载体pAAVeG-sgRNa-供体DNA的构建及与CRISPR/Cas9共同介导的基因编辑

摘要

目的:
　　构建AAV表达载体pAAVeG-U6gRNA，并根据不同的受体细胞设计不同的基因编辑模型来验证新构建载体与CRISPR/Cas9共同介导基因编辑的能力。
　　方法:
　　首先通过基因克隆的方法，将原始的真核表达载体phU6-gRNA改造成能够同时插入gRNA与外源供体DNA的AAV表达载体pAAVeG-U6gRNA，完成后通过基因测序确定改造后的载体序列，并且利用AAV辅助包装系统(AAV-DJ Helper Free Bicistronic System)将其包装成病毒颗粒后感染肌细胞，用以检测包装成的病毒颗粒是否有感染能力。其次，为了验证构建的pAAVeG-U6gRNA载体基因编辑的功能，我们设计了三个基因编辑的模型，包括人HFF细胞Slug基因的删除模型（pAAVeG-hSlug-g3-g4）、 Mdx模型鼠肌细胞DMD基因的纠正模型(pAAVeG-Mdx-g3-Donor4)以及Slugtag在鼠C2C12细胞Slug基因的插入模型（pAAVeG-mSlugtag-gRNA2）。利用AAV辅助包装系统在293T细胞系中将各个模型AAV载体包装成AAV，然后与表达CRISPR/Cas9和RFP的腺病毒(AdR-Cas9)共同感染受体细胞，最终通过PCR、WesternBlot、药物筛选及基因组测序等实验技术验证载体pAAVeG-U6gRNA基因编辑功能。
　　结果:
　　各模型AAV及AdR-Cas9感染的受体细胞带有绿色荧光及红色荧光，表明感染成功，加入病毒液感染48小时后，用倒置荧光显微镜观察，结果显示各受体细胞的感染效率约为60％。PCR、基因测序及Western Blot结果显示，载体pAAVeG-hSlug-g3-g4成功介导了人HFF细胞Slug基因的删除;载体pAAVeG-Mdx-g3-Donor4成功介导了Mdx模型鼠肌细胞DMD基因的纠正;载体pAAVeG-mS lugtag-gRNA2成功介导Slugtag外源供体基因在鼠C2C12细胞Slug基因中的插入。
　　结论:
　　成功构建了可同时插入gRNA和供体DNA的AAV表达载体pAAVeG-U6gRNA。

目录

声明

英文缩略词汇表

摘要

前言

第一部分 AAV载体pAAVeG-U6gRNA的构建、AAV的包装及感染能力的检测

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 本章小结

第二部分 载体pAAVeG-U6gRNA与CRISPR／Cas9共同介导的基因编辑

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 本章小结

综述 腺相关病毒载体及CRISPR／Cas9在基因治疗方向的发生与发展过程

参考文献

致谢