一种靶向削减耐药基因blaTEM及其耐药质粒的gRNA、可转移型敲除载体及其应用

摘要

一种靶向削减耐药基因blaTEM及其耐药质粒的gRNA、可转移型敲除载体及其应用，本发明涉及生物技术领域，具体涉及靶向blaTEM耐药基因及其耐药质粒的gRNA、一种可水平转移的基因敲除载体及其在blaTEM耐药质粒削减方面的应用。本发明提供的gRNATEM‑1、gRNATEM‑2及其敲除载体pCas9‑Mob‑gRNATEM‑1和pCas9‑Mob‑gRNATEM‑2可以有效削减耐药基因blaTEM及携带blaTEM的多重耐药质粒。同时，利用本发明提供的敲除载体pCas9‑Mob‑gRNATEM‑1和pCas9‑Mob‑gRNATEM‑2制备方法较易得到靶向抗生素耐药基因blaTEM的敲除载体，也为其他耐药基因的敲除及削减研究提供了有效方法和基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及靶向bla

背景技术

近年来，随着抗生素的大量使用，越来越多的抗生素及其代谢产物被排放入污水处理系统甚至自然环境中，使得这些环境中的微生物所面临的选择性压力也日益增加。这些残留的抗生素会使得细菌不断适应并进化，进而获得抗生素耐药性。抗生素耐药性往往由耐药基因决定，这些耐药基因可位于染色体及质粒上，并通过基因垂直转移和水平转移等方式进行传播。目前，耐药基因已被视为一种新型的环境污染物。耐药基因bla

目前，现有的抗生素耐药基因的削减技术往往通过改变细菌群落结构或者直接杀灭细菌，例如，通过改变环境条件使得细菌群落结构改变，从而影响多重耐药质粒的传播，或者通过消毒等杀菌手段，将细菌直接灭活，使得供体细菌难以将多重耐药质粒传播到其他细菌。然而，这些方式并未从本质上破坏多重耐药质粒，在合适的条件下，这些携带耐药基因bla

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了靶向削减bla

本发明的实现过程如下：

第一方面，本发明提供靶向敲除耐药基因bla

gRNA

gRNA

第二方面，本发明构建了一种可水平转移的基因敲除载体pCas9-Mob，所述载体包含敲除蛋白基因 Cas9，gRNA表达序列，水平转移位点基因，载体图谱如附图1所示。

第三方面，本发明提供靶向敲除耐药基因bla

上述敲除载体pCas9-Mob-gRNA

第四方面，本发明提供上述pCas9-Mob-gRNA

(1)分别设计gRNA

gRNA

gRNA

gRNA

gRNA

(2)将上述正向引物和反向引物磷酸化并分别退火，纯化回收后得到靶向耐药基因bla

在50ul的反应体系中，加入5ul T4 PNK缓冲液，5ul 10mM的ATP，1ul T4 PNK酶，100uM的正向与反向引物各1ul，最后用灭菌水补齐至50ul。37℃反应30min后，将温度上调至95℃，持续10min，再以1℃/min的速度缓慢降至室温。

(3)用限制性核酸内酶切将上述pCas9-Mob载体线性化。

(4)将酶切后的线性化pCas9-Mob载体和gRNA

线性化pCas9-Mob片段0.05pmol，gRNA

第五方面，上述pCas9-Mob质粒的构建方法包括如下步骤：

(1)以pCas9质粒为模板，利用高保真PCR技术扩增复制子OriV、筛选标记基因Chl以及敲除蛋白基因Cas9序列，凝胶纯化后获得OriV-Chl-Cas9。

(2)以携带转移位点的质粒为模板，利用高保真PCR技术扩增该质粒的转移位点，凝胶纯化后获得OriT。

(3)利用无缝克隆技术连接上述纯化后的OriV-Chl-Cas9和OriT片段。

(4)将上述连接产物转化入特定大肠杆菌，该大肠杆菌染色体上整合了pCas9-Mob质粒水平转移所需要的相关基因。

(5)利用筛选标记Chl筛选出阳性克隆，将细菌扩大培养后提取质粒，该质粒即为敲除载体pCas9- Mob。

第六方面，将上述pCas9-Mob-gRNA

第七方面，上述pCas9-Mob-gRNA

第八方面，含有上述敲除载体pCas9-Mob-gRNA

本发明的有益效果至少包括：

(1)本发明通过序列分析及实验验证，提供了靶向耐药基因bla

(2)本发明提供的pCas9-Mob-gRNA

(3)本发明还提供了pCas9-Mob-gRNA

综上所述，本发明提供的gRNA

附图说明

图1为敲除载体pCas9-Mob的载体图谱。

图2为本发明所涉及的敲除载体pCas9-Mob-gRNA

图3为本发明所涉及的敲除载体pCas9-Mob-gRNA

图4为pCas9-Mob-gRNA

其中，A：pCas9-Mob-gRNA

图5为bla

其中，A：bla

图6为荧光显微镜下接合子菌落荧光表征图。

其中A：NK5449/bla

图7为pCas9-Mob-gRNA

具体实施方式

实施例1可水平转移的基因敲除载体pCas9-Mob的构建及验证

(1)以pCas9质粒为模板，设计特异性引物，利用高保真PCR技术扩增复制子、筛选标记基因以及敲除蛋白基因Cas9序列，凝胶纯化后获得OriV-Chl-Cas9。

(2)以携带转移位点的质粒为模板，设计特异性引物，利用高保真PCR技术扩增该质粒的转移位点，凝胶纯化后获得OriT。

(3)采用Novoprotein无缝克隆试剂，依照protocol连接上述纯化后OriV-Chl-Cas9和OriT片段。

(4)利用CaCl

(5)利用氯霉素筛选标记筛选出阳性克隆，细菌扩大培养后提取质粒，并保存菌株。

(6)对pCas9-Mob进行测序，经验证后序列无误，表明该载体构建成功。

实施例1中涉及的PCR反应采用Takara公司的PrimeSTAR Max高保真聚合酶，反应体系如下：PrimeSTAR Max Premix 25ul，上下游引物各1ul，模板1ul，ddH

实施例1中采用的无缝克隆反应体系如下：NovoRec plus重组酶1ul，5×缓冲液4ul，长片段 0.03pmol，短片段为0.05pmol，用ddH

实施例2构建靶向耐药基因bla

(1)从NCBI数据库中下载耐药基因bla

gRNA

gRNA

(2)分别设计gRNA

gRNA

gRNA

gRNA

gRNA

(3)将上述正向引物和反向引物磷酸化并分别退火，纯化回收后得到靶向耐药基因bla

在50ul的反应体系中，加入5ul T4 PNK缓冲液，5ul 10mM的ATP，1ul T4 PNK酶，100uM的正向与反向引物各1ul，最后用灭菌水补齐至50ul。37℃反应30min后，将温度上调至95℃，持续10min，再以1℃/min的速度缓慢降至室温。

(4)凝胶回收实例1中涉及的经限制性内酶酶切后的pCas9-Mob载体。

(5)将酶切后的pCas9-Mob载体和gRNA

连接体系如下：

线性化pCas9-Mob片段0.05pmol，gRNA

(6)采用琼脂糖电泳对敲除载体pCas9-Mob-gRNA

实施例3利用体外靶向切割实验验证gRNA

(1)设计并合成正向引物gRNA

gRNA

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATCGAACTGGATCTCAACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’

gRNA

5’-TTAATACGACTCACTATAGGACAATTAATAGACTGGATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’

(2)在20ul体系中加入10ul 2×sgRNA反应缓冲液，2ul上述正向引物，2ul酶混合液，6ul无菌水，体外转录1h，得到sgRNA

(3)取适量纯化后的bla

(4)将上述bla

实施例4利用荧光信号验证可转移型敲除载体pCas9-Mob-gRNA

(1)将携带bla

(2)将携带对照载体pCas9-Mob、敲除载体pCas9-Mob-gRNA

(3)将步骤(2)扩大培养后的菌液分别离心后弃上清液，向摇菌管中加入适量PBS缓冲液使沉底的菌液重悬并再次离心，再次弃去上清液，共重复3次。最后，用PBS缓冲液将菌液OD600值均调节至 0.7(±0.05)。

(4)实验组：在10ml离心管中加入2.5ml PBS重悬的携带bla

(5)37℃培养16h后，取步骤(4)中实验组和对照组的菌液各100ul涂布于Nal、Rif、Chl三种抗性的LB固体培养基上，筛选接合子。

(6)采用荧光体式显微镜观察LB平板上的菌落，若bla

(7)实验结果如附图6所示，pCas9-Mob的接合子菌落发红色荧光，pCas9-Mob-gRNA

实施例5利用菌落PCR验证pCas9-Mob-gRNA

(1)将携带bla

(2)将等量pCas9-Mob、pCas9-Mob-gRNA

(3)依据RP4质粒的序列设计鉴定引物，分别挑选pCas9-Mob、pCas9-Mob-gRNA

(4)实验结果如附图7所示，pCas9-Mob转化子条带明显，pCas9-Mob-gRNA

综上所述，本发明提供的gRNA

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种靶向削减耐药基因bla

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgaactgg atctcaacag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acaattaata gactggatgg 20