1.免疫无应答HIV患者血浆中雷公藤3个单体成分药物浓度及其与异常免疫激活关系初探；2.高效液相色谱法测定血清、脑脊液及胰腑中利奈唑胺药物浓度

摘要

第一部分免疫无应答HIV患者血浆中雷公藤3个单体成分药物浓度及其与异常免疫激活关系初探
　　研究背景:
　　自20世纪90年代开始应用高效抗反转录病毒治疗（highly-active antiretroviraltreatment，HAART）以来，艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)的治疗取得了突破性的进展。HAART可以有效抑制人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)的复制，使HIV患者CD4+T细胞逐渐恢复至正常，从而达到免疫功能重建。
　　临床观察发现约有20％ HIV患者经过长期HAART治疗，病毒复制被有效抑制，但CD4+T细胞计数却未能恢复至最佳水平，仍然表现为免疫无应答[1]，这类患者被称为免疫无应答者（immunologic non-responders，INRs）。免疫无应答导致患者机会性感染、肿瘤、心血管疾病、肝脏疾病等的发病率和病死率显著升高。鉴于此，寻找高效低毒的药物治疗免疫无应答HIV患者已成为重大课题。
　　在免疫无应答的各种影响因素中，异常免疫激活占据主导地位[2]。雷公藤为中国的传统中药，已有几百年的历史，药理学研究表明其具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等作用，临床上广泛用于自身免疫性疾病[3]、类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)[4]、皮肤病等的治疗，并收到预期的良好效果，号称“中药皮质激素”。对雷公藤部分单体成分体外及动物体内药理学研究表明，雷公藤甲素[5]、雷公藤红素[6]、雷公藤内酯酮[7]、去甲泽拉木醛[8]、雷醇内酯[9，10]等具有显著的抗炎和免疫抑制活性。北京协和医院感染科对免疫无应答HIV患者(n=19)高效抗反转录病毒治疗加用雷公藤多苷片的预实验也初步证实了雷公藤多苷片对恢复免疫无应答HIV患者免疫功能的作用[11]。
　　遗憾的是，上市的雷公藤制剂主要是雷公藤片、雷公藤多苷片及昆明山海棠片，均为复方制剂，含数十个单体成分。能使免疫无应答HIV患者恢复免疫功能的单体成分是什么？其作用机制又是什么？
　　为初步回答上述2个问题，本研究选择雷公藤红素、雷公藤甲素、雷醇内酯为研究对象，试图初步考察上述3个单体是否为使免疫无应答HIV患者CD4+T细胞计数恢复至正常水平的单体成分;进一步考察上述3个单体是否能通过抑制CD38、HLA-DR免疫激活分子抑制细胞免疫激活。
　　研究目的:
　　本研究分别建立测定雷公藤红素、雷公藤甲素和雷醇内酯的超高液相色谱串联质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric,UPLC-MS/MS)方法，测定健康受试者和免疫无应答HIV患者口服雷公藤多苷片后雷公藤红素、雷公藤甲素、雷醇内酯的血药浓度，Winnonlin1.5非房室模型计算3个单体在健康受试者中的药代动力学参数。同时探究HIV患者中3个单体血药浓度与所测定的CD4+T细胞计数增长率，CD4+T细胞计数增长量及免疫激活指标CD38(％)和HLA-DR(％)改变量的相关性。旨在发现恢复免疫不应答HIV患者免疫功能的可能单体成分及其作用机制，促进单体药物的基础研究和研发，为雷公藤的临床广泛使用提供参考。
　　研究对象与方法:
　　首先建立测定人血浆中雷公藤红素、雷公藤甲素和雷醇内酯药物浓度的UPLC-MS/MS方法。测定雷公藤多苷片中雷公藤3个单体含量。健康受试者单剂量口服雷公藤多苷片20 mg后0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24h采集血浆样本，测定血药浓度，Winnonlin1.5非房室模型计算药代动力学参数。
　　免疫无应答HIV患者(n=19)多剂量口服雷公藤多苷片10 mg或20 mg，tid，采集谷浓度血浆样本，应用UPLC-MS/MS方法测定血浆中雷公藤红素、雷公藤甲素、雷醇内酯的药物浓度，应用SPSS13.0统计学软件分析免疫无应答HIV患者血浆中雷公藤3个单体药物浓度与患者CD4+T细胞计数增长率、CD4+T细胞计数增长量、免疫激活指标CD38(％)和HLA-DR(％)改变量之间的相关性。
　　研究结果:
　　建立了电喷雾正离子(electronic spray ion with positive ionization ions，ESI+)、多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式测定雷公藤红素的UPLC-MS/MS方法，建立了ESI+、MRM模式同时测定雷公藤甲素和雷醇内酯的UPLC-MS/MS方法。
　　雷公藤多苷片中雷公藤红素、雷公藤甲素和雷醇内酯平均含量分别为22.941(15.163～31.755) tg/片、7.649(3.598～14.495) ng/片和1423.475(817.895～2233.433) ng/片。
　　健康受试者单剂量口服雷公藤多苷片20mg，对血药浓度测定值进行非房室模型分析显示，血浆中雷公藤红素峰浓度Cmax为0.52 ng·mL-1，达峰时间Tmax为3.0h，半衰期t1/2为16.76 h;所有时间点雷公藤甲素和雷醇内酯的血药浓度均低于最低定量限(the lowest limit of quantification, LLOQ)。
　　HIV患者(n=19)多剂量口服雷公藤多苷片10 mg或20 mg，tid，血浆中雷公藤红素浓度为(0.28-4.01) ng·mL-1，血浆中雷公藤甲素和雷醇内酯浓度均低于LLOQ。
　　SPSS统计分析结果:对HIV患者雷公藤红素血药浓度、CD4+T细胞计数增长率、CD4+T细胞计数增长量、CD38(％)和HLA-DR(％)改变量进行Shapiro-Wilk正态性检验，p＞0.05，均符合正态分布。对CD4+T细胞计数增长率、CD4+T细胞计数增长量、CD38(％)和HLA-DR(％)改变量与雷公藤红素血药浓度进行Pearson相关性分析，相关系数分别为0.072、-0.211、0.310、0.424，相关性假设检验p值分别为0.798、0.445、0.261、0.116，均＞0.05，均未见统计学相关性。按不同剂量20 mg，tid组和10 mg，tid组分组分析，对两组血药浓度、CD4+T细胞计数增长率、CD4+T细胞计数增长量、CD38(％)和HLA-DR(％)改变量进行独立样本T检验，结果均未见统计学差异。根据CD4+T细胞计数增长率分组比较两组血药浓度差异，两组血药浓度统计学上未见显著差异。
　　研究结论:
　　研究结果显示雷公藤红素与CD4+T细胞计数增长率、CD4+T细胞计数增长量、CD38(％)和HLA-DR(％)改变量统计学上不具有相关性。不同剂量组，上述指标统计学上未见显著差异。因本研究混杂因素较多，样本量较少，尚不能证实雷公藤红素是否为恢复免疫无应答HIV患者免疫功能的雷公藤单体成分。雷公藤甲素和雷醇内酯因血浆药物浓度低于LLOQ，未能分析其与免疫无应答HIV患者免疫重建的关系。
　　第二部分高效液相色谱法测定人血清、脑脊液和胰液中利奈唑胺药物浓度
　　研究背景:
　　革兰氏阳性球菌（Gram-positive bacterial，G+）是社区和医院感染的重要病原菌，其中较为常见的有金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌等。G+菌进入血液循环或脑组织，引起菌血症、败血症或颅内感染，患者预后较差。近年来，随着抗生素广泛应用，细菌耐药情况日趋严重。对耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)等阳性菌敏感的万古霉素等抗G+菌的抗菌药物敏感性也逐渐下降。利奈唑胺以其广谱强效的抗G+菌活性，良好的脂溶性和组织穿透率等特征著称，且不导致肾脏毒性[1]。
　　目前，国内外尚无利奈唑胺在胰腺组织中的穿透性及药代动力学研究。此外，国内尚无利奈唑胺在重症感染患者及多药耐药患者中药代动力学和药效动力学的研究。鉴于此，建立测定血清、脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和胰液(pancreatic juice，PJ)中利奈唑胺浓度的方法学，为进一步研究利奈唑胺在胰腺组织的穿透性、在中国重症感染患者、多药耐药患者中药代动力学-药效动力学特征提供方法学基础，为临床合理使用该药提供参考。
　　研究目的:
　　建立同时测定人血清、脑脊液、胰液中利奈唑胺药物浓度的高效液相色谱(high-performance liquid chromatographic, HPLC)方法学。
　　研究方法:
　　以利培酮为内标物，在0.1 mol·L-1NaOH碱性条件下甲基叔丁基醚∶正丙醇=90∶10(v/v)液液提取，Shima-pack CLC-ODS-C18(150 mm×6.0 mm，5μm)色谱柱分离，流动相为甲醇∶乙腈∶磷酸缓冲溶液(0.02 mol·L-1 KH2PO4，H3PO4调pH=3.5)=20∶16∶64(v/v/v)，流速1.0 mL·min-1，柱温35℃，检测波长254 nm条件下测定。
　　研究结果:
　　血清中利奈唑胺在(0.25～40.0) mg·L-1内线性良好(r=0.999)，定量限为0.25mg·L-1，低、中、高(0.8、8.0、25.0 mg·L-1)3个浓度质控样本的批内相对标准误差(RSD)为1.64％～2.38％(n=5)，批间RSD为4.53％～6.34％(n=5)，方法学回收率为93.781％～97.393％(n_5)，提取回收率为72.861％～77.539％(n=5);脑脊液中利奈唑胺在(0.1～20.0) mg·L-1内线性良好(r=0.999)，定量限为0.1 mg·L-1，低、中、高(0.2、2.0、15.0 mg·L-1)3个浓度质控样本的批内RSD为3.84％～4.83％（n=5），批间RSD为6.04％～8.16％(n=5)，方法学回收率为106.910％～110.971％(n=5)，提取回收率为73.226％～79.754％(n=5);胰液中利奈唑胺在(0.1～20.0) mg·L-1内线性良好(r=0.999)，定量限为0.1 mg·L-1，低、中、高(0.2、2.0、15.0 mg·L-1)3个浓度质控样本的批内RSD为2.96％～5.30％(n=5)，批间RSD为4.68％～6.40％(n=5)，方法学回收率为97.178％～105.072％(n=5)，提取回收率73.333％～76.010％(n=5)。内标提取回收率＞87％。
　　研究结论:
　　本方法灵敏度高，准确性好，简便快捷，应用液液提取处理样本去除更多杂峰干扰，更广泛适用于临床，适用于多种合并用药患者生物标本中利奈唑胺药物浓度的测定。

目录

声明

第一部分 免疫无应答HIV患者血浆中雷公藤3个单体成分药物浓度及其与异常免疫激活关系初探

英文缩略词表

摘要

第一节 建立测定人血浆中雷公藤红素的UPLC-MS／MS方法

第二节 建立同时测定人血浆中雷公藤甲素和雷醇内酯UPLC-MS／MS方法

第三节 UPLC-MS／MS测定雷公藤多苷片中雷公藤3个单体含量均匀度

第四节 健康受试者体内雷公藤3个单体药代动力学初探

第五节 免疫无应答HIV患者血浆中雷公藤3个单体药物浓度与异常免疫激活关系探讨

参考文献

总结

论文相关综述一 雷公藤抗炎免疫调节活性单体的研究发展

论文相关综述二 雷公藤抗HIV活性及其研究中的机遇和挑战

第二部分 高效液相色谱法测定人血清、脑脊液和胰液中利奈唑胺药物浓度

英文缩略词表

摘要

第一节 高效液相色谱法测定人血清、脑脊液和胰液中利奈唑胺浓度

第二节 利奈唑胺临床药效学初探

参考文献

总结

论文相关综述 利奈唑胺组织穿透性及在感染组织中的药效学

研究生期间发表的文章题录

致谢