中的SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。在又另一个实施方案中，所述整个左(5')杂合LTR包含US2003/0039636中的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在另一个说明性实施方案中，包含杂合R区的LTR是右(3')LTR并且进一步包含杂合R区上游的修饰的(例如，截短的)慢病毒U3区。修饰的慢病毒U3区可以包括att序列，但缺乏任何具有启动子活性的序列，从而引起载体为SIN，因为病毒转录不能超过染色体整合后的第一轮复制。在具体实施方案中，杂合R区上游的修饰的慢病毒U3区由慢病毒(例如，HIV)U3区的3'端组成，直到并包括慢病毒U3 att位点。在一个实施方案中，所述U3区包含US2003/0039636中的SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，右(3')LTR进一步包含杂合R区下游的多腺苷酸化序列。在另一个实施方案中，所述多腺苷酸化序列包含US2003/0039636中的SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。在又另一个实施方案中，所述整个右(5')LTR包含US 2003/0039636中的SEQ ID NO:2或17所示的核苷酸序列。

因而，在基于HIV的LV的情况下，已发现这样的载体耐受显著的U3缺失，包括去除LTR TATA框(例如，从-418到-18的缺失)，而没有显著降低载体滴度。这些缺失使LTR区基本上没有转录活性，因为LTR的转录能力降低到约90％或更低。

还已经证明，如果转移载体构建体中的上游LTR的一部分被组成型活性启动子序列替换，则Tat的反式作用功能变得可有可无(参见，例如，Dull等人(1998)J Virol.72(11):8463–8471。此外，我们表明，rev以反式表达允许从仅含gag和pol的包装构建体生产高滴度的HIV衍生的载体原种。这种设计使包装功能的表达以仅在生产细胞中可用的互补为条件。生成的基因递送系统仅保留了HIV-1的九个基因中的三个，并依赖于四个独立的转录单位来生产转导颗粒。

在实施例1中展示的一个实施方案中，表达gp91

将认识到的是，CMV启动子通常提供高水平的非组织特异性表达。其他具有相似组成活性的启动子包括但不限于RSV启动子和SV40启动子。也可以使用哺乳动物启动子，比如β-肌动蛋白启动子、泛素C启动子、延伸因子1α启动子、微管蛋白启动子等。

前述SIN构型是说明性的而非限制性的。许多SIN构型对于本领域技术人员是已知的。如上所述，在某些实施方案中，LTR转录降低了约95％至约99％。在某些实施方案中，可以使LTR失去至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的转录活性。

在某些实施方案中，为了进一步增强生物安全性，将隔离子插入到本文所述的慢病毒载体中。隔离子是存在于整个基因组的DNA序列元件。它们结合修饰染色质并改变区域基因表达的蛋白质。在本文所述的载体中放置隔离子提供了各种潜在的好处，包括，除其他外：1)保护载体免于侧翼染色体表达的位置效应变异(即，屏障活性)；和2)保护侧翼染色体免于通过载体对基因表达的插入反式激活(增强子阻断)。因而，隔离子可以帮助保持嵌入基因组或遗传背景中的基因或转录单位的独立功能，其中它们的表达可能另外受到基因组或遗传背景中的调节信号的影响(参见，例如，Burgess-Beusse等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:16433；和Zhan等人(2001)Hum.Genet.,109:471)。在本上下文中，隔离子可以有助于保护慢病毒表达的序列免受整合位点影响，这可由基因组DNA中存在的顺式作用元件介导，并导致转移序列的表达失调。在各种实施方案中，提供了LV，其中将隔离子序列插入到一个或两个LTR中或整合到细胞基因组中的载体区域中的别处。

第一个和最佳表征的脊椎动物染色质隔离子位于鸡β-珠蛋白基因座控制区内。这个元件含有DNA酶I超敏感位点4(cHS4)，似乎构成了鸡β-珠蛋白基因座的5'边界(Prioleau等人(1999)EMBO J.18:4035-4048)。含有cHS4元件的1.2-kb片段显示出经典的隔离子活性，包括阻断细胞系中的珠蛋白基因启动子和增强子相互作用的能力(Chung等人(1993)Cell,74:505-514)，以及保护在果蝇(Id.)、转化细胞系(Pikaart等人(1998)GenesDev.12:2852-2862)和转基因哺乳动物(Wang等人(1997)Nat.Biotechnol.,15:239-243；Taboit-Dameron等人(1999)Transgenic Res.,8:223-235)中的表达盒免受位置效应影响的能力。这种活性的大部分包含在一个250-bp片段中。在这一段中是一个49-bp的cHS4核心(Chung等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,94:575-580)，它与增强子阻断测定法中涉及的锌指DNA结合蛋白CTCF相互作用(Bell等人(1999)Cell,98:387-396)。

一种说明性的和适合的隔离子是FB(FII/BEAD-A)，为一种77bp的隔离子元件，其含有鸡β-珠蛋白5’HS4隔离子的最小CTCF结合位点增强子阻断组分和来自人T细胞受体α/δ阻断元件α/δI(BEAD-I)隔离子的同源区，如由Ramezani等人在(2008)Stem Cell 26:3257-3266中描述。FB“合成”隔离子具有完全的增强子阻断活性。此隔离子是说明性的而非限制性的。可以使用其他适合的隔离子，包括例如全长鸡β-珠蛋白HS4或其隔离子亚片段、锚蛋白基因隔离子和其他合成隔离子元件。

在各种实施方案中，本文所述的载体进一步包含包装信号。“包装信号”、“包装序列”或“PSI序列”是足以指导其序列包含包装信号的核酸包装到逆转录病毒颗粒中的任何核酸序列。所述术语包括天然存在的包装序列，还有其工程化变体。包括慢病毒在内的许多不同的逆转录病毒的包装信号是本领域已知的。SEQ ID NO:25提供了一种说明性的而非限制性的PSI。

在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体包含Rev响应元件(RRE)以增强未剪接RNA的核输出。RRE是本领域技术人员熟知的。说明性RRE包括但不限于位于HIV NL4-3基因组(Genbank登录号AF003887)中第7622-8459位的RRE，比如，以及来自其他HIV毒株或其他逆转录病毒的RRE。这样的序列可容易地从Genbank或URLhiv-web.lanl.gov/content/index的数据库获得。一个说明性而非限制性的RRE显示在SEQ ID NO:26中。

在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体进一步包括多嘌呤束(例如，中央多嘌呤束(cPPT)、3'多嘌呤束(3'PPT))。已知在慢病毒(例如，HIV-1)载体构建体中插入含有3'PPT(参见，例如，SEQ ID NO:28)或中央多嘌呤束(cPPT)的片段提高了转导效率。

在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体(LV)可包含多种转录后调控元件(PRE)中的任一种，其在转录物中的存在增加了异源核酸(例如，gp91

一种类型的PRE是位于表达盒内的内含子，其可以刺激基因表达。然而，内含子可以在慢病毒的生命周期事件期间被剪接。因此，如果将内含子用作PRE，通常将它们以与载体基因组转录物相反的方向放置。

不依赖剪接事件的转录后调控元件提供了在病毒生命周期中不被去除的优势。一些实例是单纯疱疹病毒的转录后加工元件、乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在这些元件中，WPRE通常是优选的，因为它含有在HPRE中未见的另外的顺式作用元件。这个调控元件通常位于载体内以便被包含在转基因的RNA转录物中，但在转基因翻译单元的终止密码子之外。

WPRE在美国专利第6,136,597号中被表征和描述。如其中所述，WPRE是介导RNA从细胞核到细胞质的有效转运的RNA输出元件。它通过插入顺式作用核酸序列来增强转基因的表达，从而使元件和转基因包含在单个转录物中。显示有义方向的WPRE的存在使转基因表达增加多达7到10倍。逆转录病毒载体以cDNA的形式转移序列，而不是完整的含有内含子的基因，因为内含子通常在导致逆转录病毒颗粒形成的一些列事件的过程中被剪接。内含子介导初级转录物与剪接机制的相互作用。因为通过剪接机制加工RNA促进了它们的细胞质输出，由于剪接和转运机制之间的耦合，cDNA通常以低效率表达。因而，将WPRE(参见，例如，SEQ ID NO:27)包含在载体中导致转基因表达增强。

本文所述的重组慢病毒载体(LV)和生成的病毒能够将异源核酸序列(例如，gp91

在某些实施方案中，经由转染将载体引入到包装细胞系中。所述包装细胞系产生含有载体基因组的病毒颗粒。转染方法是本领域技术人员熟知的。在将包装载体和转移载体共转染到包装细胞系后，从培养基中回收重组病毒并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。因而，可以通过磷酸钙转染、脂转染或电穿孔将所述包装构建体引入人细胞系中，通常与诸如新霉素、DHFR、谷氨酰胺合成酶之类的显性选择标记一起使用或不用所述显性选择标记，随后在存在适当药物的情况下进行选择，然后分离克隆。在某些实施方案中，所述选择标记基因可以与构建体中的包装基因物理连接。

其中包装功能被配置为由适合的包装细胞表达的稳定细胞系是已知的(参见，例如，描述包装细胞的美国专利第5,686,279号)。一般而言，对于病毒颗粒的生产，人们可以使用与慢病毒Gag和Pol基因的表达相容的任何细胞，或者可以工程改造任何细胞来支持这样的表达。例如，可以使用诸如293T细胞和HT1080细胞等生产细胞。

具有掺入其中的慢病毒载体的包装细胞形成生产细胞。因而，生产细胞是可以产生或释放携带感兴趣的治疗基因(例如，Gp91

因此，在某些实施方案中，提供了将基因递送至细胞的方法，然后将其整合到细胞的基因组中，所述方法包括使所述细胞与含有本文所述的慢病毒载体的病毒粒子接触。可以使细胞(例如，呈组织或器官的形式)与病毒粒子离体接触(例如，感染)，然后将其递送至其中将表达所述基因(例如，gp91

在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体在从骨髓、外周血或脐带血中获得的人造血祖细胞或造血干细胞的转导中以及在CD4

仍然在其他实施方案中，提供了用于转导人类造血干细胞的方法。在某些实施方案中，所述方法涉及使包括造血干细胞的人细胞群与前述慢载体之一在通过所述载体实现所述群中的人造血祖细胞转导的条件下接触。可以体内或体外转导所述干细胞，具体取决于最终应用。即使在人基因疗法的背景下，比如人干细胞的基因疗法，人们也可以体内转导干细胞，或者体外转导，然后将转导的干细胞输注到人类受试者中。在这个实施方案的一个方面，可以使用本领域技术人员熟知的方法从人例如X-CGD患者移出人干细胞，并如上所述进行转导。然后将转导的干细胞重新引入到相同或不同的人的体内。

在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体对于从骨髓、外周血或脐带血中获得的人造血祖细胞或造血干细胞(HSC)的转导以及在CD4

当离体转导细胞，例如CD34

在某些实施方案中，基于细胞的疗法涉及提供干细胞和/或造血前体，用编码例如Gp91

在某些实施方案中，所述方法涉及从受试者分离细胞群，例如干细胞，任选地在组织培养物中扩增细胞，并施用慢病毒载体，所述慢病毒载体在细胞内的存在导致在所述细胞中体外产生Gp91

在一些说明性而非限制性的实施方案中，可以使用细胞群，其可以是来自细胞系或来自除受试者之外的个体的细胞。从受试者分离干细胞、免疫系统细胞等并将它们返回给受试者的方法是本领域熟知的。这样的方法用于，例如，在经历化学疗法的患者中的骨髓移植、外周血干细胞移植等。

在使用干细胞的情况下，将认识到的是，这样的细胞可以衍生自多种来源，包括骨髓(BM)、脐带血(CB)、动员的外周血干细胞(mPBSC)等。在某些实施方案中，考虑使用诱导的多能干细胞(IPSC)。分离造血干细胞(HSC)、转导这样的细胞并将它们引入到哺乳动物受试者中的方法是本领域技术人员熟知的。

在某些实施方案中，通过将Gp91

在某些实施方案中，考虑通过直接引入本文描述的载体直接治疗受试者。可将慢病毒组合物配制成通过任何可用途径递送，包括但不限于，肠胃外(例如，静脉内)、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、透皮(局部)、经粘膜、经直肠和经阴道。常用的递送途径包括吸入、肠胃外和经粘膜。

在各种实施方案中，药物组合物可包括LV与药学上可接受的载体的组合。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。组合物中还可掺入补充的活性化合物。

在一些实施方案中，将活性剂，即本文所述的慢病毒和/或与所述载体(vector)一起施用的其他药剂，与将保护化合物免于从体内快速消除的载体(carrier)比如控释制剂一起制备，所述控释制剂包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，比如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的组合物的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。适合的材料也可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺瓦药物公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商购获得。还可以使用脂质体作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利第4,522,811号中所述。在一些实施方案中，所述组合物靶向特定的细胞类型或被病毒感染的细胞。例如，可以使用针对细胞表面标志物例如内源性标志物或在感染细胞表面上表达的病毒抗原的单克隆抗体来靶向组合物。

配制剂量单位形式的组合物是有利的，以便易于施用并且剂量一致。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位包含经计算与药物载体联合产生期望的治疗作用的预定量的LV。

单位剂量不需要以单次注射的形式施用，而是可以包括在设定的时间段内的连续输注。本文所述的LV的单位剂量可以方便地用慢病毒载体的转导单位(T.U.)加以描述，如通过在诸如HeLa或293的细胞系上滴定所述载体所定义的。在某些实施方案中，单位剂量可以在10

可以根据需要以不同的间隔和不同的时间段施用药物组合物，例如每周一次，持续约1周至约10周；约2周至约8周；约3周至约7周；约4周；约5周；约6周等。可能需要在不确定的基础上施用治疗组合物。本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括但不局限于疾病或疾患的严重性、先前的治疗、所述受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。患有LV的受试者的治疗可以包括单一治疗，或者在许多情况下，可以包括一系列治疗。

说明性而非限制性的基因疗法载体的施用剂量和确定适合剂量的方法是本领域已知的。进一步理解的是，LV的适当剂量可能取决于特定的接受者和施用方式。对任何特定的受试者的适当剂量水平可能取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率、施用的其他治疗剂等。

在某些实施方案中，本文所述的慢病毒基因疗法载体可以通过例如静脉内注射、局部施用或通过立体定向注射递送至受试者(参见，例如，Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3054)。在某些实施方案中，载体可以口服或吸入方式递送，并且可以被封装或以其他方式操作以保护它们免于降解、增强组织或细胞的摄取等。药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的LV，或者可以包括其中嵌入LV的缓释基质。可替代地或另外地，当载体可以由重组细胞完整产生时，正如本文所述的逆转录病毒或慢病毒载体的情况，药物制剂可以包括一种或多种产生载体的细胞。包含本文所述的LV的药物组合物可以任选地与施用说明书一起容纳在容器、包装或分配器中。

前述组合物、方法和用途旨在是说明性而非限制性的。使用本文提供的教导，在组合物、方法和用途方面的其他变化对于本领域的技术人员来说将是容易获得的。

本实施例描述了用于治疗X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)的新型慢病毒载体的开发。具体而言，我们描述了一种或多种载体的开发，其显示出的表达水平高于正在经历X-CGD临床试验的当前慢病毒载体(pChim-CYBB，又名MSP-Gp91

我们已经实施了生物信息学方法来阐明调控人类基因组中的内源性CYBB基因的元件。天然CYBB拓扑相关结构域(TAD)包含600kb的窗口，其跨越CYBB基因上游100kb到下游500kb的范围。因而，这个CYBB TAD在人类基因组中提供了一个600,000个碱基对的窗口，用于正确调控所述基因。

我们试图阐明在600,000个碱基对的窗口内的功能增强子元件，并将重要元件包装在少于9,000个碱基对的慢病毒载体中。使用生物信息学方法，鉴定了在天然CYBB拓扑相关结构域(TAD)中的十五个推定的内源性元件。

为了通过实验鉴定调控CYBB基因的关键增强子元件，将每个推定的增强子元件克隆到内源性CYBB启动子的上游以驱动报告基因(mCitrine)的表达(参见，例如，图2)。为了阐明每个假定的增强子元件的功能，我们测定了每种载体在脐带血(CB)CD34+分化的成熟嗜中性粒细胞和单核细胞以及RAMOS细胞(B淋巴细胞细胞系)中的活性，这些细胞是3个中靶的细胞谱系。将所有载体与MSP-mCit-WPRE构建体比较。

如图3中所示，增强子元件4驱动成熟嗜中性粒细胞中的高水平表达。另外，表达水平显著高于使用正在经历临床试验的当前X-CGD载体获得的表达水平。类似地，如图4中所示，增强子元件4也驱动单核细胞中的高水平表达，并且再次表达水平显著高于使用正在经历临床试验的当前X-CGD载体获得的表达水平。

图5显示增强子元件2驱动B细胞中的高水平的谱系特异性表达。在Jurkat(T细胞)中没有任何增强子元件表达，表明每个增强子元件的谱系特异性表达(参见，图6)。相比之下，MSP-mCit-WPRE构建体显示出最高水平的脱靶表达。

因而，似乎增强子元件4赋予成熟嗜中性粒细胞和单核细胞中增加的谱系特异性表达并且显示出比MSP-mCit-WPRE载体高2倍的表达。在T细胞(Jurkat)或B细胞(RAMO)中未观察到增强子元件4驱动的表达。增强子元件2似乎赋予B细胞(RAMO)中增加的谱系特异性表达。在嗜中性粒细胞、单核细胞或T细胞中未观察到增强子元件2驱动的表达。

因而确定将增强子元件2和4掺入慢病毒载体中，以设计在嗜中性粒细胞、单核细胞和B细胞中具有中靶谱系特异性表达的载体。我们注意到增强子元件4由两个不同的增强子模块(4L和4R)组成，并且对它们进行评价以确定是否可以消除这些元件之一以减小载体的大小。

因此，产生了五个用于评价的新载体。这些是4L-Int3-pro-mCit-WPRE、4R-Int3-pro-mCit-WPRE、2+4L-Int3-pro-mCit-WPRE、2+4R-Int3-pro-mCit-WPRE和2+4-Int3-pro-mCit-WPRE。在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞和单核细胞中以及在RAMO和Jurkat中评价了这些新载体。

如图7所示，增强子元件4的两个片段4L和4R在嗜中性粒细胞中协同作用。然而，单独的元件4R仍然比MSP载体(正在经历临床试验的当前载体)具有更高的表达。在单核细胞中，所述4R片段似乎与整个元件4以相似的水平表达(参见，图8)。谱系特异性得以维持(参见，图9)。与MSP-mCit-WPRE(正在经历临床试验的当前载体)不同，所有候选载体在T细胞中均未提供脱靶表达。另外，增强子元件2的掺入似乎增加了B细胞中的表达(参见图10)。

鉴于这些结果，我们得出结论，元件4的右半部分(4R)似乎是嗜中性粒细胞和单核细胞中的谱系特异性增强子活性的关键贡献者。然而，4L和4R在嗜中性粒细胞中组合在一起时似乎具有协同的表达增加，并且在单核细胞中组合在一起时似乎具有相加作用。当与髓样增强子元件4，即4L或4R中的任一者结合时，元件2仍然是B细胞增强子，并且在骨髓谱系中是惰性的。载体2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞和单核细胞中的表达是MSP-mCit-WPRE的1.6倍。然而，它在RAMO细胞(B细胞谱系)中具有50％的MSP-mCit-WPRE表达，但这可能是对于治疗剂足够的表达量。

2-4Full-Int3-pro-mCit-WPRE在嗜中性粒细胞和单核细胞中的表达分别是MSP-mCit-WPRE的2倍和1.6倍。

一种特别感兴趣的X-CGD载体候选物是2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE，其中mCit可以替换为编码Gp91

另一个目标是在保持表达的同时减小载体的大小。在某些实施方案中，设计的缺失可以产生“核心”和“超核心”变体。修饰分别产生7.6kb和5.9kb的载体(在ORF中具有Gp91

全长元件2包含1092个碱基对。产生200个bp的缺失，以生成892个bp的“核心”变体(参见，例如，表1，SEQ ID NO:5)。产生745个bp的缺失，以生成347个bp的增强子元件2“超核心”变体(参见，例如，表1，SEQ ID NO:6)。

类似地，全长元件4R包含995bp，并且产生496bp的缺失，以生成500bp的增强子元件4R“核心”变体(参见，例如，表1，SEQ ID NO:10)。产生741个bp的缺失，以生成254个bp的元件4R增强子“超核心”变体(参见，例如，表1，SEQ ID NO:11)。

类似地，使内含子3增强子(1778bp)产生242个bp的缺失以生成1536个bp的内含子3增强子“核心”变体，并产生1058bp缺失以生成720bp内含子3增强子“超核心”片段，其包含中间片段(参见，例如，表1，SEQ ID NO:15)和右片段(参见，例如，表1，SEQ ID NO:16)。

使507个bp的全长CYBB内源性启动子(参见，例如，表1，SEQ ID NO:1)产生240bp缺失以生成267个bp的CYBB启动子“核心”片段(SEQ ID NO:2)，并且产生337个bp的缺失以生成最小CYBB启动子“CYBB超核心启动子”(参见，例如，表1，SEQ ID NO:3)。

通过产生“核心”和“超核心”缺失，载体大小分别减小了1182bp和2882bp，如表2中所示。

表2.“核心”和“超核心”载体变体的大小

另外，在某些实施方案中，包括“额外”片段。因而，例如，我们假设RELA TF结合位点可以增加B细胞表达。RELA在包括炎症和免疫在内的许多细胞过程中发挥作用。而且，在RELA结合位点存在B细胞谱系特异性DNAseI超敏反应。因此，在某些实施方案中，TF结合足迹可以被包括在元件2组分中(参见，例如，表1，SEQ ID NO:7)。

另外，在某些实施方案中，4L“核心”变体或4L“超核心”变体可以被包括在4R组分中。这些“额外”片段构建体的大小也显示在表2中。

测试了表3中所示的构建体：

表3.测试了慢病毒构建体。

与E2-E4R-Int3-pro-mCit-WPRE构建体或当前临床载体(MSP-Gp91

所有超核心和额外超核心变体载体在Jurkat细胞中均显示低表达(低于当前临床载体)(图14)。

如图16所示，超核心载体和额外超核心载体显示出比核心和额外核心变体更高的滴度。

鉴于此，我们得出结论，通过对我们的先导载体产生2.9kb的缺失，我们增加了表达如下：

·嗜中性粒细胞中增加180％(是MSP的3.4倍)

·单核细胞中增加150％(是MSP的2.2倍)

·RAMO(B细胞系)中增加129％(是MSP的1.16倍)

所述载体还保留了特异性，没有T细胞表达(无变化)。另外，通过产生1.2kb的缺失，我们降低了表达如下：

·嗜中性粒细胞中降低15％

·单核细胞中降低33％

·RAMOS(B细胞系)中降低6％

在某些实施方案中，一种特别适合的载体是2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE的超核心变体(UC 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE)。mCitrine的ORF可以替换为治疗性转基因(Gp91

而且，为了使表达和滴度最大化，评价了许多不同的密码子优化。这些包括jCAT、GeneArt、IDT、当前临床载体中的密码子优化序列(MSP-Gp91

我们最初筛选了Int3-pro-Gp91

可以将前导密码子优化序列转移至本文所述的各种X-CGD载体。我们注意到，密码子优化是为了优化特定物种(甚至可能是细胞类型)内的表达，然而理想的密码子优化应该与从其表达的哪种启动子/载体无关。

如图17中所示，gp91

鉴于上述情况，我们得出结论，jCAT是Gp91

通过实施生物信息学指导的方法，我们合理地设计了一种具有严格的谱系和阶段特异性表达的新型X-CGD慢病毒载体，其模拟天然CYBB基因的表达模式。一种先导候选载体是超核心：UC 2-4R-Int3-pro-Gp91phox(jCAT)-WPRE载体，例如，如图20的图A所示。这种载体的图谱如图20的图B所示，并将所述序列显示在表1中(SEQ ID NO:22)。

上面的实施例1描述了优化的先导候选载体：UC 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE(又名

筛选了许多不同的密码子优化，并决定用jCAT密码子优化Gp91

如本文所述，通过将转导的人类健康供体(HD)脐带血(CB)CD34+细胞移植到NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠中证明了MyeloVec(表达mCitrine)的体外谱系特异性表达。另外，MyeloVec(表达密码子优化的Gp91

1)转导鼠X-CGD谱系阴性(Lin-)造血干细胞和祖细胞细胞(HSPC)并且在体外分化为嗜中性粒细胞来评价Gp91

2)将鼠X-CGD Lin-HSPC转导并将细胞移植到同源B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(Pepboy)小鼠中，以证明所述疾病的体内功能正确；以及

3)转导人类X-CGD患者的细胞并且在体外分化为嗜中性粒细胞，以证明Gp91

图21证明了随着我们将我们的载体从原始2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE优化为核心变体和超核心(UC)变体在滴度(上图)和感染性(下图)方面的提高。随着我们将我们的载体的大小从原始2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE减小到核心变体和超核心(UC)变体，我们提高了滴度和传染性。

如图22所示，MyeloVec(表达mCitrine)能够概括天然CYBB基因的内源性表达模式。在本实验中，我们转导了健康供体(HD)脐带血(CB)CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)，并将所述细胞移植到NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠中。所述基因修饰的细胞将产生造血系统的所有不同谱系。通过评价哪些谱系表达mCitrine以及表达程度，我们可以确定我们的载体的谱系特异性表达模式，并判断它是否模拟了天然CYBB基因的内源性表达模式。

MyeloVec能够概括天然CYBB基因的内源性表达模式--在嗜中性粒细胞中非常高的表达、高的大量骨髓表达、中等水平的B细胞表达以及在T细胞和HSPC中的最小表达。这显示在血液(图22，图A)和骨髓(图22，图B)中。

MyeloVec也能够概括天然CYBB基因在整个嗜中性粒细胞发育过程中的时间表达模式。随着嗜中性粒细胞的成熟，表达变得更高，从而模仿天然CYBB基因的模式(参见，例如，图23)。

因而，在移植到NSG小鼠中的转导的人脐带血CD34+细胞中，来自MyeloVec的mCitrine表达模式概括了Gp91

表4.MyeloVec的表达模式

然后，我们用Gp91

图24和25展示了MyeloVec在体外对小鼠X-CGD HSPC中的X-CGD表型进行功能校正的能力。对于本实验，我们转导了鼠X-CGD谱系阴性(Lin-)造血干细胞和祖细胞(HSPC)，并使细胞分化为成熟嗜中性粒细胞，以证明我们的先导候选载体(UC-2-4R-Int3-pro-Gp91

如图24所示，MyeloVec被认为比当前临床载体(MSP)可以恢复从X-CGD小鼠HPSC分化的嗜中性粒细胞中的更高水平的Gp91

图26-29展示了MyeloVec在X-CGD小鼠模型中体内校正X-CGD表型的能力。简言之，从X-CGD小鼠分离HPSC，并用MyeloVec转导。然后将基因修饰的细胞移植到同源B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(Pepboy)小鼠中。移植后16周收获小鼠，用于分析跨不同造血谱系的Gp91

在外周血中的嗜中性粒细胞和单核细胞中恢复了高水平的Gp91

为了证明MyeloVec在体外在功能上校正人类患者X-CGD细胞的能力，我们用MyeloVec转导人类X-CGD HSPC，并在体外使所述细胞分化为成熟嗜中性粒细胞。然后，我们通过DHR测定法和细胞色素C测定法测量了Gp91

因而，通过实施基于生物信息学的设计方法，我们开发了我们的先导候选X-CGD载体UC-2-4R-Int3-pro-coGp91

上述实验证明了在鼠X-CGD小鼠模型中体内校正X-CGD表型的能力。在移植到受到致命照射的PepBoy小鼠中的转导的鼠X-CGD Lin-细胞中：

MyeloVec能够使

MyeloVec在VCN为1.74或更高时在

在平均VCN为1.63时来自用MyeloVec转导的人X-CGD患者CD34+HSPC的体外分化的嗜中性粒细胞使Gp91

应该理解的是，在本文中描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并依照它们的各种修改或改变将对本领域技术人员作出暗示并且将被包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。出于所有目的，将本文中引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文。

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序列表

<110> 加州大学董事会(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA)

唐纳德·B·科恩(KOHN, DONALD B.)

王瑞安·L(WONG, RYAN L.)

罗格·P·霍利斯(HOLLIS, ROGER P.)

<120> 治疗X连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体

<130> UCLAP218PUS

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

tagcacataa aattggcaca tattaagcat tttgtaaata tcaaccatta caattgttac 60

tacttttctc agcaaggcta tgaatgctgt tccagcctgt caaaatcaca cctgtttaat 120

gtgttttacc cagcacgaag tcatgtctag ttgagtggct taaaaattgt gatcaaatag 180

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tatctcttag ttgtagaaat tggtttcatt ttccactatg tttaattgtg actggatcat 300

tatagaccct ttttttgtag ttgttgaggt ttaaagattt aagtttgtta tggatgcaag 360

cttttcagtt gaccaatgat tattagccaa tttctgataa aagaaaagga aaccgattgc 420

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<210> 2

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 减小的CYBB启动子

<400> 2

tatctcttag ttgtagaaat tggtttcatt ttccactatg tttaattgtg actggatcat 60

tatagaccct ttttttgtag ttgttgaggt ttaaagattt aagtttgtta tggatgcaag 120

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cccagggctg ctgttttcat ttcctcattg gaagaagaag catagtatag aagaaaggca 240

aacacaacac attcaacctc tgccacc 267

<210> 3

<211> 170

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 3

tttaagtttg ttatggatgc aagcttttca gttgaccaat gattattagc caatttctga 60

taaaagaaaa ggaaaccgat tgccccaggg ctgctgtttt catttcctca ttggaagaag 120

aagcatagta tagaagaaag gcaaacacaa cacattcaac ctctgccacc 170

<210> 4

<211> 1092

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

gcttagtcat gttggtccca aagtcatagt tgatgagaag tagcaagtta agagagaaag 60

acttctagag ataggtacat acacaatgat aacaagtgac atcagagaac ctaaggaagg 120

gcaaagaaag aaacactgca aagcagactc aaacacttaa aagcatagca gcttggggcc 180

agttagtgta agagaaaagg agctccatat gcctcaatag aacctaagag catcattgta 240

ctgcatttat tcattcattc acttcacatg tttattcaac aaatgctatg tatactgaga 300

tttttctctg gtcattgtac tggctagaac ctaaaggagt gagactatta attagagttt 360

acaatctggc aatgatatta acagtctatt cacaaaaggg ttaactcaag ttaagccggc 420

ctaaatgttt atgcaaaata ggatttttgc ctaagtctaa agggtatcag aaaagtgtag 480

ccattgagaa tgactcattt catggtgttc tcggatggct taagtattat taatatgtct 540

ccatttctag tgcaggaacc tccacgtttt agaggaaagg aggaaagaat ttgtgaagac 600

tgtgcctaaa aaaggtagaa atttgtttac aatttattta aagataaaag taaagaacta 660

ggttgcttta aaaaagggag ggaaagaaaa tcaaaataca tcttatttga ggcattaaaa 720

cttttttaag aaaataaaat ttaaaataaa gttgtattct tctaaaaata attttttaaa 780

ccagctgaaa atgaaaaatg cagattatac taagaagcaa ctgttttaca ttctgctttc 840

tgaatggtat ttaaaaactc agttattttc agaaatgagg aagtcttgat ctgctagatg 900

aaggtcggct gcaggtggtg tttattgctt tatgatggca acaaaccgta aacccatcac 960

tcagtaaata ttaaactggc tgaatgaatc caaagcatgt ctaacataca ggaaaaacac 1020

agccctgtta agcagtcttg aaacccacaa gctacatgga aaacacagat tcaactacat 1080

cataaaaatt ca 1092

<210> 5

<211> 892

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 5

gagctccata tgcctcaata gaacctaaga gcatcattgt actgcattta ttcattcatt 60

cacttcacat gtttattcaa caaatgctat gtatactgag atttttctct ggtcattgta 120

ctggctagaa cctaaaggag tgagactatt aattagagtt tacaatctgg caatgatatt 180

aacagtctat tcacaaaagg gttaactcaa gttaagccgg cctaaatgtt tatgcaaaat 240

aggatttttg cctaagtcta aagggtatca gaaaagtgta gccattgaga atgactcatt 300

tcatggtgtt ctcggatggc ttaagtatta ttaatatgtc tccatttcta gtgcaggaac 360

ctccacgttt tagaggaaag gaggaaagaa tttgtgaaga ctgtgcctaa aaaaggtaga 420

aatttgttta caatttattt aaagataaaa gtaaagaact aggttgcttt aaaaaaggga 480

gggaaagaaa atcaaaatac atcttatttg aggcattaaa acttttttaa gaaaataaaa 540

tttaaaataa agttgtattc ttctaaaaat aattttttaa accagctgaa aatgaaaaat 600

gcagattata ctaagaagca actgttttac attctgcttt ctgaatggta tttaaaaact 660

cagttatttt cagaaatgag gaagtcttga tctgctagat gaaggtcggc tgcaggtggt 720

gtttattgct ttatgatggc aacaaaccgt aaacccatca ctcagtaaat attaaactgg 780

ctgaatgaat ccaaagcatg tctaacatac aggaaaaaca cagccctgtt aagcagtctt 840

gaaacccaca agctacatgg aaaacacaga ttcaactaca tcataaaaat tc 892

<210> 6

<211> 347

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 6

aaatcaaaat acatcttatt tgaggcatta aaactttttt aagaaaataa aatttaaaat 60

aaagttgtat tcttctaaaa ataatttttt aaaccagctg aaaatgaaaa atgcagatta 120

tactaagaag caactgtttt acattctgct ttctgaatgg tatttaaaaa ctcagttatt 180

ttcagaaatg aggaagtctt gatctgctag atgaaggtcg gctgcaggtg gtgtttattg 240

ctttatgatg gcaacaaacc gtaaacccat cactcagtaa atattaaact ggctgaatga 300

atccaaagca tgtctaacat acaggaaaaa cacagccctg ttaagca 347

<210> 7

<211> 556

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 修饰的CYBB增强子元件

<400> 7

aactgcccag gccatccaca gatgactgta gatacatgtg taagttcagt tcacatcctc 60

agaaccaccc agatgtcctg tagatgcatg agaaatgtta aatgcttgtt gttttaagcc 120

actaacttca gagtagtttg ttatataaca aaaccgctga tgcaaatggc atcaaaaatt 180

gttgaaagag agatgggggt tcagggtgag agctgtaggt gattgtatct gtgctaatac 240

cacatagccc ttttttgggg attgccatga ataatatatt agctttgcta tgagtaaaat 300

actatatcct ctgaattgtc atgaattacg tggagtcata cgtgttttgg aagtgtgaaa 360

gtccctgggc tcagataaaa ggtgttgcca tctggaaagt acaggtagtt tatttcaatt 420

ctgctccaat aactagcacg tcattccatt catgtagaaa taagctactg gctatctcac 480

tatctgaaat agaagtatga actgtgggta agtgggtgag gacaatgtct gagcaaccaa 540

aaaggagctc aaatcc 556

<210> 8

<211> 1744

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 8

aaactaatat gaccttataa gaggaggaag ttggggcaca ggcatgtaca cacagaggaa 60

agaccataca gaggaaagac catattaaga taaaggaaga ggatgaccat ctacaagcca 120

agcaaagggg ccccagaagg aaaccaaaca tgctgaaacc ttgatcttga atttgtagct 180

tctaaaactg tgagaaaata aatttctgtt gtttaaaaca tccaggctga ggtactttgt 240

tatggaagcc ctgtcaaact aatgcaacaa catttcctcc cattagattt cttaattcgt 300

gtatagctgg cctgataatg tcttatcagc taccccaact caattgctgc aaatacattt 360

ttaaaagttc tggtggttgt agttgattgc acacttctgt atgagccaat aatgtgaggc 420

aagtctttaa aagggtagca caatcagtct gaggttacac catagatatg gttaaccata 480

gtgtggtctc cataacatag gaagtcaaga tcccccttca ctcttgacca gtcagattgc 540

acctagaaca tttttctcaa ttctgcatac cacatttaaa gaggaagaca aaacccatgc 600

gttgtgcagc taccacatgt cgagcatcag actatgtgca ctgtgtacac ttagtcctcc 660

caccaaccca atgaagatgg tattaatacc cacctcccat tgtacagatg aggagactgg 720

ggctaaatga ggtcaaatag gttgctcaac agagatcttc acctccatgg actcccatag 780

ccacactctg aaccctgtca tctctcagaa gtgcactgct tctgaaatct gcatctcata 840

cacccatcct ctgactacca cctcctgttc cctggcttcc taattcactc acacccaaga 900

tgactgtcct tcaacctcat caaactttga gttctttttg actctttgac tttgctccca 960

tcttgtgttc acttcttggc attctactca tcttagactc agttcacttc tgccattttc 1020

ttgcacaaat cctgaattct ctcatgcagt gcccttctgt accacctgca ggcaaaaacc 1080

aaccctgatc aactcaattg tcctctatac ttgctcgtgg gtgggtaaga aaagctagaa 1140

aagctaccca cagactccta ccattactga tttatgagct ccaggctcaa ctgggccctt 1200

atctgggcct ggaaatcatt ttgcatttct acagtcaagt ctcctttctg aacaaaagat 1260

acaacattga aaactgtctt ctgtttcctg aaatgtctac tcactacctc actttcaaca 1320

gataaccttg ccctctcttt cacaaaggaa atggaaacca caaagaggaa gtccctcacc 1380

ctgctgtccc cagccctaca aatcctcctg catctgcact ctgctccttc cctcttttta 1440

cagagaggag gcccctcctg tctaaagcaa attccatttc cttcctgcct tgggctcaga 1500

aatctcaccc catccaaaat cttccatggt tagcctgtcc ctttgttgcg actctttctc 1560

aatatttaca agctcctata ttttttaaaa taataaaact aggtcctcct ggtgttcaca 1620

tgttttccca attgtagcca agtcctctca ttcttatcac agcctcagac attttgaggt 1680

gtctcactac ctcacctcaa cccacaacat ctggcttccc tcattgtttt ccagtaggcc 1740

cctt 1744

<210> 9

<211> 995

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 9

cagagatctt cacctccatg gactcccata gccacactct gaaccctgtc atctctcaga 60

agtgcactgc ttctgaaatc tgcatctcat acacccatcc tctgactacc acctcctgtt 120

ccctggcttc ctaattcact cacacccaag atgactgtcc ttcaacctca tcaaactttg 180

agttcttttt gactctttga ctttgctccc atcttgtgtt cacttcttgg cattctactc 240

atcttagact cagttcactt ctgccatttt cttgcacaaa tcctgaattc tctcatgcag 300

tgcccttctg taccacctgc aggcaaaaac caaccctgat caactcaatt gtcctctata 360

cttgctcgtg ggtgggtaag aaaagctaga aaagctaccc acagactcct accattactg 420

atttatgagc tccaggctca actgggccct tatctgggcc tggaaatcat tttgcatttc 480

tacagtcaag tctcctttct gaacaaaaga tacaacattg aaaactgtct tctgtttcct 540

gaaatgtcta ctcactacct cactttcaac agataacctt gccctctctt tcacaaagga 600

aatggaaacc acaaagagga agtccctcac cctgctgtcc ccagccctac aaatcctcct 660

gcatctgcac tctgctcctt ccctcttttt acagagagga ggcccctcct gtctaaagca 720

aattccattt ccttcctgcc ttgggctcag aaatctcacc ccatccaaaa tcttccatgg 780

ttagcctgtc cctttgttgc gactctttct caatatttac aagctcctat attttttaaa 840

ataataaaac taggtcctcc tggtgttcac atgttttccc aattgtagcc aagtcctctc 900

attcttatca cagcctcaga cattttgagg tgtctcacta cctcacctca acccacaaca 960

tctggcttcc ctcattgttt tccagtaggc ccctt 995

<210> 10

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 10

catgcagtgc ccttctgtac cacctgcagg caaaaaccaa ccctgatcaa ctcaattgtc 60

ctctatactt gctcgtgggt gggtaagaaa agctagaaaa gctacccaca gactcctacc 120

attactgatt tatgagctcc aggctcaact gggcccttat ctgggcctgg aaatcatttt 180

gcatttctac agtcaagtct cctttctgaa caaaagatac aacattgaaa actgtcttct 240

gtttcctgaa atgtctactc actacctcac tttcaacaga taaccttgcc ctctctttca 300

caaaggaaat ggaaaccaca aagaggaagt ccctcaccct gctgtcccca gccctacaaa 360

tcctcctgca tctgcactct gctccttccc tctttttaca gagaggaggc ccctcctgtc 420

taaagcaaat tccatttcct tcctgccttg ggctcagaaa tctcacccca tccaaaatct 480

tccatggtta gcctgtccct 500

<210> 11

<211> 254

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 11

gcccttatct gggcctggaa atcattttgc atttctacag tcaagtctcc tttctgaaca 60

aaagatacaa cattgaaaac tgtcttctgt ttcctgaaat gtctactcac tacctcactt 120

tcaacagata accttgccct ctctttcaca aaggaaatgg aaaccacaaa gaggaagtcc 180

ctcaccctgc tgtccccagc cctacaaatc ctcctgcatc tgcactctgc tccttccctc 240

tttttacaga gagg 254

<210> 12

<211> 749

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 12

aaactaatat gaccttataa gaggaggaag ttggggcaca ggcatgtaca cacagaggaa 60

agaccataca gaggaaagac catattaaga taaaggaaga ggatgaccat ctacaagcca 120

agcaaagggg ccccagaagg aaaccaaaca tgctgaaacc ttgatcttga atttgtagct 180

tctaaaactg tgagaaaata aatttctgtt gtttaaaaca tccaggctga ggtactttgt 240

tatggaagcc ctgtcaaact aatgcaacaa catttcctcc cattagattt cttaattcgt 300

gtatagctgg cctgataatg tcttatcagc taccccaact caattgctgc aaatacattt 360

ttaaaagttc tggtggttgt agttgattgc acacttctgt atgagccaat aatgtgaggc 420

aagtctttaa aagggtagca caatcagtct gaggttacac catagatatg gttaaccata 480

gtgtggtctc cataacatag gaagtcaaga tcccccttca ctcttgacca gtcagattgc 540

acctagaaca tttttctcaa ttctgcatac cacatttaaa gaggaagaca aaacccatgc 600

gttgtgcagc taccacatgt cgagcatcag actatgtgca ctgtgtacac ttagtcctcc 660

caccaaccca atgaagatgg tattaatacc cacctcccat tgtacagatg aggagactgg 720

ggctaaatga ggtcaaatag gttgctcaa 749

<210> 13

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 13

agccaataat gtgaggcaag tctttaaaag ggtagcacaa tcagtctgag gttacaccat 60

agatatggtt aaccatagtg tggtctccat aacataggaa gtcaagatcc cccttcactc 120

ttgaccagtc agattgcacc tagaacattt ttctcaattc tgcataccac atttaaagag 180

gaagacaaaa cccatgcgtt gtgcagct 208

<210> 14

<211> 1778

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

gatcatccct ccttgacttc catacatgtg gggattacag gcatgagtca cctgcctggc 60

gagttccttg tttctaagga gacacaattc atttttattc tccctacccc cattagaata 120

gtttctattt agaggaagta aagcctgaga aacaggcaat gttttcacca agatggcctg 180

ttaagaaatc ttggttagtc tacaagtcca aatttcactg ccggtgagca ccatgtccca 240

tgagcagcac atgttgtaat gccagctaga ggtctcaatc attgaaactt tgctttgtaa 300

tccttctggt tacctagaga aagaaagccc cagggttgcc caccccacca ctccaggaaa 360

ggtaggggta aaggctctca gactgctttg ttgagaaaaa tggagaatgg gtgaagctca 420

gcacacaaaa atctctgagg aagccttaaa aacccccaac ttgccatgca gaaactaatt 480

tctgtctgga tggcagtcct agtcttaaga tcagaaagaa acaggaaggt gagagggtga 540

ggttttatct gttaccttat atagtctggg agtcagaggc actcagtgtg cctctatctt 600

taatcacgtg gtctagcact agtctcttgg gctttctgtc tcatagtttt tttttttagt 660

tgaaaaacag gtcaactaac acaaatgtaa gaaggcatat gttggtctaa aagtatatta 720

attgtttaag tctgtcaatt agtgagttgt cagtcaataa atatttgttg agtgccattt 780

atgtgctaag cactggggac atgtggtaag taaagattaa gttatagata ggccatgagc 840

ttaaggagct tagagtgtta acaggagaga cagagaataa atatggaact tccaaattat 900

aaacagtgct atgcaaataa ggtagtgtta ttcatattta tcagatattc tactgccagc 960

aggtgtggat attactgtca acttacttgc ctgagttctg tagattcaaa gttggatttt 1020

gtaatttctc ccagttgcgt ataaatatct aaatcagata cattgatggt gcgtgtggtg 1080

agatcaagtg tacaaaaagt agagcttttg agtttctgta aagtgttaca ccccataaaa 1140

tatgtacttc tttttagttc cacttcccat tttcttgaaa tatttttttc ttactcagtt 1200

tcaatagagc atagaaatct gctgaagtga ctcaataatc tcccttgcat tagaatggta 1260

gtttattgaa atcgggcaag gcttccggtg acagtaacag agaaacttcc ctttagaagt 1320

caatggcaga aagtaaagta agttagtaag gaagctatgg ggcatgatgg caacgtggat 1380

aattgggaag tggctggcaa taatttagaa gtaactcaaa gcatataaat gcaatctgcc 1440

tgatgatggg gaacaaaaaa ttatgggcag tcacagacag taaagtcctt ccttcctatg 1500

ccaccaaccg gttgtctcgc ctcctttttt aaggaagtgg tgaggagatg gtattcttaa 1560

aagcccagta tcagcatgac ttgtggcttc tttttggatt tgtttgccat tcctgtccac 1620

accaaagagg gtaggtggga aaaattaggg atttgtgccc tgatggttgg acccactcca 1680

ctgatccatt agttactagt aatctcactt tttcctttca atataatata tgtgttttac 1740

attaactagc tttttaaaaa ttacctatta agatgaaa 1778

<210> 15

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 15

cttaaaaacc cccaacttgc catgcagaaa ctaatttctg tctggatggc agtcctagtc 60

ttaagatcag aaagaaacag gaaggtgaga gggtgaggtt ttatctgtta ccttatatag 120

tctgggagtc agaggcactc agtgtgcctc tatctttaat cacgtggtct agcactagtc 180

tcttgggctt tctgtctcat agtttttttt tttagttgaa aaacaggtca actaacacaa 240

atgtaagaag gcatatgttg gtctaaaagt atatta 276

<210> 16

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CYBB减小的增强子元件

<400> 16

agcttttgag tttctgtaaa gtgttacacc ccataaaata tgtacttctt tttagttcca 60

cttcccattt tcttgaaata tttttttctt actcagtttc aatagagcat agaaatctgc 120

tgaagtgact caataatctc ccttgcatta gaatggtagt ttattgaaat cgggcaaggc 180

ttccggtgac agtaacagag aaacttccct ttagaagtca atggcagaaa gtaaagtaag 240

ttagtaagga agctatgggg catgatggca acgtggataa ttgggaagtg gctggcaata 300

atttagaagt aactcaaagc atataaatgc aatctgcctg atgatgggga acaaaaaatt 360

atgggcagtc acagacagta aagtccttcc ttcctatgcc accaaccggt tgtctcgcct 420

ccttttttaa ggaagtggtg agga 444

<210> 17

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> Gp91phox (CYBB) cDNA

<400> 17

atggggaact gggctgtgaa tgaggggctc tccatttttg tcattctggt ttggctgggg 60

ttgaacgtct tcctctttgt ctggtattac cgggtttatg atattccacc taagttcttt 120

tacacaagaa aacttcttgg gtcagcactg gcactggcca gggcccctgc agcctgcctg 180

aatttcaact gcatgctgat tctcttgcca gtctgtcgaa atctgctgtc cttcctcagg 240

ggttccagtg cgtgctgctc aacaagagtt cgaagacaac tggacaggaa tctcaccttt 300

cataaaatgg tggcatggat gattgcactt cactctgcga ttcacaccat tgcacatcta 360

tttaatgtgg aatggtgtgt gaatgcccga gtcaataatt ctgatcctta ttcagtagca 420

ctctctgaac ttggagacag gcaaaatgaa agttatctca attttgctcg aaagagaata 480

aagaaccctg aaggaggcct gtacctggct gtgaccctgt tggcaggcat cactggagtt 540

gtcatcacgc tgtgcctcat attaattatc acttcctcca ccaaaaccat ccggaggtct 600

tactttgaag tcttttggta cacacatcat ctctttgtga tcttcttcat tggccttgcc 660

atccatggag ctgaacgaat tgtacgtggg cagaccgcag agagtttggc tgtgcataat 720

ataacagttt gtgaacaaaa aatctcagaa tggggaaaaa taaaggaatg cccaatccct 780

cagtttgctg gaaaccctcc tatgacttgg aaatggatag tgggtcccat gtttctgtat 840

ctctgtgaga ggttggtgcg gttttggcga tctcaacaga aggtggtcat caccaaggtg 900

gtcactcacc ctttcaaaac catcgagcta cagatgaaga agaaggggtt caaaatggaa 960

gtgggacaat acatttttgt caagtgccca aaggtgtcca agctggagtg gcaccctttt 1020

acactgacat ccgcccctga ggaagacttc tttagtatcc atatccgcat cgttggggac 1080

tggacagagg ggctgttcaa tgcttgtggc tgtgataagc aggagtttca agatgcgtgg 1140

aaactaccta agatagcggt tgatgggccc tttggcactg ccagtgaaga tgtgttcagc 1200

tatgaggtgg tgatgttagt gggagcaggg attggggtca cacccttcgc atccattctc 1260

aagtcagtct ggtacaaata ttgcaataac gccaccaatc tgaagctcaa aaagatctac 1320

ttctactggc tgtgccggga cacacatgcc tttgagtggt ttgcagatct gctgcaactg 1380

ctggagagcc agatgcagga aaggaacaat gccggcttcc tcagctacaa catctacctc 1440

actggctggg atgagtctca ggccaatcac tttgctgtgc accatgatga ggagaaagat 1500

gtgatcacag gcctgaaaca aaagactttg tatggacggc ccaactggga taatgaattc 1560

aagacaattg caagtcaaca ccctaatacc agaataggag ttttcctctg tggacctgaa 1620

gccttggctg aaaccctgag taaacaaagc atctccaact ctgagtctgg ccctcgggga 1680

gtgcatttca ttttcaacaa ggaaaacttc taa 1713

<210> 18

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 密码子优化的Gp91phox

<400> 18

atgggcaact gggccgtgaa cgagggcctg agcatcttcg tgatcctggt gtggctgggc 60

ctgaacgtgt tcctgttcgt gtggtactac cgcgtgtacg acatcccccc caagttcttc 120

tacacccgca agctgctggg cagcgccctg gccctggccc gcgcccccgc cgcctgcctg 180

aacttcaact gcatgctgat cctgctgccc gtgtgccgca acctgctgag cttcctgcgc 240

ggcagcagcg cctgctgcag cacccgcgtg cgccgccagc tggaccgcaa cctgaccttc 300

cacaagatgg tggcctggat gatcgccctg cacagcgcca tccacaccat cgcccacctg 360

ttcaacgtgg agtggtgcgt gaacgcccgc gtgaacaaca gcgaccccta cagcgtggcc 420

ctgagcgagc tgggcgaccg ccagaacgag agctacctga acttcgcccg caagcgcatc 480

aagaaccccg agggcggcct gtacctggcc gtgaccctgc tggccggcat caccggcgtg 540

gtgatcaccc tgtgcctgat cctgatcatc accagcagca ccaagaccat ccgccgcagc 600

tacttcgagg tgttctggta cacccaccac ctgttcgtga tcttcttcat cggcctggcc 660

atccacggcg ccgagcgcat cgtgcgcggc cagaccgccg agagcctggc cgtgcacaac 720

atcaccgtgt gcgagcagaa gatcagcgag tggggcaaga tcaaggagtg ccccatcccc 780

cagttcgccg gcaacccccc catgacctgg aagtggatcg tgggccccat gttcctgtac 840

ctgtgcgagc gcctggtgcg cttctggcgc agccagcaga aggtggtgat caccaaggtg 900

gtgacccacc ccttcaagac catcgagctg cagatgaaga agaagggctt caagatggag 960

gtgggccagt acatcttcgt gaagtgcccc aaggtgagca agctggagtg gcaccccttc 1020

accctgacca gcgcccccga ggaggacttc ttcagcatcc acatccgcat cgtgggcgac 1080

tggaccgagg gcctgttcaa cgcctgcggc tgcgacaagc aggagttcca ggacgcctgg 1140

aagctgccca agatcgccgt ggacggcccc ttcggcaccg ccagcgagga cgtgttcagc 1200

tacgaggtgg tgatgctggt gggcgccggc atcggcgtga cccccttcgc cagcatcctg 1260

aagagcgtgt ggtacaagta ctgcaacaac gccaccaacc tgaagctgaa gaagatctac 1320

ttctactggc tgtgccgcga cacccacgcc ttcgagtggt tcgccgacct gctgcagctg 1380

ctggagagcc agatgcagga gcgcaacaac gccggcttcc tgagctacaa catctacctg 1440

accggctggg acgagagcca ggccaaccac ttcgccgtgc accacgacga ggagaaggac 1500

gtgatcaccg gcctgaagca gaagaccctg tacggccgcc ccaactggga caacgagttc 1560

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<223> 慢病毒载体

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gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 8340

tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 8400

ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg 8460

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tcaggtggca cttttcgggg 8520

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 8580

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 8640

gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 8700

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 8760

gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 8820

gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 8880

gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 8940

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 9000

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 9060

cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 9120

agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 9180

tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 9240

gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 9300

catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 9360

agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 9420

ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 9480

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 9540

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 9600

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 9660

gcgcgcaatt aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctgcaagctt ggccattgca 9720

tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 9780

atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 9840

tagcccatat atgg 9854

<210> 23

<211> 529

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> CMV启动子

<400> 23

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 60

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 120

gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 180

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 240

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 300

ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 360

cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 420

atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 480

ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccg 529

<210> 24

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 慢病毒载体组分

<400> 24

gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60

ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120

tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180

<210> 25

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 慢病毒载体中的包装信号

<400> 25

tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt 60

gagtacgcca aaaattttga ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt 120

cagtattaag cgggggag 138

<210> 26

<211> 205

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 慢病毒载体中的RRE

<400> 26

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 60

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 120

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 180

gaatcctggc tgtggaaaga tacct 205

<210> 27

<211> 656

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 慢病毒载体中的WPRE

<400> 27

cccatatttg ttctgttttt cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat aaaacaaaat 60

ggtggggcaa tcatttacat ttttagggat atgtaattac tagttcaggt gtattgccac 120

aagacaaaca tgttaagaaa ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt aatcaacctc 180

tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 240

tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg 300

ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 360

tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca 420

ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg 480

cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg 540

ataattccgt ggtgttgtcg gggaagggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 600

ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctgga 656

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 慢病毒载体中的PPT

<400> 28

tttttaaaag aaaagggggg ac 22

<210> 29

<211> 233

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 慢病毒载体组分

<400> 29

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ctactgctta 120

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agc 233

<210> 30

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> SV40复制起点

<400> 30

atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 60

tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 120

ggcttttttg gaggcctagg 140

<210> 31

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 耐药基因

<400> 31

attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 60

tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 120

caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa 180

gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 240

gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 300

ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 360

cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 420

gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 480

catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc 540

gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 600

cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 660

gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 720

gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 780

gagttcttct ga 792

<210> 32

<211> 620

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 耐药基因

<400> 32

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 60

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 120

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 180

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 240

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 300

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 360

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 420

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 480

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 540

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 600

ggaaaaacgc cagcaacgcg 620