妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法

摘要

本发明公开了妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法，根据所需的层液，抽排处其他液体，在抽排时，按压定位板,吸料管随之下降，吸料管的底端能够准确深入到储纳试管的层液中，这时旋转丝杆，能够实现对活塞的提升，能够更加准确的对层液的分离，不需要逐层进行，能够提高分析料率，提高分析的准确度；在对试剂添加时，通过释放连接管上的阀门，气罐的高压气体进入U型管,U型管一端的气压增强，U型管另一端的药剂实现溢流，能够更加准确的实现对试剂的添加，操作简单、便捷、准确；通过利用密度梯度离心法分离血清中胎盘来源外泌体，通过基因芯片和实时荧光定量PCR检测miRNA表达情况，以ROC曲线分析其预测效能，能够及时预防疾病的发生能。

说明书

技术领域

本发明涉及医学技术领域，具体为妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法。

背景技术

外泌体是由细胞主动分泌的具有脂质双分子层膜结构的微小囊泡，近年研究发现，妊娠期间在母体循环中存在胎盘来源的外泌体，它们主要由胎盘滋养细胞和内皮细胞等生成并释放，可通过其携带的蛋白质、脂质和核酸等多种生物活性物质调控受体细胞功能，参与妊娠生理和病理过程，目前，有关妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体的成分和功能研究报道仍然较少；

在妊娠期糖尿病患者进行诊断时，不清楚糖尿病的诱发原因，不能在妊娠过程中及时的阻断，导致孕妇在妊娠期患糖尿病的风险增高，在分析样品进行离心过程中，排液过程复杂，需要逐层进行，操作效率低，分析表达效果不准确，在试剂添加时，添加的准确度不精，导致分析结果不准确。

发明内容

本发明的目的在于提供妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法，解决了不清楚糖尿病的诱发原因，不能在妊娠过程中及时的阻断，导致孕妇在妊娠期患糖尿病的风险增高，在分析样品进行离心过程中，排液过程复杂，需要逐层进行，操作效率低，分析表达效果不准确，在试剂添加时，添加的准确度不精，导致分析结果不准确的技术问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法，步骤如下：

S1:在孕8~12周采集静脉血，静置1h，离心作业10min，静置后分离收集血清；

S2:转移至的移液枪管中，置于-80℃ 低温冰箱保存,取出血清样本200μL，离心作业10min，静置后取上清液;

S3:加入提取试剂混匀,静置30min，再次进行离心作业，在静置后，移除上层液体，在移液枪管中加入蔗糖液悬浮沉淀;

S4:采用RNAiso Plus试剂对胎盘来源外泌体总RNA进行抽提和纯化;

S5:应用试剂盒对7种差异表达的miRNA进行定量检测验证。

作为本发明进一步的方案：所述S4中，纯化过程通过利用密度梯度法纯化，通过透射电镜观察形态特征和免疫印迹法检测生物标记蛋白CD63、PLAP对胎盘来源外泌体进行鉴定。

作为本发明进一步的方案：在所述S2、S3和S4的作业过程中通过使用一体式的离心分离装置完成。

作为本发明进一步的方案：所述一体式的离心分离装置包括底板、离心电机、限位筒、离心筒、储纳试管、灯管、补料结构、密封结构和排料结构，所述底板的顶部安装有离心电机，所述离心电机的转轴上配合安装有离心筒，所述限位筒固定在底板的顶侧，所述离心筒的底部配合设置在限位筒的内部，所述离心筒的底部内壁上安装有储纳试管，所述离心筒的内壁上安装有灯管，所述密封结构安装在离心筒的顶部中心，所述密封结构和排料结构分别安装在离心筒的顶部两侧。

作为本发明进一步的方案：所述排料结构包括吸料管、定位板、导流管、丝杆、活塞、储纳罐和膨胀弹簧，所述离心筒的顶部筒壁上开设有管孔，所述吸料管贯穿设置在管孔内，所述吸料管的顶端套装固定有定位板，所述吸料管的顶端外部套装有膨胀弹簧，所述储纳罐的内部安装有活塞，所述活塞的顶侧固定有丝杆，所述丝杆的顶部通过螺纹配合穿设在储纳罐的顶端罐壁内，所述吸料管的顶端与储纳罐的底部通过导流管配合连接，所述导流管上安装有阀门，所述储纳罐固定在离心筒的顶侧。

作为本发明进一步的方案：所述补料结构包括进料管、气罐、连接管和U型管，所述U型管与气罐并列安装在离心筒上，所述U型管的一端与气罐的顶端通过连接管连接，所述连接管上安装阀门，所述U型管的另一端连接固定有进料管。

作为本发明进一步的方案：所述密封结构包括定位管、橡胶垫、拉伸弹簧、固定座、摆动杆和密封塞，所述定位管的底部圆周面一侧安装有固定座，所述固定座上通过销轴配合安装有摆动杆，所述摆动杆的底端安装有密封塞，所述摆动杆的顶端与定位管的底部管壁之间固定有拉伸弹簧，所述定位管的顶部端口固定有橡胶垫，所述定位管安装在离心筒的顶部。

本发明的有益效果：

本发明通过在移液枪插入定位管内，在移液枪的推动配合下，在橡胶垫的包裹配合下，避免细菌杂质的进入，在移液枪抽离时，在拉伸弹簧的配合下，推动摆动杆的一端摆动，实现密封塞的复位，定位管进行封闭，保证离心过程无杂质进入，提高分析数据的准确性；

根据所需的层液，抽排处其他液体，在抽排时，按压定位板,吸料管随之下降，吸料管的底端能够准确深入到储纳试管的层液中，这时旋转丝杆，能够实现对活塞的提升，能够更加准确的对层液的分离，不需要逐层进行，能够提高分析料率，提高分析的准确度；

在对试剂添加时，通过释放连接管上的阀门，气罐的高压气体进入U型管,U型管一端的气压增强，U型管另一端的药剂实现溢流，能够更加准确的实现对试剂的添加，操作简单、便捷、准确；

通过利用密度梯度离心法分离血清中胎盘来源外泌体，通过基因芯片和实时荧光定量PCR检测miRNA表达情况，以ROC曲线分析其预测效能，能够及时预防疾病的发生。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为离心分离装置的正视立体结构示意图；

图2为离心分离装置的俯视立体结构示意图；

图3为离心分离装置的侧视立体结构示意图；

图4为离心分离装置的内部结构示意图；

图5为离心分离装置的内部结构中A区域结构示意图；

图中：1、底板；2、离心电机；3、限位筒；4、离心筒；5、储纳试管；6、灯管；7、补料结构；8、密封结构；9、排料结构；71、进料管；72、气罐；73、连接管；74、U型管；81、定位管；82、橡胶垫；83、拉伸弹簧；84、固定座；85、摆动杆；86、密封塞；91、吸料管；92、定位板；93、导流管；94、丝杆；95、活塞；96、储纳罐；97、膨胀弹簧。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1-5所示，妊娠期糖尿病患者胎盘来源外泌体miRNA表达分析方法，步骤如下：

S1:在孕8~12周采集静脉血，静置1h，离心作业10min，静置后分离收集血清；

S2:转移至的移液枪管中，置于-80℃ 低温冰箱保存,取出血清样本200μL，离心作业10min，静置后取上清液;

S3:加入提取试剂混匀,静置30min，再次进行离心作业，在静置后，移除上层液体，在移液枪管中加入蔗糖液悬浮沉淀;

S4:采用RNAiso Plus试剂对胎盘来源外泌体总RNA进行抽提和纯化;

S5:应用试剂盒对7种差异表达的miRNA进行定量检测验证。

S4中，纯化过程通过利用密度梯度法纯化，通过透射电镜观察形态特征和免疫印迹法检测生物标记蛋白CD63、PLAP对胎盘来源外泌体进行鉴定。

作为本发明的实施方式，在S2、S3和S4的作业过程中通过使用一体式的离心分离装置完成。

作为本发明的实施方式，一体式的离心分离装置包括底板1、离心电机2、限位筒3、离心筒4、储纳试管5、灯管6、补料结构7、密封结构8和排料结构9，底板1的顶部安装有离心电机2，离心电机2的转轴上配合安装有离心筒4，限位筒3固定在底板1的顶侧，离心筒4的底部配合设置在限位筒3的内部，离心筒4的底部内壁上安装有储纳试管5，离心筒4的内壁上安装有灯管6，密封结构8安装在离心筒4的顶部中心，密封结构8和排料结构9分别安装在离心筒4的顶部两侧。

作为本发明的实施方式，排料结构9包括吸料管91、定位板92、导流管93、丝杆94、活塞95、储纳罐96和膨胀弹簧97，离心筒4的顶部筒壁上开设有管孔，吸料管91贯穿设置在管孔内，吸料管91的顶端套装固定有定位板92，吸料管91的顶端外部套装有膨胀弹簧97，储纳罐96的内部安装有活塞95，活塞95的顶侧固定有丝杆94，丝杆94的顶部通过螺纹配合穿设在储纳罐96的顶端罐壁内，吸料管91的顶端与储纳罐96的底部通过导流管93配合连接，导流管93上安装有阀门，储纳罐96固定在离心筒4的顶侧。

作为本发明的实施方式，补料结构7包括进料管71、气罐72、连接管73和U型管74，U型管74与气罐72并列安装在离心筒4上，U型管74的一端与气罐72的顶端通过连接管73连接，连接管73上安装阀门，U型管74的另一端连接固定有进料管71。

作为本发明的实施方式，密封结构8包括定位管81、橡胶垫82、拉伸弹簧83、固定座84、摆动杆85和密封塞86，定位管81的底部圆周面一侧安装有固定座84，固定座84上通过销轴配合安装有摆动杆85，摆动杆85的底端安装有密封塞86，摆动杆85的顶端与定位管81的底部管壁之间固定有拉伸弹簧83，定位管81的顶部端口固定有橡胶垫82，定位管81安装在离心筒4的顶部。

本发明的工作原理：在作业过程中，将装有静脉血的移液枪贯穿定位管81，插入离心筒4内，在移液枪插入定位管81内，在移液枪的推动配合下，推动86与定位管81分离，在橡胶垫82的包裹配合下，避免细菌杂质的进入，在移液枪抽离时，在拉伸弹簧83的配合下，推动摆动杆85的一端摆动，实现密封塞86的复位，定位管81进行封闭，保证离心过程无杂质进入，提高分析数据的准确性，在离心过程中，需要对待测溶剂添加和抽排，在抽排过程中，在血液离心静置后，会在储纳试管5内产生分层，根据所需的层液，抽排处其他液体，在抽排时，按压定位板92，吸料管91随之下降，吸料管91的底端能够准确深入到储纳试管5的层液中，这时旋转丝杆94，能够实现对活塞95的提升，能够更加准确的对层液的分离，不需要逐层进行，能够提高分析料率，提高分析的准确度，在对试剂添加时，通过释放连接管73上的阀门，气罐72的高压气体进入U型管74,U型管74一端的气压增强，U型管74另一端的药剂实现溢流，能够更加准确的实现对试剂的添加，操作简单、便捷、准确，通过利用密度梯度离心法分离血清中胎盘来源外泌体，通过基因芯片和实时荧光定量PCR检测miRNA表达情况，以ROC曲线分析其预测效能，能够及时预防疾病的发生。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。