一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法

摘要

本发明涉及一种高效、简单快速的超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，包括标准曲线与内标配置，富集，去除杂质，洗脱，酶解，分析。本发明可实现利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗三个单抗药同时监测；样品前处理操作简便，实验周期短，一天内可完监测，节省成本；省略蛋白变性、还原和烷基化步骤，省略固相萃取步骤；监测方法灵敏度高，特异性强，血浆用量少且前处理过程简单，准确度和精密度满足要求，可为相关的药物浓度监测提供一种可靠的方法。

说明书

技术领域

本发明属于医疗技术领域，涉及一种药物的监测方法，尤其涉及一种高效、简单快速的超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法。

背景技术

单克隆抗体药物是以γ型免疫球蛋白(Immunoglobulin G)结构为基础的一类具有特殊治疗效果的蛋白质药物。1986年，美国FDA批准了第一个单克隆抗体药物Orthoclone上市，翻开了生物医药历史崭新的一页。目前，单克隆抗体药物已成功应用于癌症、自身免疫疾病、病毒感染和中枢神经紊乱等多种疾病的临床治疗。

随着单克隆抗体药物(单抗药)在肿瘤治疗领域越来越多的应用，而单抗药的疗效、毒副作用和耐药性等个体差异较大，因此对单抗药的治疗药物监测显得尤为重要。目前有液质联用法和免疫法两种方法用于单抗药的治疗药物监测。

免疫法是目前临床常用的方法，但其在单抗药的治疗药物监测中存在很多缺点，比如线性测量范围窄，多个指标不能联检，病人体内产生单抗药抗体影响监测、交叉反应，高特异性抗体的开发时间长和难以获得等缺点。

液质联用法因其具有免疫法不具有的优点，近年来成为治疗药物监测的一种高效方法。2020年5月由中国药理学会和中日友好医院发起的《抗肿瘤生物类似药治疗药物监测药学专家共识》中强烈推荐用液质联用法用于治疗药物监测。然而现有的液质联用方法存在操作流程多、耗时长、不能自动化等因素，严重限制了其在临床中的应用。

利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗是目前临床最常用的3种抗肿瘤单抗药，因其具有广谱(数10种不同类型癌症)的抗肿瘤疗效，越来越多的被用于临床肿瘤治疗。目前尚缺乏高效且简单快速的液相色谱串联质谱法监测这三种血药浓度的方法。

中国专利(CN 110927297 A)公开了“一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法”，该方法同时检测了13种抗肿瘤药物，但前处理复杂，需要蛋白沉淀后干燥处理再复溶后过滤。

中国专利(CN 110045048 A)公开了“一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物浓度的HPLC-MSMS方法”，检测种类有限，且前处理采用蛋白沉淀后氮吹复溶，前处理复杂，这些方法在临床应用比较受限。

发明内容

本发明的目的是为了建立一种更加高效，简便快速的液相色谱串联质谱测定血浆中利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)的血药浓度方法，本发明通过Protein A偶联磁珠富集纯化血浆中的3种单抗药，优化传统操作操作步骤，利用超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中3种单克隆抗体药物浓度。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，所述监测方法包括以下步骤：

1)标准曲线与内标配置：用空白血浆配置不同浓度的利妥昔单抗、曲妥珠单抗和西妥昔单抗的标准曲线溶液；将托珠单抗用PBS配置成内标溶液；

2)富集：Protein A偶联磁珠富集步骤1)上述3种单抗药；

3)去除杂质：洗去步骤2)得到的富集液中的非特异性蛋白和其它杂质；

4)洗脱：洗脱Protein A偶联磁珠上的3种单抗药；

5)酶解：将步骤4)得到的洗脱液冷冻浓缩干燥，使用消化酶酶解，得到酶解液经离心，取上清待用；

6)分析：对步骤5)得到的上清液进行液相色谱串联质谱法检测，得到分析结果。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤1)中，标准曲线溶液的浓度为5，10，25，50，100，200，400和800μg/mL。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤1)中，内标溶液的浓度为50μg/mL。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤2)具体为，加PBS颠倒数下重悬protein A偶联磁珠，取30μL到样品槽中，加30μL样品和200μL内标溶液，孵育30min。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤3)具体为：将步骤2)的富集液磁吸分离，弃去上清液，protein A偶联磁珠加入PBS洗去未结合蛋白和其它杂质，磁吸分离，弃上清，重复多次；再用去离子水洗多次。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤4)具体为：向步骤3)得到单抗药中加入洗脱液洗脱。

作为本发明的一种优选方案，所述洗脱液为体积分数20％甲酸与80％甲醇水溶液。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤5)具体为：向步骤4)的洗脱液中，加入碳酸氢铵配置的胰蛋白酶，酶解，加入甲酸终止酶解反应，离心，取上清至96孔板中。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤6)中，色谱条件为：色谱柱ACQUITY UPLCBEH C18100×2.1mm 1.7μm，柱温40℃，进样体积2μL；流动相：流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液，流动相B为0.05％～0.15％甲酸乙腈溶液；

色谱梯度：0-1min，10％B；1-6min，10％B-27％B；6-6.5min，27％B-95％B；6.5-7.2min，95％B；7.2-7.8min，95％B-10％B；7.8-8min，10％B；8-8.5min，10％B-95％B；8.5-9.8min，95％B；9.8-10min，10％B；10-11min，10％B。

为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗肿瘤药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，短时间内完成抗肿瘤药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液，流动相B为0.05％～0.15％甲酸乙腈溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.05％～0.1％甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液作为流动相，色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18 100×2.1mm 1.7μm，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，短时间内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用托珠单抗作为内标，托珠单抗内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)时的重现性、准确度均较好，并且可以同时监测三种单抗药在血浆中的药物浓度。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤6)中，质谱条件为：离子源：正离子模式；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气：800L/hr；锥孔气：50L/hr。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明可实现利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)三个单抗药同时监测；

2)本发明样品前处理操作简便，实验周期短，一天内可完监测，节省成本；本发明的前处理省略蛋白变性、还原和烷基化步骤；(至少节省2小时，节约相关操作的试剂耗材和设备等)，本发明的前处理省略固相萃取步骤；(至少节省4小时，节约相关操作的试剂耗材和设备等)；

3)本发明使用Protein A偶联磁珠结合iMS-1000自动化处理仪器，可实现样品前处理自动化；

4)本发明监测方法灵敏度高，特异性强，血浆用量少且前处理过程简单，准确度和紧密度满足要求，可为相关的药物浓度监测提供一种可靠的方法。

附图说明

图1是本发明方法的西妥昔单抗色谱图。

图2是本发明方法的曲妥珠单抗色谱图。

图3是本发明方法的利妥昔单抗色谱图。

图4是本发明方法的托珠单抗色谱图。

图5是本发明方法的西妥昔单抗标准曲线。

图6是本发明方法的曲妥珠单抗标准曲线。

图7是本发明方法的利妥昔单抗标准曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本实施例提供了一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法，所述监测方法包括以下步骤：

(一)样品前处理

1、标准曲线和内标配置：用空白血浆配置利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)3种单抗药的标准曲线，设置5，10，25，50，100，200，400和800μg/mL等8个浓度。托珠单抗(tocilizumab)用PBS配置成50μg/mL，作为内标；

2、富集单克隆抗体药：加PBS颠倒数下重悬protein A偶联磁珠(GE Healthcare)，取30μL到样品槽中，加30μL样品(标准曲线、血浆样品或质控品)和200μL 50μg/mL内标(托珠单抗)，孵育30min；

3、洗去未结合蛋白：磁吸分离，弃上清，磁珠加200μL PBS洗去未结合蛋白和其它杂质，磁吸分离，弃上清，重复1次；再用去离子水洗1次；

4、洗脱：加150μL 20％甲酸/80％甲醇水溶液洗脱单克隆抗体药，磁吸分离，取上清150μL到1.5mL EP管中；步骤2-4在iMS-1000自动化前处理仪上完成；

5、酶解：冷冻浓缩干燥，加入200μL碳酸氢铵配置的0.1μg/mL胰蛋白酶(现用现配)于37℃酶解4小时，加15μL 10％甲酸终止酶解反应，15000g，离心10min，取上清100μL到96孔板中，Waters TQS质谱检测；

(二)色谱条件

1、色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 100×2.1mm 1.7μm，柱温40℃，进样体积2μL。

2、流动相：流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈。

3、色谱梯度：0-1min，10％B；1-6min，10％B-27％B；6-6.5min，27％B-95％B；6.5-7.2min，95％B；7.2-7.8min，95％B-10％B；7.8-8min，10％B；8-8.5min，10％B-95％B；8.5-9.8min，95％B；9.8-10min，10％B；10-11min，10％B。

(三)质谱条件

离子源：正离子模式；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气：800L/hr；锥孔气：50L/hr；

扫描模式：3种单抗药和内标定量的肽段多反应监测质谱参数(MRM)见表1。

西妥昔单抗色谱图见图1，曲妥珠单抗色谱图见图2，利妥昔单抗色谱图见图3，托珠单抗色谱图见图4。

表1.多反应监测质谱参数

表2.化合物保留时间及线性范围

以3种单抗药和内标的峰面积比值为纵坐标、待测化合物的标示浓度为横坐标进行线性回归分析，得线性回归方程、相关系数、线性范围以及保留时间如图5，图6，图7与表2所示，本发明3种单抗药均具有良好的线性关系，线性相关系数r

表3.定量限数据表

由表3可见，3种单抗药的方法定量下限(LOQ)均为5μg/mL，3种单抗药LOQ的重复性用CV值表示，CV值的误差均小于5％。

表4.化合物携带污染测试数据表

为了考察方法的3种单抗药携带污染情况，通过进样线性最高点后再进样空白样品，依次重复6次，比较空白样品与定量下限峰面积的比值，得到3种单抗药携带污染情况如表4所示，由表4可见，3种单抗药空白样本化合物峰面积残留均小于定量下限化合物峰面积的20％。

表5.内标携带污染测试数据表

为了考察方法的内标携带污染情况，通过进样内标后再进样空白样品，依次重复6次，比较空白样品与内标峰面积的比值，得到内标携带污染情况如表5所示，由表5可见，空白样本峰面积残留小于内标峰面积的0.5％。

表6.监测方法精密度数据

3种单抗药选取低、中、高3种浓度的样品，每天每个浓度重复6次，连续检测3天，得到精密度数据如表6所示，本发明监测方法，3种单抗药的批内、批间精密度CV值≤15％，满足要求。

表7.监测方法正确度数据

3种单抗药选取低、中、高3种浓度水平，加入到空白血浆中，检测3种浓度水平样品测定结果，通过比较实测值与加入浓度求得回收率，每个浓度重复6次，由表7可见，本发明监测方法中，3种单抗药的回收率均处于85-115％之间，满足要求。

表8. 24h进样盘稳定性试验

注：QCL、QCM、QCH分别为低、中、高3种浓度。

考察3种单抗药处理好的样品在进样盘(8摄氏度)24小时的稳定性，选择低、中、高3种浓度，每个浓度重复6次，分别比较0小时和24小时检测值，由表8可见，本发明监测方法中，西妥昔单抗(Cetuximab)的平均相对偏差为97.58％，利妥昔单抗(Rituximab)的平均相对偏差为98.92％，曲妥珠单抗(Trastuzumab)的平均相对偏差为96.26％，说明本发明的监测方法24小时稳定性较好。

本发明可实现利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)三个单抗药同时监测；样品前处理操作简便，实验周期短，一天内可完监测，节省成本；本发明的前处理省略蛋白变性、还原和烷基化步骤；(至少节省2小时，节约相关操作的试剂耗材和设备等)，本发明的前处理省略固相萃取步骤；(至少节省4小时，节约相关操作的试剂耗材和设备等)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。