一种光敏剂分子及其在提高肿瘤滞留时间增强大体积肿瘤治疗中的应用

摘要

本发明公开了一种光敏剂分子及其在提高肿瘤保留时间增强大体积肿瘤治疗中的应用，属于纳米材料领域。本发明通过将蒽引入BODIPY‑meso位来合成AN‑BDP。由于蒽的强分子间π‑π相互作用，AN‑BDP和具有两亲性嵌段共聚物DSPE‑PEG2000自组装成稳定纳米粒子AN‑BDP NPs。此外，蒽还能够使AN‑BDP在光的照射下激发到三重激发态与O2作用下产生1O2。尾静脉注射AN‑BDP NPs在肿瘤部位富集并保留～10天。在常规体积大小的小鼠肿瘤模型中，AN‑BDP NPs可以通过一次尾静脉注射一次光照治疗完全抑制肿瘤生长。而在大体积肿瘤模型，相同治疗条件下，仅观察到12％的肿瘤生长抑制率。由于肿瘤滞留时间长，单次注射AN‑BDP NPs可进行3次光照治疗，治疗效果显著提高。

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种光敏剂分子及其在提高肿瘤保留时间增强大体积肿瘤治疗中的应用。

背景技术

光动力治疗(PDT)由于其微创性和高度的时空精度，引起了相当多的关注。光敏剂作为光动力治疗的关键部分，将吸收的能量转移到周围的氧气中并产生活性氧(ROS)，随后与附近的生物大分子(如：脂质、蛋白质、DNA)进一步反应以杀死癌细胞并完成光动力治疗。因此，光敏剂在肿瘤部位的有效富集是癌症患者进行光动力治疗的先决条件，其肿瘤滞留效果直接决定了治疗是否准确有效。然而，在活体光动力治疗过程中，大多数有机小分子光敏剂从血流中迅速清除，通常在数小时甚至十几分钟从血液中清除，使得光敏剂无法有效地在肿瘤部位富集和保留，导致光动力治疗效率低下。因此，提高光敏剂在肿瘤部位的保留时间迫在眉睫，这对于保证体内精准高效的PDT具有重要意义。

目前延长血液循环并增强肿瘤滞留时间的主要策略之一是将光敏剂纳米工程化，例如有机聚合物纳米粒子、脂质体或无机纳米材料。科研工作者通过改变纳米系统的物理化学特性(即大小、形状和电荷)可以很好地控制及优化肿瘤保留时间。此外，通过用肿瘤靶向基团(例如肽、抗体)进行表面修饰，所谓的“被动靶向”效应可以进一步提高纳米系统的肿瘤保留时间。尽管这些方法延长了光敏剂在肿瘤滞留时间，但这些纳米系统通常在一到三天内从肿瘤中清除，这在许多情况下仍然不足于保证有效的光动力治疗。注射光敏剂后仍需要尽快进行光疗，治疗大体积肿瘤或恶性肿瘤时需要大剂量注射光敏剂或多次注射。然而，这些会增加光动力治疗过程中治疗的风险并导致显著的毒副作用。因此，实现光敏剂在肿瘤部位的长期时间保留是非常可取的，但仍然是光动力治疗的关键挑战之一。

提高纳米粒子的稳定性是提高肿瘤保留效果的直接途径，因为在复杂的血液环境中，NPs通常容易聚集或崩解，这是导致肿瘤保留时间有限的主要原因之一。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提供了一种光敏剂共组装策略，通过极大地提高纳米粒子稳定性来增强肿瘤保留时间。光敏剂在肿瘤部位的保留时间已大幅提升至～10天。光敏剂是通过将蒽引入BODIPY-meso位来合成AN-BDP。由于蒽的强分子间π-π相互作用，AN-BDP和具有两亲性嵌段共聚物(DSPE-PEG

一种光敏剂，所述光敏剂结构式如Ⅰ所示：

式Ⅰ中，R选自：

一种纳米光敏剂粒子，将所述的光敏剂与DSPE-PEG

一种光敏剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种纳米光敏剂粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，上述技术方案中，所述抗肿瘤药物为用于光动力治疗的抗肿瘤药物。

进一步地，上述技术方案中，所述抗肿瘤药物为针对大肿瘤注射一次光敏剂或纳米光敏剂离子，进行多次光动力治疗。

进一步地，上述技术方案中，所述光敏剂或纳米光敏粒子在肿瘤部位的保留时间为＜300h。

进一步地，上述技术方案中，所述大肿瘤为肿瘤体积为300-350mm

进一步地，上述技术方案中，光动力治疗的次数为1～3次。

进一步地，上述技术方案中，对于大体积肿瘤可通过一次给药，三次光照治疗增强治疗效果减少大药剂量和光剂量带来的副作用。

附图说明

图1为(a)AN-BDP NPs自组装示意图和纳米颗粒中的分子间相互作用模式。(b)用于光动力疗法(PDT)的具有延长的血液循环和肿瘤保留的AN-BDP NPs。

图2为(a)AN-BDP和AN-BDPNPs的紫外可见吸收光谱。(b)AN-BDP和AN-BDPNPs的荧光发射光谱。

图3为(a)AN-BDP在脱气二氯甲烷中630nm处的寿命衰减曲线，激发光源为590nm脉冲激光。(b)2,6-二碘苯乙烯BODIPY分子结构式。

图4为AN-BDP在630nm光源照射下DPBF的吸收光谱衰减图。

图5为AN-BDP NPs在630nm光照下产生的EPR信号。其中红线为TMPO指示的

图6为(a)AN-BDP NPs的TEM图。(b)AN-BDP NPs的DLS图。

图7为(a)AN-BDP NPs和Me-BDP NPs在37℃和pH 7.4下，在水、10mM PBS、45g/LBSA和90v％FBS的稳定性。

图8为通过分子动力学模拟获得的无定形AN-BDP NPs(a)和Me-BDP NPs(b)的快照。

图9为(a)AN-BDP NPs和Me-BDP NPs在4T1细胞中的随孵育时间摄取成像。

图10为AN-BDP NPs对HeLa、HepG-2和4T1细胞的暗毒性和光毒性。

图11为(a)AN-BDP NPs在4T1细胞中的亚细胞器定位。(b)4T1细胞中

图12为(a)4T1细胞溶酶体破坏的CLSM图像。在细胞与AN-BDP NPs(12μM)孵育后进行红光照射(630nm,27J/cm

图13为(a)尾静脉注射AN-BDP和Me-BDP NPs后，4T1荷瘤小鼠荧光成像图。(b)小鼠肿瘤部位AN-BDP和Me-BDP NPs的相对荧光强度随时间变化归一化曲线图。

图14为尾静脉注射AN-BDP NPs 3天后对主要器官进行体外成像，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤。

图15为(a)常规肿瘤大小治疗期间各组小鼠相对肿瘤体积变化(200mW/cm

图16为(a)大体积肿瘤(～350mm

图17为Ce6和Porphyrin NPs尾静脉注射小鼠体内荧光成像图。虚线圆圈表示肿瘤。

图18为用不同浓度的AN-BDP NPs处理的红细胞(RBC)的溶血率。

图19为各组小鼠正常组织H&E染色组织学分析。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC)和活性氧试剂盒(DCFH-DA)从碧云天生物科技公司购得。活/死细胞染色试剂盒(Calcein AM/PI)，Hoechst 33342均购于凯基生物。商业化亚细胞器定位染料如核染料Hoechst 33324、溶酶体LysoTrackerGreen DND-26、线粒体MitroTracker Green FM、Propidium Iodide(PI)从赛默飞公司购得。

Hela(人源宫颈癌细胞)，MCF-7(人源乳腺癌细胞)和4T1(鼠源乳腺癌细胞)购买于中国科学医学研究所(IBMS)。

实施例1 AN-BDP NPs光敏剂分子设计及合成

(1)中间体3的合成

中间体3的合成：3，5-二甲基吡咯醛(100mg，0.81mM)溶于干燥的CH

(2)中间体5的合成

在N

(3)目标化合物的合成

将苯甲醛(0.31ml,2.21mM)、3a(中间体3或中间体5)(0.58mM)、AcOH(0.10mL)或者催化量的对甲基苯磺酸和哌啶(0.10mL)溶解在甲苯(10mL)中，并加入一定量活化的

AN-BDP:

Me-BDP：

实施例2 AN-BDP NPs光敏剂分子的表征

(1)紫外可见、荧光光谱表征：精确配备3mmol/L AN-BDP和Me-BDP的DMSO母液，测试溶剂为二氯甲烷，测试浓度为10μM，测试温度为25℃。紫外可见吸收光谱测试范围为300-800nm，荧光发射光谱测试范围为600-900nm。

如图2所示，10μM AN-BDP在二氯甲烷的紫外吸收光谱发现在578nm和630nm处有两个相邻的吸收峰。而在～640nm处观察到AN-BDP的发射，说明允许荧光成像引导PDT。然而，AN-BDP NPs的吸收光谱在593和645nm处出现两个红移峰，分别属于典型的较宽的Soret带和Q带。说明形成聚集体AN-BDP以一定角度排列，AN-BDP NPs在水溶液中的吸收峰比单体在二氯甲烷中有明显的红移，说明AN-BDP在组装过程中分子间有π-π堆积相互作用发生。

(2)纳秒时间分辨瞬态吸收光谱表征：配备浓度为10μM AN-BDP的二氯甲烷溶液，并通氮气除氧30min。借助纳秒时间分辨瞬态吸收光谱仪，测试、比较两者的瞬态吸收光谱，并根据数据拟合630nm处三线态寿命。实验中使用的激发光源为590nm脉冲激光。

如图3(a)所示，在除氧的二氯甲烷溶剂中，使用590nm脉冲激光激发AN-BDP后，拟合AN-BDP在630nm处的三线态寿命为14μs，远长于典型的含重原子的PSs(例如，2,6-二碘-双苯乙烯BODIPY的t＝1.7μs)。三线态寿命的延长更加有利于三重态光敏剂与O

(3)活性氧检测：为了确定AN-BDP在红光照射下是否能够产生活性氧，使用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为

操作步骤：配置2.5mL吸光度为1.0左右DPBF CH

如图4所示，DPBF在415nm处的吸光度有明显的降低，说明AN-BDP有产生活性氧的能力。

(4)活性氧物种测定通过电子顺磁共振(EPR)光谱进一步验证了活性氧物种。5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)被用作O2-·或·OH的捕捉剂，2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TMPO)为

由图5可以看出辐照AN-BDP NPs溶液产生与

实施例3纳米粒子的合成与表征

(1)纳米粒子的合成

将光敏试剂(AN-BDP、或Me-BDP)溶解在THF(1mg，1mL)中，在超声处理(180W)下将其加入含DSPE-PEG

(2)纳米粒子的表征

将一定体积的纳米粒子溶液添加到样品池中，纳米粒子的直径由动态光散射(DLS)测定。纳米粒子形貌由透射电子显微镜(TEM)测定：取2.5μL稀释后的纳米粒子溶液滴加在碳膜覆盖的铜网上，待自然干燥后，在透射电子显微镜下观察。

通过纳米沉淀将AN-BDP配制成纳米颗粒。两亲性共聚物(DSPE-PEG

(3)纳米粒子稳定性测试

将制备好的纳米粒子稀释到一定浓度在PBS、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)不同时间纳米粒子吸光度的变化。用吸光度的变化确定纳米粒子的稳定性。

为了验证强的π-π堆积有利于提高纳米粒子稳定性，还合成了meso位甲基的BODIPY(Me-BDP)并制备Me-BDP NPs作为比较。然后测试了AN-BDP NPs和Me-BDP NPs在体外不同条件下的稳定性。采用归一化吸收强度比率变化来定量化纳米结构保持率(RNF％)。在37℃，PH为7.4时，在纯水、PBS缓冲液和牛血清白蛋白(BSA，45g/L)中孵育48小时后，AN-BDPNPs和Me-BDP NPs的RNF值均>95％(图7)，说明纳米粒子均未表现出破坏。胎牛血清(FBS，90v/v％)用于模拟血液环境。值得注意的是，即使是高浓度的FBS也不能显著诱导AN-BDPNPs的破坏。此外，孵育36小时后RNF值仍约为90％。相比之下，Me-BDP NPs的RNF值急剧下降至44％。因此，AN-BDP NPs表现出比Me-BDP NPs高得多的稳定性，这可归因于疏水嵌段内AN-BDP分子间强π-π堆积相互作用以及PEG链的保护作用使AN-BDP NPs具有更高的血清稳定性。

实施例4 AN-BDP NPs和Me-BDP NPs动力学模拟

为了揭示纳米颗粒稳定性的可能机制，使用GROMACS程序对AN-BDP NPs和Me-BDPNPs进行了分子动力学(MD)模拟(图8)。实际上，π-π堆积是芳香族化合物的一种特殊空间排列，可以分为两种类型：错位面对面(offset face-to-face，F-型堆积)和边对面(edge-to-face，T-型堆积)。在F-型堆积中，两个芳族系统形成平行的分子平面，它们的面间距约为

实施例5

本发明使用的小鼠乳腺癌4T1(鼠源乳腺癌细胞)，Hepg-2(人源肝癌细胞)，MCF-7(人源乳腺癌细胞)细胞均在含有1％青链霉素混合液、10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃，2％O

(1)AN-BDP NPs和Me-BDP NPs细胞摄入实时荧光成像

取100μL 4T1细胞悬液(1×10

光敏剂在细胞的摄入及保留时间是光动力抗肿瘤效果的关键因素之一，只有当光敏剂在细胞有效富集及保留，才能在光照后产生的活性氧破坏癌细胞，从而诱导细胞凋亡或死亡，达到抑制肿瘤生长的目的。使用4T1肿瘤细胞研究AN-BDP NPs的细胞摄取情况(图9)。首先，将4T1细胞与Hoechst 33342在黑暗中孵育15min。然后，将4T1细胞与AN-BDP NPs在黑暗中孵育不同的时间共聚焦显微镜成像。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)显示AN-BDPNPs可以被4T1细胞迅速吸收，并且荧光强度随着孵育时间的增加而增加。值得注意的是，孵育28小时后仍然有强烈的红色荧光，而Hoechst 33342的荧光几乎不可见。这些结果表明AN-BDP NPs是稳定的，可以长时间保留在细胞中。然而，由于细胞胞吐作用，在孵育28小时后Me-BDP NPs的红色荧光显着降低。因此，强的π-π堆积可以使AN-BDP NPs具有更高的稳定性和更长的保留时间，这对于在PDT过程杀死肿瘤细胞都至关重要。

(2)AN-BDPNPs的细胞存活率测试

本实验采用MTT法测试细胞存活率。

操作步骤：MCF-7、HepG-2和4T1细胞接种于96孔板(每孔1×10

其中，受试组为不同浓度AN-BDP NPs处理的细胞培养组；空白组为只加培养基组；对照组为未加AN-BDP NPs细胞培养组；OD为甲瓒的DMSO溶液在490nm处的吸光。

当在黑暗条件下使用12μM的AN-BDP NPs时，几乎没有观察到细胞毒性，细胞存活率在90％以上，表明AN-BDP NPs在没有辐射的情况下具有良好的生物相容性。相反，当细胞在27J/cm

(3)细胞内单线态氧产生成像

操作步骤：4T1细胞与5μM AN-BDP NPs孵育3小时，然后用5μM DCFH-DA孵育0.5小时后，弃掉培养基，用PBS清洗三次，加入2mL无血清的DMEM。在

如图11b，与对照组相比，在630nm LED灯光照下，AN-BDP NPs处理的4T1细胞显示亮绿色荧光，表明ROS有效生成。相反，在没有光或纳米颗粒的组中，检测不到绿色荧光。此外，AN-BDP NPs诱导的ROS被NaN

(4)AN-BDP NPs亚细胞器共定位成像

待4T1细胞在共聚焦皿中生长至对数生长期后，加入2μM AN-BDP NPs孵育摄取2h，然后用不同的商业化染料对细胞进行共孵育15min。

AN-BDP NPs的红色荧光与溶酶体染料LysoTracker Green DND 26(一种商业溶酶体染料)的绿色荧光完全叠加，Pearson相关系数为0.87(图11a)。因此，AN-BDPNPs被细胞内吞并特异性定位在溶酶体中。相比之下，AN-BDP NPs、商业化线粒体染料(MitoTrakerGreen)和细胞核染料(Hoechst 33342，图11a)的共定位相关系数却很低。

(5)AN-BDP NPs在红光照射下溶酶体破坏实验

本实验采用吖啶橙又称3,6-双(二甲基氨基)吖啶氯化锌盐酸盐(AO)作为溶酶体完整性指示剂来直观指示630nm OLED红光激发AN-BDP NPs产生的

将4T1细胞接种到35mm共聚焦培养皿上，并在37℃下5％CO

在对照组、AN-BDP NPs组和光照组观察到大量红色荧光(白色箭头)，说明溶酶体是完整的。然而，在AN-BDP NPs在630nm光照射下AO红色荧光的消失所(图12a)，细胞核明显收缩，细胞塌陷(黄色箭头)，说明溶酶体的完整性严重受损。

(6)AN-BDP NPs诱导的活/死细胞染色实验

将4T1细胞接种到35mm共聚焦培养皿24小时，待细胞生长至对数期，对照组细胞在没有任何处理的情况下孵育；光照组：细胞用630nm(30mW/cm

然后使用活/死细胞染色实验来确认AN-BDP NPs在630nm 27J/cm

(7)AN-BDP NPs诱导的细胞死亡途径验证实验

我们还研究了AN-BDP NPs在光照下产生

操作步骤：将4T1细胞接种到35mm 6孔板孵育24小时，然后分为以下几组：对照组，细胞在没有任何处理的情况下孵育；光照组：细胞用630nm(30mW/cm

对照组与光照组和AN-BDP NPs组相似，存活率都在96％以上，并没有检测到明显的凋亡信号。相反，AN-BDP NPs在630nm 27J/cm

实施例6

(1)异种移植肿瘤模型建立(4T1乳腺癌)

本实施例所用小鼠均为6周龄BALB/c雌鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，相关实验操作均按照《实验室动物护理和使用指南》和国家研究委员会的规定进行，并通过大连理工大学动物护理与使用委员会批准。文件编号/伦理批准编号：2018-043。建立常规体积肿瘤大小(初始体积为～100mm

(2)体内靶向生物分布及荧光影像

为了验证π-π堆积有利于纳米粒子的稳定性从而延长纳米粒子的肿瘤保留时间以及纳米粒子的肿瘤靶向性和最佳治疗时间，取上述荷瘤小鼠，将AN-BDP NPs或Me-BDP NPs(100μL，200μM)尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，并在注射后的不同时间观察荧光成像(图13a)。激发波长为590nm，发射接受波段为600-700nm。

通过小鼠成像分析，绘制出时间依赖型肿瘤区域的标准化荧光强度图像(图13b)。由图13a可以看出Me-BDP NPs在注射后18小时首次在肿瘤部位可见红色荧光，36小时后消失，表明在肿瘤部位有限的保留时间。相比之下，AN-BDP NPs表现出增强的肿瘤保留时间长达240小时，高强度的荧光从12小时持续到180小时，这比以前报道的纳米光敏剂长得多。AN-BDP NPs优异的肿瘤富集和延长的保留时间是由于封装的AN-BDP具有强的π-π堆积和PEG壳的保护减少了非特异性蛋白质吸附。注射后240小时，小鼠其他部位几乎检测不到荧光，但大量AN-BDP NPs仍保留在肿瘤部位，显示出强烈的荧光。在小鼠荧光成像的过程中，AN-BDP注射小鼠肿瘤部位和周边正常组织荧光信号对比明显，肿瘤边界非常清楚，具有非常高的信号背景比(signal-to-background ratio，SBR)，可以精准引导光动力治疗。长的肿瘤保留时间可以一次注射多次治疗的大肿瘤或者恶性肿瘤。

为了定量研究主要器官的生物分布，我们在注射AN-BDP NPs 3天后处死小鼠，并收集肿瘤和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)进行成像。如图14，AN-BDPNPs主要积累在肿瘤组织中，肝脏有较低的富集，这与上述小鼠荧光成像结果一致。AN-BDP NPs在肿瘤部位的高分布和长时间保留有利于增强PDT。

(3)体内肿瘤光动力治疗

荧光成像引导的体内实体瘤靶向光动力治疗实验分为两部分，分别测试了常规肿瘤体积模型以及大肿瘤模型的抑瘤效果。

(i)常规肿瘤体积抑瘤实验

受AN-BDP NPs优异的肿瘤富集和长保留时间的鼓舞，我们首先研究了AN-BDPNPs在常规大小(最初～100mm

(ii)大体积肿瘤抑瘤实验

接下来，我们评估了AN-BDP NPs小鼠的大肿瘤模型的治疗性能，初始肿瘤体积为～350mm

我们首先测试了AN-BDP NPs在常规测试尺寸(最初～100mm

接下来，我们评估了AN-BDP NPs对小鼠的大肿瘤模型治疗的效果，初始肿瘤体积为～350mm

(4)体内生物安全性评价

首先血液分析评估了AN-BDP NPs的生物安全性。具体步骤为：将新鲜无菌的脱纤维绵羊血3mL加入到6mL PBS缓冲液，转速1500rpm离心8min，弃上清液直到上清液澄清。之后将所得红细胞制备2％的红细胞悬液。用不同浓度的AN-BDP NPs与等体积的2％红细胞悬液在37℃180rpm共孵育4个小时。孵育结束后，转速1500rpm离心8min除去完整的红细胞，取上清液用酶标仪测545nm处的吸光度。

其中，受试组为不同浓度AN-BDP NPs处理的红细胞悬液组；阴性对照组为PBS缓冲溶液孵育的红细胞悬液组；阳性对照组为去离子水孵育的红细胞悬液组；OD为545nm处的吸光度。

接下来还测试了活体的安全性。具体步骤为：将健康小鼠分为4组(n＝5)，包括(1)静脉注射(i.v.)生理盐水(100μL)(对照组)；(2)用200mW/cm

AN-BDP NPs生物体内安全性还通过观察治疗期间内各组小鼠体重有无明显变化，以及治疗结束后主要器官的组织染色进行评价。

良好的生物相容性是生物医用材料的必要条件之一。首先，测试进行血液分析以评估AN-BDP NPs的生物安全性。溶血率小于5％被认为材料具有良好的生物相容性。即使当AN-BDP NPs溶液的浓度高达200μM时，也没有发生明显的溶血(图18)，表明对血液具有良好的生物相容性。

其次，我们还对小鼠全血进行测试，所有测量参数都在正常范围内(表1)，表明由AN-BDP NPs引起的急性炎症可以忽略不计，生物相容性良好。

表1全血细胞检测包括：RBC、WBC、PLT、HGB、HCT、MCV、MCH、NEUT、LYMPH、MONO。

值得注意的是，不同组的小鼠体重缓慢增加，但在整个实验过程中没有观察到额外的副作用(图15b和16b)。最后在治疗周期结束后主要小鼠器官组织的组织病理学评估。如图19所示，所有组织的H&E染色在所有组中均未显示出显着的病理变化。说明AN-BDP NPs具有良好的生物相容性。

总之，我们已经证明了强π-π堆积稳定纳米光敏剂是一种有前途的平台，可延长纳米光敏剂在光动力治疗期间的血液循环和肿瘤保留时间。AN-BDP NPs表现出优异的稳定性，可以在肿瘤部位停留长达10天，这比其他任何现有光敏剂的肿瘤保留时间都要长。在常规测试肿瘤体积大小(～100mm