一种古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒薄层鉴别及总黄酮含量测定的方法

摘要

本发明公开了一种古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒薄层鉴别及总黄酮含量测定的方法，该方法采用薄层色谱(TLC)法对蠲痹颗粒中的羌活、独活、秦艽进行鉴别；以芦丁为对照品，以5％亚硝酸钠‑10％硝酸铝‑氢氧化钠试液为显色体系，在510nm波长下以分光光度法测定总黄酮。结果薄层法色谱鉴别专属性强，斑点清晰，阴性无干扰；芦丁浓度在0.01038～0.06228mg/ml范围内与吸光度线性关系良好,回归方程为y＝12.264x‑0.0061(r2＝0.9999；n＝6),平均加样回收率101.24％(RSD＝1.56％)。本方法简便易行，结果准确，重复性好，用于蠲痹颗粒的质量控制，可为全面评价和控制古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒的质量提供理论依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒薄层鉴别及总黄酮成分含量测定，具体的说是一种鉴别蠲痹颗粒中的羌活、独活、秦艽，对活性大类成分总黄酮进行含量测定的方法，属于医药技术领域。

背景技术

中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒祛风除湿，蠲痹止痛，主治风寒湿三气合而成痹者。中医痹症，现代中医将其称之为尪痹，指风寒湿邪侵袭关节，气血痹阻所致的骨关节病，以小关节疼痛，肿胀，晨僵，甚至变形为特点，西医病名类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)为其中一种。类风湿性关节炎为自身免疫疾病，治愈难，发病率有逐年上升的趋势。蠲痹颗粒处方出自清代程国彭《医学心悟》。蠲痹汤，因临床用于防治RA，疗效确切，获批为国家古代经典名方类新药，医学前景良好。

目前国内关于中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒制剂质量控制方面少有研究，为使制剂质量得到有效控制，因此选择蠲痹颗粒中的羌活、独活、秦艽TLC鉴别及活性大类成分总黄酮含量测定的质量评价指标，为控制中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒质量提供科学依据。

本发明建立了中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒羌活、独活、秦艽的TLC鉴别及总黄酮含量测定的检测方法，实验结果表明，本法建立薄层法色谱鉴别法专属性强，斑点清晰，阴性无干扰；以芦丁为对照品，以5％亚硝酸钠-10％硝酸铝-氢氧化钠试液为显色体系，在510nm波长下以分光光度法测定总黄酮含量的方法，简单快速、准确可靠，重复性及稳定性均较好，可作为该制剂的质量控制方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒薄层鉴别及总黄酮成分含量测定，该方法简单、稳定、重现性好，可用于该药品的质量控制。

本发明的目的是这样实现的：具体步骤如下：

1、薄层鉴别：

A羌活：精密称取羌活对照药材1.0g置具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚(60～90℃)，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加入1ml乙酸乙酯溶解，作为羌活对照药材溶液；精密取蠲痹颗粒样品粉末称取2.0g，同对照药材溶液制备方法，制备供试品溶液；取缺羌活的的阴性样品，同对照药材制备的方法，制成羌活阴性对照溶液。精密吸取供试品溶液、阴性样品溶液和羌活对照药材溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯(8:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点。

B独活：精密称取独活对照药材1.0g，加入20ml石油醚(60～90℃)，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml溶解，作为独活对照药材溶液；精密称取蠲痹颗粒粉末2.0g，同对照药材溶液制备方法，制备供试品溶液。取缺独活的阴性样品,同对照药材溶液制备方法,制成独活阴性对照溶液。精密吸取供试品溶液、独活对照药材溶液和阴性样品溶液各5μl，分别同一硅胶G板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(7:3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。

C秦艽：精密称取秦艽对照药材1.0g，加甲醇20ml，超声波提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为秦艽对照药材溶液。精密称取蠲痹颗粒样品2.0g，同秦艽对照药材溶液制备方法，制备供试品溶液。取缺秦艽的阴性样品,同对照药材溶液制备方法,制成秦艽的阴性对照溶液。精密吸取供试品溶液、秦艽对照药材溶液和阴性样品溶液各10μl，分别点于同一块硅胶GF 254板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8:2:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干在紫外线灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2、总黄酮含量测定：

A对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，置于25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度线，摇匀，制备浓度为0.519mg·ml

B供试品溶液的制备：取蠲痹颗粒细粉约3.0g，精密称定，置于索氏提取器中，加入三氯甲烷加热回流提取至无色，弃去三氯甲烷溶液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色(约3h)，提取液挥干，残渣加乙醇，溶解，置25ml容量瓶中，加乙醇至刻度线，摇匀，作为供试品溶液。

C分离检测：精密移取芦丁对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml，分别置于25ml容量瓶中，按顺序加水至6ml，加5％NaNO

本发明具有以下优点和积极效果：

1、本发明所述方法简单、准确、重现性和稳定性好，可为全面评价和控制蠲痹颗粒质量提供理论基础和科学依据。

2、本发明方法采用薄层色谱(TLC)法对蠲痹颗粒中的羌活、独活、秦艽进行鉴别；以芦丁为对照品，以5％亚硝酸钠-10％硝酸铝－氢氧化钠试液为显色体系，在510nm波长下以分光光度法测定总黄酮。结果薄层法色谱鉴别专属性强，斑点清晰，阴性无干扰；芦丁浓度在0.01038～0.06228mg/ml范围内与吸光度线性关系良好,回归方程为y＝12.264x-0.0061(r

3、本发明方法操作简单、精密度、重现性和稳定性良好，为蠲痹颗粒有效成分质量控制和药效评价的进一步研究奠定了理论基础和科学依据。

附图说明

图1是本发明羌活薄层色谱鉴别图

附图标记说明：1-2为羌活对照药材；

3-5为蠲痹颗粒样品；

6为缺羌活阴性对照样品

图2是本发明独活薄层色谱鉴别图

附图标记说明：1-2为独活对照药材

3-5为蠲痹颗粒样品

6缺独活阴性对照样品

图3是本发明秦艽薄层色谱鉴别图

附图标记说明：1-2为秦艽对照药材

3-5为蠲痹颗粒样品

6为缺秦艽阴性对照样品

图4是本发明芦丁和供试品最大吸收波长扫描图

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

1仪器与试剂

752型紫外-可见分光光度计(上海舜恒平科学仪器有限公司)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、电子天平ME104E/02(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、HH-4数显恒温水浴锅(常州奥华仪器有限公司)、SQP十万分之一电子天平(塞多利斯科学仪器(北京)有限公司)，芦丁对照品(100080-201811)天津西玛科技有限公司提供；羌活、独活、秦艽；硅胶G(青岛海洋化工厂)；蠲痹颗粒及阴性样品制剂为自制，其他试剂为分析纯、水(怡宝纯净水)。

2方法及结果

2.1薄层鉴别

2.1.1羌活：精密称取羌活对照药材1.0g置具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚(60～90℃)，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加入1ml乙酸乙酯溶解，作为羌活对照药材溶液；精密取蠲痹颗粒样品粉末称取2.0g，同对照药材溶液制备方法，制备供试品溶液；取缺羌活的的阴性样品，同对照药材制备的方法，制成羌活阴性对照溶液。精密吸取供试品溶液、阴性样品溶液和羌活对照药材溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯(8:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。

2.1.2独活：精密称取独活对照药材1.0g，加入20ml石油醚(60～90℃)，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml溶解，作为独活对照药材溶液；精密称取蠲痹颗粒粉末2.0g，同对照药材溶液制备方法，制备供试品溶液。取缺独活的阴性样品,同对照药材溶液制备方法,制成独活阴性对照溶液。精密吸取供试品溶液、独活对照药材溶液和阴性样品溶液各5μl，分别同一硅胶G板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(7:3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰，见图2。

2.1.3秦艽：精密称取秦艽对照药材1.0g，加甲醇20ml，超声波提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为秦艽对照药材溶液。精密称取蠲痹颗粒样品2.0g，同秦艽对照药材溶液制备方法，制备供试品溶液。取缺秦艽的阴性样品,同对照药材溶液制备方法,制成秦艽的阴性对照溶液。精密吸取供试品溶液、秦艽对照药材溶液和阴性样品溶液各10μl，分别点于同一块硅胶GF 254板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8:2:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干在紫外线灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图3。

2.2总黄酮的测定

2.2.1对照品的制备

精密称取芦丁对照品适量，置于25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度线，摇匀，制备浓度为0.519mg·ml

2.2.2供试品的制备

取蠲痹颗粒细粉约3.0g，精密称定，置于索氏提取器中，加入三氯甲烷加热回流提取至无色，弃去三氯甲烷溶液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色(约3h)，提取液挥干，残渣加乙醇，溶解，置25ml容量瓶中，加乙醇至刻度线，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3测定波长的选择

精密取对照品溶液、供试品溶液2ml，分别置于25ml容量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6min，加4％氢氧化钠试液10.0ml，再加水稀释至刻度，摇匀，放置15min，以甲醇代替供试品溶液，同法空白对照品溶液，在400～700nm范围内进行扫描，确定芦丁和供试品显色液吸收波长为508nm。如图4所示

2.2.4线性关系

精密移取芦丁对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml，分别置于25ml容量瓶中，按顺序加水至6ml，加5％NaNO

表1线性实验结果

2.2.5方法学考察

2.2.5.1精密度试验

精密吸取“2.2.1”项对照品溶液3.0ml，分别置于25ml量瓶中，其余同“2.2.4”项下操作，在508nm波长下测定吸光度，重复操作6次，其吸光度的RSD＝0.3814％(n＝6)，说明该方法精密度良好。

2.2.5.2稳定性实验

精密称取蠲痹颗粒粉末3g，参照“2.2.2”项下方法制备样品溶液，精密吸取样品1ml,按“2.2.4”项方法显色，分别于显色后0、5、10、20、40、60min测定吸光度值，RSD＝0.64％(n＝6)，结果表明样品显色后在60min内稳定。

2.2.5.3重复性试验

平行称取一批蠲痹颗粒样品粉末3g，共6份，精密称定，依“2.2.2”项下方法制备样品溶液，精密吸取样品1ml溶液,按“2.2.4”项下操作，测得其平均含量为3.70mg/g，RSD为2.03％，表明该方法重复性良好。

2.2.8加样回收试验

精密称取芦丁对照品3.70mg共6份，分别加入已知含量的蠲痹颗粒样品中(已测得其总黄酮含量3.702mg/g)。取蠲痹颗粒细粉约1.0g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取样品1ml,按“2.2.4”项下操作,平均加样回收率为100.05％，RSD＝2.19％，(n＝6)，表明该方法科学合理(结果见表2)。

表2样品回收试验

2.2.9样品含量测定

取10批蠲痹颗粒样品各3g，精密称定，参照“2.2.2”项下方法制备样品溶液，精密吸取上述溶液1ml,按“2.2.4”项下操作，测定吸光度值，样品中总黄酮的含量测定结果见表3。

表3样品含量测定

综上所述，本实验通过薄层鉴别研究，建立了蠲痹颗粒中羌活、独活、秦艽药材的定性鉴别方法，采用紫外分光光度法对样品中总黄酮含量进行测定，建立了蠲痹颗粒的总黄酮含量测定方法，方法操作简便，可用于蠲痹颗粒分析及质量控制。