CRISPR/Cas9基因编辑技术构建靶向敲除小鼠微小RNA-101a基因的一体化载体系统

摘要

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建两种一体化载体,用于敲除AML12细胞系中的微小RNA(microRNA,miR)-101a。方法:设计三条小鼠靶向miR-101a基因的小向导RNA(sgRNA)以及一条靶向绿色荧光蛋白基因的sgRNA,分别构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9),并将sgRNA1和sgRNA3构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-U6-sgRNA-EF1α-Cas9 D10A)。在AML12细胞系中转染构建的一体化质粒,72 h后用T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)检测剪切效率。将pENTRY一体化质粒通过Gateway的方式重组到pAD载体中,再转染293A细胞进行腺病毒包装。在AML12细胞系中进行腺病毒感染,72 h后检测miR-101a成熟体的表达水平以评估敲除效率。结果:构建的pENTRY一体化质粒经测序鉴定后正确。质粒转染AML12细胞系后进行T7EⅠ检测,均发生了明显剪切形成了两条带,表明设计的sgRNA有效果。pENTRY-体化质粒重组到pAD载体中,经酶切鉴定正确。腺病毒转染AML12细胞系后,实时荧光定量PCR检测表明细胞中miR-101a成熟体表达水平较对照组均明显下降(均P<0.01)。结论:构建了具有较高敲除效率的靶向小鼠miR-101a基因的一体化载体系统,为后续微小RNA功能研究奠定了技术支撑和实验基础,同时也为其他微小RNA敲除提供了借鉴方法。