一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种构建简便、高效的植物多基因编辑载体方法，其包括pMK‑(1‑12)中间载体及终载体pMMK‑Cas9。载体构建的方法包括以下步骤：将多个sgRNA通过多顺反子tRNA‑gRNA方式连接到pMK(1‑12)中间载体上，每个中间载体上可以连接1‑8个sgRNAs，得到pMK(1‑12)‑PTG载体；将多个pMK(1‑12)‑PTG载体上的U6/U3表达盒连接到pMMK‑Cas9载体上，pMMK‑Cas9可以连接2个到7个pMK(1‑12)‑PTG载体上的U6/U3表达盒，得到pMMK‑PTG载体，根据不同的靶位点和小载体组合，可达到2‑56个靶位点的多基因编辑。整个流程只需要一次PCR反应和两次“金门”连接体系即可完成，流程简单快速。本发明还以该载体敲除水稻LEA基因家族25个成员为例，验证该载体多基因编辑的高效性。