【相关申请的交叉引用】
本申请与下列申请属于相似的技术领域：2018年5月10日提交的题为“Association between Integration of High-Risk HPV Genomes Detected byMolecular Combing and the Severity and/or Clinical Outcome of CervicalLesions”的美国申请第15/976,758(或WO2018/207022)；2015年3月4日提交的Mahiet等人的题为“Diagnosis of Viral Infections by Detection of Genomic and InfectiousViral DNA by Molecular Combing”的US 2016/0047006 A1；2006年9月7日提交的Lebofsky等人的题为“Genomic Morse Code”的美国专利No.7,985,542 B2；和2007年9月5日提交的Lebofsky等人的题为“Genomic Morse Code”的美国专利No.8,586,723 B2。这些文件中的每一个都通过引用整体并入。
【发明背景】
【发明领域】本发明属于病毒学和分子生物学领域，特别是应用于医学诊断、预后和治疗。
【相关技术的描述】宫颈癌是2013年捷克女性发病率第10位的癌，新发病例895例，标准化发病率为每年11/100,000人(世界第105位)，388例死亡，标准化死亡率为每年3.76/100,000人(世界第130位)。
这种癌的发病与一种或几种高风险人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染有关，并且已被世界卫生组织确认为几乎100％的病例可归因于这些病毒。与宫颈癌相关的最常见基因型是HPV基因型16、18、31、33和45，占这些癌的80％以上。由于其进展缓慢，宫颈癌可以通过筛查和治疗之前的癌前病变来预防。捷克共和国卫生部于2008年启动了国家宫颈癌筛查计划。该计划的目的是早期发现宫颈癌。筛查适用于所有15岁以上的女性。筛查目前基于每年一次的巴氏涂片细胞学检查。如果发现阳性，ASC-US 4个月后或LSIL 7个月后再次进行细胞学检查。
近期，一些欧洲国家(荷兰、比利时)计划放弃细胞学筛查，而HPV筛查被认为在检测宫颈癌前病变和癌变方面比细胞学更敏感(＞90％)。HPV检测的特异性稍低，因此需要使用分流检测来避免过度使用阴道镜检。迄今为止最好的评估程序是细胞学筛查。然而，专门识别有病变进展风险的患者的其他分类测试可能在该筛查策略中占有一席之地。
HPV基因组的整合/病毒整合，肿瘤进展中的一个主要事件。HR-HPV感染被认为是宫颈癌的主要原因(zur Hausen 2002)。然而，大多数感染会被免疫系统自发清除，而有些感染会持续数年，有时会发展为癌(Crosbie、Einstein等人，2013年)。因此，HR-HPV感染是宫颈癌的必要但不充分的原因。宿主基因组中高风险HPV基因组的整合被认为是宫颈癌发展的关键事件，也是其最重要的风险因素之一(Pett and Coleman 2007)。在初始感染阶段，HPV以核游离体的形式存在；然而，将HR-HPV DNA整合到宿主基因组中是宫颈肿瘤进展的重要一步(Wentzensen，Vinokurova等人，2004年)。HR-HPV基因组在宿主细胞基因组中的整合为这些细胞提供了强大的选择优势，促进了该细胞群的克隆扩增。3个主要机制在这一过程中发挥重要作用：首先，据报道，HR-HPV基因组的整合经常并优先导致病毒E2基因的开放阅读框(ORF)中的缺失(Choo、Pan等，1987年)。E2蛋白是病毒E6/E7启动子的负调节因子。这种整合的后果之一是病毒癌蛋白E6和E7的表达失去控制，导致它们稳定的过度表达。E6和E7分别靶向p53和pRb肿瘤抑制剂，负调节它们的抗肿瘤功能(Dyson、Howley等人1989、Scheffner、Werness等人1990)。其次，HR-HPV的整合增加了源自整合病毒基因组拷贝的E6和E7病毒转录本的稳定性(von Knebel Doeberitz、Bauknecht等人1991)，从而提高了它们的表达水平和致癌性(Jeon、Allen-Hoffmann等人1995年，Jeon和Lambert 1995年)。最后，整合的病毒基因可能会激活细胞癌基因或使其整合位点附近的肿瘤抑制基因失活。例如，对于c-Myc癌基因就是这种情况，当HR-HPV整合到相邻区时，其蛋白表达增加(Wentzensen、Ridder等2002、Ferber、Thorland等2003、Peter、Rosty等2006,Hu,Zhu et alia 2015)。一项分子梳理研究表明，HR-HPV在该基因座的整合与该基因组区的强烈遗传不稳定性有关(Herrick、Conti等人2005)，有时会导致恶性进展。
病毒整合：潜在的诊断和预后标志物。从形态学的角度来看，没有什么可以区分会消退或持续的病变与会进展为浸润性癌的病变。在大多数宫颈癌中，HPV基因组是整合的，而它在低等级病变中主要呈游离形式(Klaes,Woerneret al.,1999,Hopman，Smedtsetal.2004,Wentzensen,Vinokurovaet al.2004,Vinokurova,Wentzensenet al.2008，Hu，Zhu等，2015)。虽然人们认识到在高等级癌前病变和恶性肿瘤中检测到HR-HPV整合，但越来越多的研究支持这样的观点，即HPV整合可能发生在宫颈癌变的更早阶段，在低等级病变中(Kulmala，Syrjanen等2006，Cricca，Morselli-Labate等2007，Huang，Chao等人2008，Gradissimo Oliveira，Delgado等人2013，Vega-Pena，Illades-Aguiar等人2013，Zubillaga-Guerrero，Illades-Aguiar等人2013，Marongiu，Godi等人2014，Hu，Zhu等人2015)。其中一些研究甚至证明在细胞学正常的女性中存在整合的HR-HPV DNA(Kulmala、Syrjanen等人2006、Gradissimo Oliveira、Delgado等人2013、Vega-Pena、Illades-Aguiar等人2013年、Zubillaga-Guerrero，Illades-Aguiar等人2013,Marongiu,Godi等人2014年)。一些数据还表明，早期宫颈病变向高等级病变的快速进展与HPV 16的整合密切相关，特别是与高整合的HPV16病毒载量密切相关(Peitsaro,Johansson等人2002,Vega-Pena,Illades-Aguiar等人，2013年)。此外，HPV整合似乎是癌前CIN2-3病变进展到癌阶段的危险因素(Hopman,Smedtset al.2004)。
因此，检测宿主基因组中高风险HPV基因组的整合可以提供有用的标志物来鉴定需要治疗的处于高进展风险的病变。这样就有可能减少不必要的阴道镜检次数和对自发消退的病变的过度治疗。
检测病毒的方法描述于Anderson等人，CA 2943626(2015年3月19日提交)，题为“HPV16 Antibodies as Diagnostic and Prognostic Biomarkers in Pre-Invasive andInvasive Disease”；Lebofsky and Bensimon,Briefings in Functional Genomics andProteomics，vo.1No.4.385-396(January 2003)，题为“Single DNA molecule analysis:Applications of Molecular Combing”；Raybould，et alia,Journal of VirologicalMethods 206(2014)51-54,entitled HPV integration Detection in CaSki and SiHausing detection of Integrated papillomavirus sequences and restriction-sitePCR”；Meoiger,et alia,EP 3106524 A1(2013年10月14日提交)，题为“PRDM14 andFAM19A4,Molecular Diagnostic Markers for HPV-induced Invasive Cancers andTheir High-Grade Precursor Lesions”；Peitsaro,et alia,J.Clinical Microbiology,March 2002,p.886-891,entitled Integrated Human Papillomavirus Type 16 isFrequently Found in Cervical Cancer Precursors as Demonstrated by a NovelQuantitative Real-Time PCR Technique”；Jansen-Durr,et alia,US 2016/0237143 A1(2016年1月6日提交)，题为“Anti-HPV E7Antibodies”；Luft,et alia,Int.J.Cancer 92,9-17(2001)，题为“Detection of Integrated Papillomavirus Sequences by Ligation-Mediated PCR(DIPS-PCR)and Molecular Characterization in Cervical CancerCells”；Hu,et alia,Nature Genetics，2015年1月12日在线发表；doi:10.1038/ng.3178，题为“Genome-wide profiling of HPV integration in cervical cancer identifiesclustered genomic hot spots and a potential microhomology-mediatedintegration mechanism”；及Lee,et alia,US 2016/0376662 A1(2015年12月5日提交)，题为“Improved Cervical Cancer Diagnosing Method and Diagnostic Kit for Same”。
分子梳理程序和Genomic Morse Code程序由上述交叉引用的申请(2018年5月11日提交的WO2018/207022，2015年3月4日提交的US 2016/0047006 A1，2006年9月7日提交的美国专利No.7,985,542 B2，2007年9月5日提交的美国专利No.8,586,723 B2)。
由于其缓慢进展，宫颈癌可以通过对其之前的癌前病变进行筛查和治疗来预防。这种筛查目前在欧洲国家基于宫颈(Pap)涂片的细胞学检查进行。国家指南针对每种类型的异常指定了需要进行阴道镜检以获取活组织检查样品以完成诊断过程的情况。细胞基因组中高风险HPV基因组的整合被认为是宫颈癌发展的关键事件，也是其最重要的危险因素之一。在大多数宫颈癌中，HPV基因组是整合的，而在低等级病变中主要以游离形式存在。其他数据也表明早期宫颈病变向高等级病变的快速进展与HPV的整合密切相关。因此，检测细胞基因组中高风险HPV基因组的整合可能为鉴定高等级病变或处于高进展风险的病变提供有用的标记。这将有可能减少不必要的阴道镜检次数，避免对自发消退的病变进行过度治疗，并更好地瞄准需要治疗的病变。鉴于与宫颈癌相关的发病率以及对诊断、监测和预测HPV相关疾病的敏感和特异方式的未满足需求，发明人研究了分子梳理技术的应用。现在已经获得了这些分子梳理研究的结果，并以开发早期诊断或预后测试的新目标来研究更高通量的程序，该测试专门测量病毒整合的水平。
先前技术的主要限制之一是它们不能区分病毒的游离和整合型。这是一个显著的缺点，因为病毒核酸以游离的游离形式存在，而病毒核酸作为整合到宿主细胞染色体中的DNA的存在会产生不同的生物学效应，例如，整合到宿主基因组DNA中的病毒可以中断基因存在于宿主基因组DNA中，导致由中断基因控制的细胞过程中断，例如导致或与癌相关的过程。
鉴于这些技术问题和现有方法的局限性，本发明人寻求开发一种新方法来特异性检测和定量已经整合到宿主细胞或宿主细胞的基因组DNA中的病毒DNA。如本文所示，这些方法可以将病毒整合(例如HPV整合)的水平与细胞功能破坏的严重程度和结果(例如与HPVDNA整合到宿主基因组中相关的病变的严重程度)相关联，并预测或预测病毒感染的特定结果的风险。发明人还寻求开发一种可以在病毒整合的非常早期阶段检测到的测试，例如，帮助诊断和预测HPV感染，该感染后来可能与宫颈癌或更恶性形式的宫颈癌相关或进展。
本发明人现在已经开发出能够定量宿主基因组中例如人类基因组DNA中的HPV或HIV整合的优良方法，以及包括覆盖宿主基因序列的生物标志物的多核苷酸组合物，所述宿主基因序列已通过整合病毒基因组(例如HPV或HIV基因组以及整合病毒的部分基因组)而被破坏。
【发明概述】
本发明涉及病毒整合核酸的检测和定量，因此涉及携带这种整合病毒基因组的储库细胞的检测和追踪。本发明的一个方面涉及检测整合的病毒DNA的水平的方法，该方法包括从细胞样品中的基因组DNA中除去游离病毒或载体核酸，并通过扩增DNA样品中的整合区的方法定量病毒DNA整合到细胞基因组DNA中的整合数；从而检测来自细胞样品(例如含有HPV病毒和DNA的生物样品)的基因组DNA中整合的病毒DNA的水平。该方法提供了一种通过减少或消除游离核酸序列来检测整合病毒DNA数的优越方法，例如游离HPV DNA。该方法还可以包括检测至少一种生物标志物，所述生物标志物覆盖被破坏的宿主基因和整合的HPVDNA的至少一部分之间的连接处。发明人鉴定的新型生物标志物包括：MAPK10(Gene ID：5602)、PTPN13(Gene ID：5783)、NUDT15(Gene ID：55270)、MED4(Gene ID：29079)、ITM2B(Gene ID：9445)、RB1(Gene ID：5925)、LPAR6(Gene ID：10161)、RAB11A(Gene ID：8766)、RPL13A(Gene ID：23521)、ZNF341(Gene ID：84905)、OFD1(Gene ID：8481)、DHRS3(Gene ID：9249)、TBC1D22B(Gene ID：55633)、AFF3(Gene ID：3899)、CXCL6(Gene ID：6372)、PF4V1(Gene ID：5197)、IMMP2L(Gene ID：83943)、MMP12(Gene ID：4321)、WDR20(Gene ID：91833)、ALDHA1A(Gene ID：216)、TPRG1(Gene ID：285386)、TUBD1(Gene ID：51174)、MAST4(Gene ID：375449)、LOC100132167,NFIX(Gene ID：4784)、CCAT1(Gene ID：100507056)、GPR137B(Gene ID：7107)、RAB22A(Gene ID：57403)、C9orf3,MACROD2(Gene ID：140733)、DACH1(Gene ID：1602)、ATP10A(Gene ID：57194)、SPG11(Gene ID：80208)、SORD(Gene ID：6652)、COL4A4(Gene ID：1286)、GATSL1(Gene ID：729438)、GATSL2(Gene ID：729438)、MAP2(Gene ID：4133)、EPN1(Gene ID：29924)、ATXN3L(Gene ID：92552)、EGFL6(Gene ID：25975)和MAGI2(Gene ID：9863)。
这些生物标志物包括具有优选范围为50bp至10kb的人类序列的多核苷酸和具有范围为50bp至10kb的病毒序列例如HPV或HIV序列的多核苷酸。这些生物标志物可用于评估与病毒感染宿主细胞相关的风险、诊断和预后疾病、病症和病症的方法，例如，这些生物标志物序列可用作探针，用于检测基因组DNA中整合的病毒DNA一个宿主细胞。为了用作探针，这些生物标志物是可检测的并且因此可以被标记，例如被标记以呈现荧光(荧光探针)。这些生物标志物可配制成包含试剂和其他可用于检测病毒整合的供应品和/或设备的试剂盒。这种试剂盒还可以包括对照试剂，以便可以对受感染细胞或细胞样品中的病毒整合水平进行受控比较。
本发明包括允许基于分子梳理研究和生物标志物发现的结果对整合到宿主基因组中的HPV或HIV病毒进行早期和高通量测量的技术。这些技术可扩展到在宿主细胞中表现出游离和整合形式的病毒DNA的任何其他病毒感染。
【附图简述】
本申请文件包含至少一幅以彩色执行的图。专利局将根据要求并支付必要的费用，提供带有彩色附图的本专利申请出版物的副本。
图1.整合是/否A-中期分析：B-最终横截面分析：与正常组相比的高等级(HG)(p＝0.0006)；与正常组相比低等级(LG)+HG(p＝0.0012)。
图2.显示了与正常组(p＝0.0001)相比，高等级(HG)中的整合数/基因组数。中期分析。
图3.最终横截面分析的组织学组中每个基因组的整合位点数。
图4.分子梳理分析样品说明。
图5.分子梳理的物理原理。YOYO-1染色的DNA分子的示例，以不同密度梳理，在荧光显微镜下以40倍放大率显示。
图6.研究设计图。
图7.3个探针的HPV 18基因组覆盖：一个覆盖包含基因L1和L2的区，第二个覆盖病毒基因E1和E2，以及第3个覆盖病毒癌基因E6和E7。其他13种基因型(HPV 16、31、33、45、35、39、51、52、56、58、59、66和68)的探针在同一模型上绘制。对应于区L1L2和E1E2的探针以蓝色显示，对应于区E6E7的探针以青色显示。
图8A.与HPV 16基因组的单次整合相对应的信号示例。图8A-8D举例说明了对应于整合的HPV基因组和参考信号的信号。
图8B.对应于4个整合位点的4个信号示例，每个都包含并列的HPV 16基因组的整合数。对应于探针E6E7的青色信号可以直观地计算每个整合位点的整合HPV基因组数。
图8C.对应于3个整合位点的3个信号示例，每个包含由宿主DNA隔开的分散的HPV18基因组的整合数。
图8D.由覆盖已知尺寸的确定DNA位点的探针产生的参考信号示例。
图9.在载玻片上检测到的信号类型图。
图10A和10B.将HPV16病毒基因组整合到OFD1基因中的示例。
【发明详述】
HPV是指人乳头瘤病毒。人乳头瘤病毒(HPV)是一组在世界范围内极为常见的病毒。HPV有100多种类型，其中至少有14种是致癌的(也称为高风险型)。2种HPV类型(16和18)导致70％的宫颈癌和癌前病变。许多国家已批准使用针对HPV 16和18的疫苗。
HPV DNA包括HPV基因组的多核苷酸、HPV基因组的单个基因以及HPV基因组或基因的片段，例如被HPV多核苷酸序列的探针识别的多核苷酸片段。
对照受试者或患者。本领域技术人员知道受控比较的价值。对照受试者或患者包括未暴露于HPV、没有HPV感染的症状或迹象、没有或具有较低的HPV抗体滴度、对HPV表现出较低的细胞反应、或表现出相比被评估的患者较少或没有HPV DNA整合到基因组DNA中的受试者。阳性对照患者或受试者包括已知在其基因组DNA中整合了HPV DNA、表现出HPV感染症状和/或患有HPV相关癌或病症例如本文所述的那些癌或病症的那些。
分子梳理具有其常规含义，如本文引用的现有技术的申请、出版物和其他文件中所述，并通过引用并入本文。分子梳理作为拉伸核酸的步骤进行，从任何来源提取以评估为提供线性和平行链(对齐核酸)中固定化核酸的样品。因此，分子梳理优选以形成在适当表面(例如，表面处理的载玻片)上的受控拉伸因子(例如使用弯液面)进行。拉伸后，可以杂交可通过例如荧光显微镜检测的序列特异性探针(Lebofsky、Heilig等人2006)。因此，特定的核酸序列可以在单个分子水平上直接显现。探针的荧光信号的长度和/或其数，和/或它们在载玻片上的间距提供了对探针尺寸和相对间距的直接读数。下面描述了一些目前用于检测HPV整合的技术。特别地，应用于样品的分子梳理可以包括以下步骤：在第一步中，从生物样本(血液、涂片等)中提取非常高分子量的DNA。提取后，DNA分子被“梳理”，即通过其末端连接到涂有硅烷的载玻片，并通过后退的空气-水界面均匀拉伸(Bensimon 1994)。
一旦它们以这种配置不可逆地固定到玻璃基底上，DNA分子就与一组对目标DNA序列特异的荧光探针杂交，以获得该DNA区的特异性荧光特征。此外，可以使用参考区的探针，以便根据盖玻片上梳理的细胞基因组数对结果进行归一化。只有整合到细胞基因组中的病毒形式才会被梳理和分析。环状游离不被分析，因为它们没有可供梳理的游离DNA末端。
杂交后，将载玻片置于扫描仪中，以便通过落射荧光显微术获得对应于载玻片所有视场的图像。使用由Genomic Vision开发并以Fibervision 2016商标为其他应用程序商业化的特定软件，可以在数千个视野中识别包含荧光信号的盖玻片上的目标区并测量这些区的尺寸不同的信号。由于存在恒定的拉伸因子(例如2Kb/μm的因子)，这最后一步成为可能，该因子通过直接测量探针及其间距来保证所研究区内的物理距离的确定。
这种方法可用于研究病毒整合(i)具有大约一千碱基(kb)的高分辨率，包括串联整合，(ii)直接没有遗传材料的初始扩增，因此没有相关的选择偏倚选择引物(iii)独立于病毒转录，以及(iv)以可定量和客观的方式。
用于诊断HR-HPV感染(检测HPV DNA或E6E7 mRNA)和基因分型的常规技术使得证明持续感染或评估多重感染的存在和估计类型的具体流行率成为可能。然而，他们给出了致癌过程的间接图片，因为没有人可以描述细胞基因组中HR-HPV DNA的基因组整合，并且没有人能够具体定量宿主基因组中整合的HPV病毒的数(HPV整合形式或DNA)。检测HR-HPV整合的技术目前仅用于研究目的，在此应用中都有局限性。对早期诊断和/或预后测试(试剂盒)存在真正未满足的需求，它允许在患者管理的早期阶段跟踪和定量HPV整合形式。
HR-HPV的整合可以通过原位杂交(ISH)或荧光原位杂交(FISH)在细胞中直接检测，常用于细胞遗传学。整合型和游离型可以通过弥漫性(游离型)或点状(整合型)信号模式来区分。这些模式的解释部分是主观的，因此在操作员之间产生结果的可变性。此外，由于凝聚DNA分子的空间位阻，这些技术的分辨率被限制在1-5Mb(兆碱基)，并且不允许对这种整合进行精细分析(Lebofsky和Bensimon 2003)。Southern印迹也用于分析HR-HPV的整合。虽然这种方法相对可靠，但操作繁琐，而且放射性标记探针的使用对操作者的安全有影响。也可以通过检测病毒-细胞融合转录物来分析整合，就像使用乳头瘤病毒致癌基因转录物(APOT)技术扩增的情况一样(Klaes，Woerner et alia 1999)。然而，该方法需要提取和扩增比DNA稳定性差得多的mRNA。此外，它引入了偏差，因为它仅检测具有转录活性的HPVDNA，并且已经表明，在CaSki细胞系中，它具有大量串联整合的基因组，似乎很少被主动转录(Van Tine、Knops等2001,Ziegert,Wentzensenet al.2003)。另一种技术也是基于人类和病毒序列融合的检测，但在DNA水平上：DIPS(综合乳头瘤病毒序列检测)(Luft，Klaesetal.2001)。然而，当存在高浓度的游离形式和串联整合时，该方法在检测整合方面缺乏敏感性而受到限制(Raybould、Fiander等人，2014年)。实时PCR技术也有这些相同的局限性。该方法确定病毒E2基因和病毒癌基因E6的拷贝数之间的比率(Peitsaro、Johansson等人2002)。它基于这样一个事实，即当整合HPV基因组时，在绝大多数情况下E2被删除，而E6则是保守的。然而，最近的研究表明，整合过程中的切割可能发生在HPV基因组的任何位点，包括E6，主要发生在E1(Hu、Zhu等人，2015年)。因此，该技术无法检测到所有由E2外缺失引起的整合以及所有保留完整HPV基因组的串联整合形式。最后，基于高通量(新一代)测序(NGS)的HIVID技术(高通量病毒整合检测)结合读取的计算机分析，使得精确定位HPV整合位点成为可能(胡，2015.1)。然而，这种技术繁琐复杂，不能用于确定在一个基因座上整合的拷贝数。
所有这些技术已被用于增加我们对HPV整合在癌前病变和宫颈癌中的作用的理解。这些技术的多样性及其局限性解释了在该领域获得的数据之间的可变性和有时差异，因为这些技术中的大多数不能提供对整合位点的无偏、灵敏和高分辨率的分析。基于从生物样品中除去游离DNA的本发明的其他实施方式包括以下。
实施方式1.检测整合的病毒DNA的水平的方法，其包括：
从细胞样品中的基因组DNA中除去游离病毒或载体核酸，及
通过扩增DNA样品中整合区的方法，定量病毒DNA整合到细胞基因组DNA中的整合数；从而
检测来自细胞样品的基因组DNA中整合的病毒DNA的水平；及任选地
对从样品中取出的游离核酸进行扩增的方法。
上述实施方式中描述的方法和本文中描述的其他方法可用于除去基于样品中游离体总数高达95％的游离体，例如，它可以除去样品中10、20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或99％以上的游离体。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种方法可以组合使用以除去游离体。优选地，不超过5％的游离核酸保留在进行整合的病毒DNA定量的基因组DNA样品中。该方法还允许通过使用PCR或其他扩增方法定量每种DNA来定量整合的病毒DNA和游离DNA或核酸。实施方式1所涵盖的方法可适用于或适用于人类以及非人类，例如易受整合型病毒或游离型病毒感染的家畜哺乳动物。
在这个和类似的实施方式中，该方法可用于对个体或个体组的基因组DNA进行数据挖掘，以定量掺入基因组中的休眠病毒或其他外源DNA的量，例如内源逆转录病毒插入(ERV)或逆转录病毒原病毒，并将休眠的整合DNA与携带相同或相似DNA或RNA的游离体区分开来。本发明的这个方面是可以评估和定量病毒库的一种方式。
实施方式2.根据实施方式1所述的方法，其中所述扩增方法是定量聚合酶链反应(qPCR)、荧光原位杂交(FISH)或分子梳理。
实施方式3.根据实施方式1或2所述的方法，其中所述除去包括：
通过将细胞暴露于提取盐溶液一段时间并在足以使细胞膜对来自细胞的游离病毒或载体核酸可渗透，并使游离病毒或载体核酸从细胞中泄漏到培养基中的条件下，使细胞样品中的细胞膜渗透化酸，
将渗透化的细胞与培养基中的游离或载体核酸分离，及
对分离的渗透化的细胞进行qPCR；及任选地
分离并在培养基中的游离或载体核酸上进行qPCR。使膜具有可渗透性的方法是本领域已知的，例如由Moen，WO 2006/096727 A2描述的那些，其通过引用并入本文。
实施方式4.根据实施方式1～3之任一项所述的方法，其中所述除去包括：
将细胞包埋到琼脂糖浓度范围为约0.5wt％～1.5wt％的琼脂糖塞中，
在足以充分消化细胞蛋白的时间和条件下，向含有包埋细胞的塞注入蛋白水解酶，
在足以除去游离核酸的时间和条件下洗涤塞，
提取塞中捕获的细胞基因组DNA，及
对从洗涤过的琼脂糖塞中提取的基因组DNA进行qPCR。
对分离的渗透化的细胞进行qPCR；及任选地
对从琼脂糖塞中洗出的核酸进行分离并进行qPCR。将核酸包埋在琼脂糖中的方法是本领域已知的，并通过引用将Fritz and Musich,,Biotechniques.1990 November；9(5):542，544，546-50并入本文。
实施方式5.根据实施方式1～4之任一项所述的方法，其包括通过生物素化游离核酸并将它们与(链霉)亲和素结合来部分除去游离HPV核酸，从而从基因组和游离核酸的混合物中除去它们。在该方法中，由于生物素化寡核苷酸靶向HPV基因组的E2序列，因此可以部分除去游离HPV。单拷贝HPV整合导致E1和E2开放阅读框的破坏(Peitsaro et alia,2002,J.Clin.Microbiology；Vernon et alia，1997,Int.J.Cancer；Jeon and Lambert,1995,Proc.Natl.Acad.Sci USA)。在HPV基因组的头尾串联重复整合中，当内部拷贝保持完整的E1和E2开放阅读框时，只有位于细胞DNA侧翼的病毒拷贝在E1或E2区被破坏。使用提议的流程，游离HPV被从细胞基因组DNA中丢弃，这要归功于它在链霉亲和素包被的珠子上的捕获。
实施方式6.根据实施方式1～5之任一项所述的方法，其包括：
使用质粒纯化柱从细胞样品中分离核酸，
从自质粒纯化柱洗脱的材料中回收基因组DNA，及
对回收的基因组DNA进行qPCR；及任选地，
分离与质粒纯化柱结合的物质并进行qPCR。
使用分离柱分离游离或质粒DNA在本领域中是已知的，并通过引用并入，可参考Moller et alia,2014,Proc.Natl.Acad.Sci USA；Moller,et alia,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America.112(24),E3114-E3122,(2015)及Moller et alia,Genome-wide Purification of ExtrachromosomalCircular DNA from Eukaryotic Cells.J.Vis.Exp.(110)，e54239，doi:10.3791/54239(2016)。
质粒分离柱是可商购的，例如从Promega获得，此类柱及其使用方法通过引用并入
https://www.promega.com/-/medium/files/resources/paguide/letter/chap9.pdf？la＝en(最后访问时间为2018年11月30日，以引用方式并入。
从质粒或游离体DNA分离基因组DNA的其他模式也通过引用以上链接并入。
实施方式7.根据实施方式1～6之任一项所述的方法，其中所述细胞样品含有病毒DNA。
实施方式8.根据实施方式1～7之任一项所述的方法，其中所述细胞样品含有HIV核酸。
实施方式9.根据实施方式1～7之任一项所述的方法，其中所述细胞样品含有人乳头瘤病毒(HPV)核酸。
实施方式10.根据实施方式9所述的方法，其还包括通过PCR，尤其是通过qPCR检测编码HPV E2 ORF的DNA与编码HPV E6 ORF的DNA的比率；其中所述编码E2 ORF的DNA与编码E6 ORF的DNA的比率代表与整合形式相关的游离形式的量。
E2/E6比率的测量需要定量方法而不是终点PCR。采用实时(定量)PCR，并且可以使用其他定量方法，例如与Genomic Morse Code杂交相关的分子梳理，如美国专利号8,586,723和美国专利号9,133,514所述并通过引用并入，或通过荧光原位杂交(FISH)。在这些方法中，定量是通过特定探针荧光的相对测量来进行的。
实施方式11.根据实施方式10所述的方法，其中所述E2 ORF与E6 ORF的比率通过实时PCR使用表1所述的一组引物和探针针对每个HPV基因型16、18、33和/或58确定。
实施方式12.根据实施方式9～11之任一项所述的方法，其还包括确定HPV病毒载量，包括确定E6/E7与β珠蛋白、MSH2或至少一种其他人基因靶标之间的比率。
实施方式13.根据实施方式9～12之任一项所述的方法，其还包括检测至少一种生物标志物，所述生物标志物覆盖被破坏的宿主基因和整合的HPV DNA的至少一部分之间的连接处。本发明方法中使用的生物标志物是杂交或嵌合的人病毒(例如人HPV)核酸序列，通常是DNA或修饰的DNA序列。生物标志物包括约50bp至约10kb的人类序列，其与约0.5至10kb的病毒序列相连。人类成分的示例性长度范围为约50、100、200、500、1,000(1kb)、2,000(2kb)、5,000(5kb)至10,000(10kb)bp以及任何中间长度。人类成分的示例性长度范围为约50、100、200、500、1,000(1kb)、2,000(2kb)、5,000(5kb)至10,000(10kb)bp以及任何中间长度。病毒组分的示例性长度范围为约50、100、200、500、1,000(1kb)、2,000(2kb)、5,000(5kb)至10,000(10kb)bp以及任何中间长度。生物标志物可以通过PCR产生或扩增或通过本领域已知的其他方法例如通过化学合成或通过重组DNA技术产生。特别地，适合根据本发明使用的生物标志物是杂合或嵌合的人病毒核酸序列，其中病毒序列来自HPV，尤其来自HPV的E6 ORF，尤其来自E6 ORF，例如HPV的E6 ORF选自HPV16、HPV18、HPV33和HPV58的组。可以标记生物标志物以便可检测。
实施方式14.根据实施方式9～13之任一项所述的方法，其还包括检测选自下列的至少一种生物标志物：MAPK10(Gene ID：5602)、PTPN13(Gene ID：5783)、NUDT15(Gene ID：55270)、MED4(Gene ID：29079)、ITM2B(Gene ID：9445)、RB1(Gene ID：5925)、LPAR6(GeneID：10161)、RAB11A(Gene ID：8766)、RPL13A(Gene ID：23521)、ZNF341(Gene ID：84905)、OFD1(Gene ID：8481)、DHRS3(Gene ID：9249)、TBC1D22B(Gene ID：55633)、AFF3(Gene ID：3899)、CXCL6(Gene ID：6372)、PF4V1(Gene ID：5197)、IMMP2L(Gene ID：83943)、MMP12(Gene ID：4321)、WDR20(Gene ID：91833)、ALDHA1A(Gene ID：216)、TPRG1(Gene ID：285386)、TUBD1(Gene ID：51174)、MAST4(Gene ID：375449)、LOC100132167,NFIX(Gene ID：4784)、CCAT1(Gene ID：100507056)、GPR137B(Gene ID：7107)、RAB22A(Gene ID：57403)、C9orf3，MACROD2(Gene ID：140733)、DACH1(Gene ID：1602)、ATP10A(Gene ID：57194)、SPG11(Gene ID：80208)、SORD(Gene ID：6652)、COL4A4(Gene ID：1286)、GATSL1(Gene ID：729438)、GATSL2(Gene ID：729438)、MAP2(Gene ID：4133)、EPN1(Gene ID：29924)、ATXN3L(Gene ID：92552)、EGFL6(Gene ID：25975)和MAGI2(Gene ID：9863)。
这些生物标志物是发明人基于公开的HPV整合位点鉴定的新标志物；参见Holmes，et alia，2016，Genomic Medicine,Mechanistic signatures of HPV insertions incervical carcinomas(npj Genomic Medicine(2016)1，16004；doi:10.1038/npjgenmed.2016，以引用方式并入)。
本发明人将位于由于病毒整合而被破坏的基因中的引物与整合的HPV中的引物组合。Holmes出版物的表1显示了所有这些侧翼基因的染色体基因座和断点，如下所示。
【表1：72例宫颈癌病例的临床和基因组状态】
生物标志物可以通过多种方法检测，包括分子梳理和qPCR。本领域技术人员可以基于该表中的信息(包括年龄、疾病的临床分期、肿瘤尺寸、HPV类型、基因组捕获/HPV NGS状态，基因注释和CGH阵列)，选择合适的生物标志物或生物标志物组用于本发明的方法中。
实施方式15.根据实施方式13或14的方法，其中特异性扩增宿主基因组DNA和整合的HPV DNA之间的整合连接处的正向和反向寡核苷酸引物用于产生生物标志物。
实施方式16.根据实施方式13所述的方法，其中所述生物标志物是人OFD1(NG_008872.1)并且产生并且使用表2所述的正向和反向引物扩增作为生物标志物的OFD1基因/HPV16和HPV16/OFD1基因连接处。因此产生的生物标志物如图10所示，用于OFD1基因和HPV16基因组序列的连接处，特别是具有SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44序列的生物标志物。
实施方式17.根据实施方式13～16之任一项所述的方法，与宿主基因组DNA和整合的HPV DNA之间的整合连接处互补的至少一种特定核酸序列用于通过生物标志物的杂交进行检测。
实施方式18.根据实施方式13～17之任一项所述的方法，其中所述HPV DNA选自HPV株16、18、21、33、45、52和58的DNA。
实施方式19.包含一种或多种生物标志物的组合物。
实施方式20.根据实施方式19所述的组合物，其中所述一种或多种生物标志物选自：MAPK10、PTPN13、NUDT15、MED4、ITM2B、RB1、LPAR6、RAB11A、RPL13A、ZNF341、OFD1、DHRS3、TBC1D22B、AFF3、CXCL6、PF4V1、IMMP2L、MMP12、WDR20、ALDHA1A、TPRG1、TUBD1、MAST4、LOC100132167、NFIX、CCAT1、GPR137B、RAB22A、C9orf3、MACROD2、DACH1、ATP10A、SPG11、SORD、COL4A4、GATSL1、GATSL2、MAP2、EPN1、ATXN3L、EGFL6和MAGI2。与实施方式20相关的实施方式包括包含实施方式20所述的生物标志物的载体和DNA构建体以及含有杂合或嵌合序列的载体，所述杂合或嵌合序列包含完整病毒基因组的全部或部分、被破坏的人(或哺乳动物)基因序列的一部分。这些载体或其组分可以用作检测整合到核酸(例如，染色体或基因组DNA)中的DNA的探针，如实施方式1和从属于实施方式1的后续实施方式所述。
在一些实施方式中，DNA，例如本文所述的引物或探针DNA，将被修饰并与处于天然状态的DNA分子区分开来。在本发明的一些实施方式中，PCR或其他基于引物或探针的核酸检测技术可以用修饰的探针或引物进行，例如用报告荧光团和/或猝灭剂分子标记的探针或引物。此类报道子和猝灭剂是本领域已知的，参见例如http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/introduction-pcr-primer-probe-chemistries？ID＝LUSOJW3Q3(通过引用并入，上次访问时间为2018年10月30日)。
引物或探针修饰包括但不限于寡核苷酸中的取代：用2-氨基嘌呤取代dA；用2,6-二氨基嘌呤取代dA；用脱氧尿苷(dU)取代dT；用5-甲基dC取代dC，以将Tm提高0.5℃；用羟甲基dC取代dC；或用脱氧肌苷或5-硝基吲哚作为“通用碱基”取代寡核苷酸引物中的dA、dC、dG或dT之任何。其他修饰包括对于引物中的一个或多个核苷酸掺入或取代5-羟基丁炔基-2'-脱氧尿苷，它是一种双链稳定修饰碱基；掺入或取代8-氮杂-7-脱氮杂鸟苷以消除与富含鸟嘌呤的序列相关的天然存在的非Watson-和-Crick二级结构；锁核酸碱基的核糖骨架的修饰，将碱基锁定到C3'-内位置。其他修饰包括在寡核苷酸的3'-末端掺入反向dT，以抑制3'外切核酸酶的降解或DNA聚合酶的延伸；在序列的5'末端掺入反向双脱氧-T以防止不需要的5'连接，或掺入双脱氧-C作为3'链终止子。其他修改通过参考https://www.idtdna.com/site/Catalog/Modifications/Category/7(最后访问时间为2018年11月7日)或通过参考https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/oligonucleotide s-primers-probes-genes/custom-dna-oligo/oligo-configuration-options.html#5prime(最后访问时间为2018年11月30日)并入本文。这些修饰中的1个、2个、3个或更多个可以并入本文公开的寡核苷酸引物、探针或其他核酸序列中。核酸也可以通过添加修饰碱基来修饰，例如在5'或3'末端添加上述碱基。
实施方式21.试剂盒，其包含与宿主细胞DNA和整合的病毒DNA序列杂交的标准化和纯化的生物标志物，以及任选的对照试剂、一种或多种其他试剂、供应品和/或用于检测病毒整合的设备。
实施方式22.从细胞样品中制备含有疑似整合病毒DNA的基因组DNA的方法，其包括：
将细胞包埋到琼脂糖塞中，琼脂糖浓度范围为约0.5wt％～1.5wt％，
在足以充分消化细胞蛋白的时间和条件下，向含有包埋细胞的塞注入蛋白水解酶，
在足以除去游离核酸的时间和条件下洗涤塞，
提取在包含或不包含整合病毒DNA的栓中捕获的细胞基因组DNA。
实施方式23.用于评估患或发展为宫颈癌的风险的方法，其包括：检测或定量从患者或受试者获得的基因组DNA样品中HPV DNA整合的数或HPV DNA的整合模式，从而评估患或发展宫颈癌的风险，其中所述基因组DNA样品是通过实施方式1或从属实施方式的方法获得的。
实施方式24.根据实施方式23所述的方法，其中与具有较少实例或较少量整合的HPV DNA的患者或受试者相比，更多的实例或更多的整合的HPV DNA指示患或发展癌的高风险，或者指示更具侵袭性或更高等级的癌。
实施方式25.根据实施方式23或24的方法，其中与对照受试者或患者中的那些相比，HPV DNA整合到基因组宿主DNA中的不同模式指示患或发展癌的高风险，或者是表明更具侵袭性或更高等级的癌。
实施方式26.根据实施方式23、24或25所述的方法，其包括评估患宫颈癌的风险。
实施方式27.根据实施方式23～25之任一项所述的方法，其包括评估发展宫颈癌的风险。
实施方式28.根据实施方式23～25之任一项所述的方法，其中所述HPV DNA来自HPV的高风险或致病性株。
实施方式29.根据实施方式23～28之任一项所述的方法，其中所述HPV DNA来自选自HPV株16、18、21、33、45、52和58的高风险或致病性HPV株。
实施方式30.根据实施方式23～28之任一项所述的方法，其中所述HPV来自HPV的低风险或非致病性株。
实施方式31.根据实施方式23～28之任一项所述的方法，其中所述HPV来自低风险或非致病性HPV株，其致病性低于HPV株16、18、21、33，45、52和58中的任一种。
实施方式32.根据实施方式23～31之任一项所述的方法，其还包括通过与未感染HPV或未感染HPV致病性株，没有HPV感染的病变或其他症状，或对HPV或特定HPV株基本上没有抗体滴度或细胞免疫的患者或受试者进行比较来检测或定量HPV DNA的整合数。
实施方式33.根据实施方式23～32之任一项所述的方法，其还包括通过与从同一患者或受试者获得的较早生物样品中的那些进行比较来检测或定量HPV DNA的整合数。
实施方式34.根据实施方式23～33之任一项所述的方法，其中使用结合HPV DNA序列的探针，使用基因组宿主DNA的分子梳理进行所述检测或定量整合数。
实施方式35.根据实施方式23～34之任一项所述的方法，其中使用针对HPV 16、18、31、33、45、35、39、51、52、56、58、59、66和68的探针，使用基因组宿主DNA的分子梳理进行所述检测或定量整合数。
实施方式36.根据实施方式23～35之任一项所述的方法，其中使用结合或覆盖HPVDNA L1和L2、E1和E2和/或E6和E7序列的探针，使用基因组宿主DNA的分子梳理进行所述检测或定量整合数，其中所述探针可以用相同的不同颜色的荧光标签标记。
实施方式37.根据实施方式23～36之任一项所述的方法，其中所述患者或受试者具有宫颈发育不良或具有阳性PAP测试。
实施方式38.根据实施方式23～37之任一项所述的方法，其中所述患者或受试者已感染人免疫缺陷病毒(HIV)、被免疫抑制、出生前已暴露于己烯雌酚、或正在或已经被治疗宫颈癌前病变或宫颈癌。
实施方式39.根据实施方式23～38之任一项所述的方法，其中所述患者患有或有患肛门癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌或口咽癌的风险。
实施方式40.根据实施方式23～39之任一项所述的方法，其中所述HPV整合数或整合模式通过以下至少一项定量或与以下至少一项相关：
宿主基因组DNA中HPV整合位点数或此类整合的平均数，
HPV DNA整合到宿主基因组DNA中的尺寸(kb)，
在每个整合位点整合的HPV基因组数，
有无整合的HPV DNA，
每个细胞基因组中HPV整合位点数，
宿主细胞中HPV整合位点的平均数，
每个整合位点整合的HPV基因组的平均数(或整合位点的平均尺寸)，
每个整合位点整合的HPV基因组的最大数(或整合位点的最大尺寸)，
每个整合位点整合的HPV基因组的最小数(或整合位点的最小尺寸)，或
每个细胞基因组中整合的HPV基因组数。
实施方式41.根据实施方式23～40之任一项所述的方法，其中所述HPV整合数或整合模式与损伤状态的至少一个参数相关，包括：
正常组织学(包括没有上皮内病变或病毒感染迹象的所有异常，如化生、宫颈炎、蜕膜病变或腺病)，
低等级(LG)病变，对应于原CIN1，
高等级(HG)病变，对应于前CIN2、3和CIS(原位癌)或AIS(原位腺癌)；
正常宫颈，
1级非典型转化(AT)，
2级非典型转化(AT)，
TAG2 a，如果没有重大迹象，
TAG2 b，如果有重大迹象，
TAG2 c，当出现提示浸润性癌时；和/或
非典型转化(次要或主要)。
实施方式42.根据实施方式23～41之任一项所述的方法，其中所述HPV整合数或整合模式与细胞学分类的至少一个参数相关，包括：
上皮内病变或恶性肿瘤阴性，
异常鳞状细胞，
典型鳞状细胞(ASC)，
意义不明(ASC-US)，
不能排除高等级鳞状上皮内病变(ASC-H)，
低等级鳞状上皮内病变(LSIL)，
高等级鳞状上皮内病变(HSIL)，
鳞状细胞癌，
异常腺细胞，
非典型腺细胞(AGC)：宫颈内(未另外指明(NOS)或评论)，
子宫内膜或未另行说明，
非典型腺细胞，有利于肿瘤：宫颈内或未另行说明，
宫颈内原位腺癌(AIS)，和/或
腺癌。
本发明的其他实施方式包括将实施方式1和本文描述的其他实施方式的方法扩展到可以产生游离病毒游离DNA或通过自由游离和基因组整合形式感染细胞的其它病毒。此类病毒包括疱疹病毒(例如爱泼斯坦-巴尔病毒[EBV]、人类疱疹病毒6[HHV-6])和人免疫缺陷病毒(HIV)(参见Morissette and Flamand,2010,J.Virol.；Hamid et alia,2017，AIDSRes.Ther)。因此，本文公开的方法通常可用于在临床随访或水平诊断期间检测和定量整合病毒和检测携带此类整合病毒基因组的储库细胞。此外，本发明适用于由整合病毒(HPV或其他)引起的所有疾病的诊断和/或预后。这尤其包括在HPV感染中的头颈癌、阴道癌、外阴癌和肛门癌以及其他类型的癌、肿瘤和增殖性疾病。在一些实施方式中，本文所述的方法可适用于检测来自遗传医学程序的游离型或整合型DNA。
本文所述方法的一些方面涉及受试者或患者中HPV感染严重程度的生物标志物的鉴定，以及将这些结果转移到用于HPV诊断和/或预后用途的创新试剂盒中。该生物标志物的特征在于一种或多种高风险(HR)HPV DNA在患者或受试者的宫颈细胞基因组中的大量整合，该基因组包含多个完整基因组或其片段，其中包含至少10％的HPV基因组，对应于E6 E7DNA区的示例。它还涉及用于检测被分类为HR的HPV，例如HPV 16、18、31、33、45、35、39、51、52、56、58、59、66和68的受试者或患者基因组中的整合的方法和工具。此外，它涉及评估患或发展为宫颈癌的风险的方法，其包括检测或定量从患者或受试者获得的基因组宿主DNA中HPV DNA的整合数或HPV DNA的整合模式，从而评估患或发展为宫颈癌的风险。具体但不限于，实施方式包括以下：
一种评估患或发展为宫颈癌的风险的方法，包括检测或定量从患者或受试者获得的基因组宿主DNA中HPV DNA的整合数或HPV DNA的整合模式，从而评估发展宫颈癌的风险患有或正在发展宫颈癌。在该方法的一些实施方式中，与具有较少实例或较少量的整合HPVDNA的患者或受试者相比，更多的实例或更多的整合的HPV DNA指示患或发展癌的高风险，或者指示更具侵袭性或更高等级的癌。在该方法的其他实施方式中，与对照受试者或患者中的那些相比，HPV DNA整合到基因组宿主DNA中的不同模式指示患或发展癌的高风险，或者指示更具侵袭性或更高等级癌。此类风险包括患、发展或复发宫颈癌的风险。可以使用本文公开的方法评估来自不同来源的HPV DNA，包括来自HPV致病性株和与癌密切相关的那些。HPV株包括毒株16、18、21、31、33、45、52和58。在其他实施方式中，该方法可以用来自较低风险株(例如HJPV 6或11或其他仅与生殖器疣或轻度宫颈异常关联的株)的HPV DNA进行，。
本文公开的方法还可以包括通过与HPV感染或HPV的临床体征之前的患者、未感染HPV的受试者、未感染HPV致病性株的受试者，没有HPV感染的病变或其他症状的受试者，或对HPV或特定HPV株基本上没有抗体滴度或细胞免疫的受试者进行比较来检测或定量HPVDNA的整合数。例如，本文公开的方法可以包括检测或定量与从同一患者或受试者或关于HPV阴性或HPV-阳性对照受试者获得的较早生物样品中的整合数相比的患者中HPV DNA的整合数。
本文公开的方法中的检测或定量整合数可以使用基因组宿主DNA的分子梳理，使用结合HPV DNA序列的探针进行，例如，它可以使用基因组宿主DNA的分子梳理，使用针对HPV 16、18、31、33、45、35、39、51、52、56、58、59、66和/或68的探针进行。在一些实施方式中，使用结合或覆盖HPV DNA L1和L2、E1和E2和/或E6和E7序列的探针，使用基因组宿主DNA的分子梳理进行检测或定量整合数，其中所述探针可以用相同或不同颜色的荧光标签标记。
通过本文公开的方法评估的患者可能具有宫颈发育不良或阳性PAP测试。一些患者可能以前感染过人免疫缺陷病毒(HIV)，可能被免疫抑制，可能在出生前接触过己烯雌酚，或者可能因宫颈癌前病变或宫颈癌接受过治疗。在其他实施方式中，本文所述的方法可用于评估患肛门癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌或口咽癌的风险。
在本发明方法的一个实施方式中，HPV整合数或整合模式通过以下至少一项定量或关联：宿主基因组DNA中HPV整合位点数或此类整合的平均数；HPV DNA整合到宿主基因组DNA中的尺寸(kb)；每个整合位点整合的HPV基因组数；有无整合的HPV DNA；每个细胞基因组的HPV整合位点数；宿主细胞中HPV整合位点的平均数；每个整合位点整合的HPV基因组的平均数(或整合位点的平均尺寸)；每个整合位点整合的HPV基因组的最大数(或整合位点的最大尺寸)；每个整合位点整合的HPV基因组的最小数(或整合位点的最小尺寸)，或每个细胞基因组整合的HPV基因组数。
在本文公开的方法的其他实施方式中，HPV整合数或整合模式与病变状态的至少一个参数相关，包括：正常组织学(包括没有上皮内病变或病毒感染迹象的所有异常，例如化生、宫颈炎，蜕膜病变或腺病)；低等级(LG)病变，对应于原CIN1；高等级(HG)病变，对应于原CIN2、3和CIS(原位癌)或AIS(原位腺癌)；正常宫颈；1级非典型转化(AT)；2级非典型转化(AT)；TAG2 a，如果没有重大迹象；TAG2 b，如果有重大迹象；TAG2 c，当外观提示浸润性癌时；和/或非典型转化(次要或主要)。
在本文公开的方法的其他实施方式中，HPV整合数或整合模式与选自下列的至少一个细胞学分类的参数相关：上皮内病变或恶性肿瘤阴性；有无异常鳞状细胞；有无意义不明的典型鳞状细胞(ASC)(ASC-US)；无法排除高等级鳞状上皮内病变(ASC-H)；有无低等级鳞状上皮内病变(LSIL)；有无高等级鳞状上皮内病变(HSIL)；有无鳞状细胞癌；有无异常腺细胞；非典型腺细胞(AGC)：宫颈内(未另行说明或评论)；子宫内膜或未另行说明；非典型腺细胞，有利于肿瘤性：宫颈内膜或未另行说明，有无宫颈内原位腺癌(AIS)和/或非宫颈内膜、子宫内膜、宫外或未另行说明的腺癌。
在本发明方法的一些实施方式中，HPV整合数或整合模式与患者宫颈病变的临床结果相关，包括进展、稳定或消退。在其他情况下，HPV整合数或整合模式与病毒清除、HPV疫苗接种状态、HPV感染症状的改善或治愈或药物治疗或个性化治疗的性能评估相关。
本发明的另一方面是在将HR-HPV DNA标记的探针与怀疑含有一个或多个整合的HR-HPV基因组或其特定片段的受试者或患者的基因组DNA杂交后获得的可视化DNA模式，所述DNA包含来自正常或癌细胞的HR-HPV DNA和基因组DNA的模式。该DNA模式可能构成HR-HPV DNA，其选自基因型16、18、31、33、45、35、39、51、52、56、58、59、66或68。它也可能构成包含全部或部分E6 E7 DNA区的HR-HPV DNA。DNA模式可以作为HPV感染和整合的生物标志物。
【实施例1：分子梳理检测到的高风险HPV基因组整合与宫颈病变严重程度和/或临床结果之间的关联】
一项临床研究旨在研究通过分子梳理检测到的高风险HPV基因组的整合与宫颈抹片检查异常后有阴道镜检指征的患者宫颈病变严重程度之间的关联。对410名HPV-HR患者进行了横截面部分分析。分析中确定的整合参数和描述病变状态的病变参数如下所述。
整合模式。整合模式可由以下变量定义，其值直接由上述数据确定：(i)有无整合或(ii)每个细胞基因组的HPV整合位点数(iii)每个细胞基因组整合的E6/E7序列的数。
病变状态。阴道镜活组织检查和锥切样本的结果根据2014年发布的新WHO分类给出，包括(i)正常组织学(包括所有异常，没有上皮内病变或病毒感染迹象，如化生、宫颈炎、蜕膜病变或腺病),(ii)低等级(LG)病变，对应于原CIN1，(iii)高等级(HG)病变，对应于原CIN2、3和CIS(原位癌)，以及(iv)AIS(原位腺癌)。
如果宫颈阴道镜活组织检查的组织学数据与锥切样本的组织学数据存在差异，则将考虑最坏情况的组织学结果。“阴道镜检+，无组织学”组：描述既未进行活组织检查也未进行锥切的组。
横截面部分分析的结果。第一个数据显示，与其他组相比，正常组(细胞学异常但活组织检查正常)中HPV整合的患者百分比和每个基因组的整合数较差。例如，根据分子梳理技术，高等级组中DNA HR-HPV整合的患者比例为97.2％，而正常组中DNA HR-HPV整合的患者比例为82.5％。
如图1所示，使用带有Yates连续性校正的χ2检验，比例检验；参见Yates,F(1934).“Contingency table involving small numbers and theχ2test”.Supplement to theJournal of the Royal Statistical Society 1(2):217-235.JSTOR 2983604，通过引用并入。
如图2所示，Mann-Whitney-Wilcoxon检验用于比较从具有相同分布的总体中选出的2个独立样品中的变量；见David F.Bauer,J.Am.Statistical Assoc.67(339):687-690(1972)，通过引用并入。置信集是使用等级统计构建的。
分子梳理(MC)技术对HR-HPV整合研究的贡献。该科学计划的目标是使用敏感、无偏见和高分辨率的技术研究罕见且复杂的遗传事件，即病毒整合。上面提到的当前方法都没有完全满足这些标准。如图3描述了通过分子梳理进行的样品分析和工作流程。第一步是从生物样品(血液、涂片等)中提取分子量非常高的DNA。提取后，DNA分子被“梳理”，即通过其末端连接到涂有硅烷的载玻片，并通过后退的空气-水界面均匀拉伸(Bensimon 1994)。梳理的DNA纤维的图像如图4所示。
一旦它们以这种配置不可逆地固定到玻璃基底上，DNA分子就与一组对目标DNA序列特异的荧光探针杂交，以获得该DNA区的特异性荧光特征。在本研究中，所使用的探针将特异于HPV 16、18、31、33、45、35、39、51、52、56、58、59、66和68或其他HPV基因组，并依次为参考区根据盖玻片上梳理的细胞基因组数对结果进行标准化。只有整合到细胞基因组中的HPV形式才会被梳理和分析。不分析环状游离形式，因为它们没有可供梳理的游离DNA末端。
杂交后，将载玻片置于扫描仪中，以便通过落射荧光显微术获得对应于载玻片所有视野的图像。使用由Genomic Vision开发并以Fibervision 2016商标为其他应用程序商业化的特定软件，可以在数千个视野中识别包含荧光信号的盖玻片上的目标区并测量这些区的尺寸不同的信号。最后一步是通过恒定拉伸因子(2Kb/μm)的存在实现的，该因子通过直接测量探针及其间距来保证所研究区内的物理距离的确定。
这种方法可用于研究病毒整合(i)具有大约1千碱基(kb)的高分辨率，包括串联整合，(ii)无需初始扩增遗传材料，因此没有与所选择的引物相关的选择偏差，(iii)独立于病毒转录，以及(iv)上述当前和常规分析技术均以可定量和客观的方式不具备所有这些特征，可以对细胞基因组中的HR-HPV基因组的整合进行完整、可靠和精细的分析。
根据分子梳理研究的结果，可以使用该技术开发诊断和预后试剂盒。然而，其他测试也可以从临床研究的结果中推导出来，这些测试将更快、更高吞吐量并且在实验室中易于实施。这些测试也可以用于通过自由游离和基因组整合形式感染细胞的任何其他病毒。本发明包括病毒，例如疱疹病毒属(Herpesvirus)(例如Epstein-Barr病毒[EBV]、人类疱疹病毒属(Herpesvirus)6[HHV-6])和人免疫缺陷病毒(HIV)(Morissette and Flamand,2010,J.Virol.；Hamid et alia,2017,AIDS Res.Ther)。
如本文所示，根据本发明的方法启动了新一代的诊断和预后组合物、试剂盒以及诊断和预后方法。这些方法通常涉及qPCR以测量样品中HPV(或其他病毒)DNA拷贝的数，但通过减少因游离病毒DNA或未整合到宿主基因组DNA中的核酸的存在而引入的错误，从而提供更好的结果。发明人描述了用于减少或消除染色体或基因组DNA样品中游离DNA污染的几种方法。
【实施例1】
样品制备：巴氏涂片样品保存在
【除去游离HPV】
(I)宫颈细胞膜的渗透化、游离基因组的除去和DNA提取：细胞在4℃下在1ml的10mM PIPES(pH 6.8)、300mM蔗糖、100mM NaCl、3mM MgCl
根据Kurvinen等人(Miller et alia,1988，Nucleic Acids Res.；Kurvinen etalia,2000,Eur.J.Cancer)中描述的Miller高盐方案提取DNA。细胞用1ml 10mM Tris(pH8.3)-400mM NaCl-1％十二烷基硫酸钠-2mM EDTA-蛋白酶K以300μg/ml在37℃下裂解过夜。通过添加300μl饱和NaCl进行蛋白沉淀。离心后，除去上清液，用冰冷的无水乙醇沉淀DNA。将DNA沉淀溶解在无菌水中。
(II)将细胞加入琼脂糖塞并除去游离HPV：将宫颈癌细胞嵌入琼脂糖塞基本上按照
(III)用E2生物素化寡核苷酸除去游离HPV：设计了覆盖E2基因的编码和非编码序列的生物素化寡核苷酸。每个患者使用500ng DNA用于随后的游离HPV除去。使用了游离HPVDNA特定热变性同时保留双链基因组DNA的条件。在将部分变性的DNA与E2生物素化寡核苷酸温育后，E2寡-游离HPV复合物被链霉亲和素珠捕获。未结合的DNA用于实时PCR和ddPCR实验。
(IV)使用商业质粒纯化试剂盒除去游离HPV：实验基本上按照Moller等人的描述进行(Moller et alia,2014,Proc.Natl.Acad.Sci USA；Moller et alia，2016,Journalof Vizualized Experiments)。简而言之，在细胞裂解后，将DNA(基因组+游离体)溶液加载到质粒纯化柱的树脂上。在游离HPV与树脂结合后，洗脱液用于实时PCR或ddPCR实验。
通过实时PCR对整合的HPV进行绝对定量：实时PCR(TaqMan)方法用于测量E2和E6ORF的绝对值。下面描述了用于定量整合HPV16、HPV18和HPV58的引物和探针。可以为HPV31、35、39、45、51、52、56、59、66和68设计类似的引物和探针。引物和探针被设计用于特异性扩增已知在病毒整合过程中最常被破坏的E2铰链区(Peitsaro et alia，2002,J.Clin.Microbiology)。通过从E6(游离和整合型拷贝)总数中减去E2(游离体)拷贝数来计算整合拷贝数。每个细胞的病毒整合拷贝的绝对数是通过用单拷贝人类基因标准化获得的。该方法可直接用于宫颈细胞样品，也可在清洁或除去游离形式后使用。
实时PCR。实时PCR实验使用ABI Prism 7700序列检测系统和taqMan UniversalPCR Master Mix(PE Applied Biosystems，Perkin Elmer)进行。扩增条件为50℃2min，95℃10min，95℃15s和60℃60s两步循环，共40个循环。引物和探针见表1。HPV16、HPV18、HPV33和HPV58的E2扩增子的尺寸分别为83bp、136bp、90bp和111bp。HPV16、HPV18、HPV33和HPV58的E6扩增子的尺寸分别为126bp、144bp、124bp和101bp。E2探针在5'端用VIC荧光染料标记，在3'端用MGB/NFQ淬灭剂标记。E6探针在5'端用FAM荧光染料标记，在3'端用TAMRA淬灭剂标记。TaqMan拷贝数参考测定RNA酶P用作拷贝数分析的标准参考测定。87bp扩增子位于单外显子RPPH1基因内。将来自活组织检查的50ng目标DNA添加到反应混合物中。通过对HPV16、HPV18、HPV33和HPV58克隆的5000万至500个拷贝的稀释系列进行扩增，获得3个标准曲线。
结果记录为50ng细胞中的拷贝数。通过从E6(游离和整合型)的总拷贝数中减去E2(游离)的拷贝数来计算整合的E6。每个基因组的整合E6数通过将整合E6的数除以参考RNA酶P基因的拷贝数计算[拷贝数(E6游离型+整合型)-拷贝数E2(游离型)×2]/拷贝数(RNA酶P基因)。E2与E6的比率小于1表明存在整合型和游离型。E2与整合E6的比率代表游离形式相对于整合形式的量。
【表1】
1：或其短版本如SEQ ID NO：1(AAC GAA GTA TCC TCT CCT GAA ATT ATT)
2：或其短版本如SEQ ID NO：7(TGC ATG GAG ATA CAC CTA CAT TGC)
3：或其短版本如SEQ ID NO：11(AAA AGT AAA GCA CAT AAA GCT ATT)
4：或其短版本如SEQ ID NO：14(TTC AAA TAC CTC TGT AAG TTC CAA TAC)
5：或其短版本如SEQ ID NO：16(TAC AAG CTA CCT GAT CTG TGC ACG)
6：或其短版本如SEQ ID NO：26(AAG CGA CGA CGA CTC GAT TTA CCA)
7：或其短版本如SEQ ID NO：29(CAC AAG TGT AAC AAC AAG TTA CAA TGT)
8：或其短版本如SEQ ID NO：31(ACA AGA ACA ACC GGC CAC AGC TAA)
整合HPV的数字液滴PCR(ddPCR)定量(直接用于宫颈细胞样品或在清洁游离体后)：使用限制酶切割100ng样品DNA。这些限制酶的选择是使用ddPCR计算工具(BIO-RAD)进行的。用于ddPCR的Mastermix包括1×ddPCR Supermix for Probes(无dUTP，BIO-RAD)、0.9μM引物和0.25μM探针(Applied Biosystems)以及5μl切割的样品DNA。实验是如LillsundLarson和Helenius(LillsundeLarson and Helenius,2017,Cell.Oncol.)所述进行。引物和探针设计用于HPV16,18,31,33,35,39，45,51,52,56,58，59、66和68。
使用锚定在HPV序列和宿主基因组序列上的引物进行Q-PCR：在宿主基因组整合过程中，HPV序列容易破坏内源基因。在本发明中，我们展示了覆盖被破坏的宿主基因与全部或部分整合的HPV基因组之间的连接处的核酸序列构成与HPV诱导的宫颈癌中的瘤形成进展相关的生物标志物。整合位点两侧的核酸序列范围为1个碱基到2.5kb，因此定位在宿主和HPV基因组上，被认为是生物标志物。这些生物标志物可用于诊断或协助诊断HPV诱导的癌。它们还可用于增加当前筛查方式的阳性预测值。示例性生物标志物包括MAPK10，PTPN13，NUDT15，MED4，ITM2B，RB1，LPAR6，RAB11A，RPL13A，ZNF341，OFD1，DHRS3，TBC1D22B，AFF3，CXCL6，PF4V1，IMMP2L，MMP12，WDR20，ALDHA1A，TPRG1，TUBD1，MAST4，LOC100132167，NFIX，CCAT1，GPR137B，RAB22A，C9orf3，MACROD2，DACH1，ATP10A，SPG11，SORD，COL4A4，GATSL1，GATSL2，MAP2，EPN1，ATXN3L，EGFL6，MAGI2(Holmes等人，2016，Genomic Medecine)。在被破坏的基因和特异性扩增整合连接处的整合HPV基因组中选择的正向和反向寡核苷酸引物用于生物标志物的产生。或者，与整合连接处互补的特定核酸序列用于通过上述生物标志物的杂交进行检测。将HPV16病毒基因组整合到OFD1人类基因(ref seqNG_008872.1)过程中涉及的核酸序列示例如图10所示。表2列出了用于扩增用作生物标志物的OFD1基因/HPV16和HPV16/OFD1基因连接处的正向和反向引物的序列。该方法直接用于宫颈细胞样品或在游离形式清洁后。
【表2】
多重连接依赖性探针扩增：MLPA检测用于监测HPV16/18病毒载量和整合。类似的系统用于测量患者宫颈细胞中14种高风险HPV病毒的HPV整合水平。该方法使用专门针对HPV病毒设计的引物。因为E6和E7基因几乎总是存在于所有HPV相关的病变中，无论身体状况如何，针对这些基因的探针被设计用于14种HPV的分型。为了检测整合状态，为每个HPV开发了2个E2探针组，其靶标是整合到人类基因组中时最常被删除的序列。在预扩增的第一步后，进行MLPA反应并通过电泳分析PCR产物。病毒载量是通过确定E6/E7之间的比率和7个人类靶标(例如β珠蛋白、MSH2)来确定的。E2/E6比率还针对病毒载量绘制，以确定病毒整合截止值。该方法可直接用于宫颈细胞样品，或在清洁或除去游离形式后使用。
【实施例2：临床研究方案】
该流程涉及通过分子梳理或FISH或类似技术检测的高风险HPV基因组的整合与宫颈病变的严重程度和/或临床结果之间的关联。该研究适用于接受诊断性阴道镜检的宫颈涂片异常的患者。这是一项探索性研究，涉及DNA梳理。该研究是按照ICH GCP进行的。
背景和原理：宫颈癌的发生与一种或多种高致癌风险的人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染有关。与宫颈癌相关的最常见基因型是HPV基因型16、18、31、33和45，占这些癌的80％以上。
由于宫颈癌进展缓慢，可以通过筛查和治疗之前的癌前病变来预防宫颈癌。该筛查目前基于宫颈(Pap)涂片的细胞学检查。在异常发现的情况下，阴道镜检是为了取活组织检查样品以完成诊断过程。
细胞基因组中高风险HPV基因组的整合被认为是宫颈癌发展的关键事件，也是其最重要的风险因素之一。在大多数宫颈癌中，HPV基因组是整合的，而在低等级病变中主要以游离形式存在。其他数据也表明早期宫颈病变向高等级病变的快速进展与HPV的整合密切相关。因此，检测细胞基因组中高风险HPV基因组的整合可能为鉴定高等级病变或处于高进展风险的病变提供有用的标记。这将有可能减少不必要的阴道镜检次数，避免对自发消退的病变进行过度治疗，并更好地瞄准需要治疗的病变。
发明人的一个目的是研究通过分子梳理检测的高风险HPV基因组的整合与具有阴道镜检指征的患者的宫颈病变的严重程度之间的关联。其他目标包括研究分子梳理检测到的高风险HPV基因组整合与病毒清除之间的关联，以及分子梳理检测到的高风险HPV基因组整合与宫颈病变临床结果之间的关联。它还涉及根据高风险HPV的类型调查分子梳理检测到的整合率。
方法论。该研究被设计为具有前瞻性纳入的多中心队列研究。研究的患者群体是所有女性，所有女性年龄在25至65岁之间，咨询参与阴道镜检研究的妇科，在巴氏涂片检查异常后(ASC-US、ASC-H、非典型腺细胞、LSIL、HSIL)。
建议所有有资格参加本研究的女性在宫颈抹片检查异常后进行阴道镜检的妇科就诊期间参与该研究。同意参与研究(签署知情同意书)的患者将被纳入研究。
研究的横截面部分(基线访问)。收集宫颈涂片并对该样品进行HPV基因分型。高风险HPV基因型结果为阴性的患者将退出研究。对于任何高风险HPV基因型的HPV结果呈阳性的患者，使用该样品进行HPV基因组整合的分子梳理研究。宫颈的照片是用视频阴道镜拍摄的。妇科医生将使用阴道镜检结果和(如果合适)通过阴道镜检进行的活组织检查的组织学分析，向患者建议适当的管理(定期监测或治疗病变)。
研究的纵向部分。建议随访的患者将参与研究的纵向部分。在第6、18和30个月进行随访，包括收集宫颈涂片样品用于细胞学分析。也将在12、24和36个月时收集宫颈涂片样品进行HPV基因分型，对于任何高风险HPV基因型的HPV结果呈阳性的患者，也将通过分子梳理进行HPV基因组整合的研究使用宫颈涂片样品进行。阴道镜检，宫颈图像是用视频阴道镜拍摄的。在妇科医生认为必要时进行活组织检查。对于护理包括治疗病变的患者，停止参与研究。对于高风险HPV阴性且病变消退(连续2次就诊确认)的患者，停止参与该研究。在纵向研究期间，妊娠也是中止的一个原因。
统计分析。通过单变量(Student检验、Wilcoxon、Chi2或Fisher精确检验)和多变量分析(逻辑回归)测试与宫颈病变严重程度相关的因素，包括高风险HPV基因组的各种整合参数。通过单变量(Student's t检验、Wilcoxon、Chi2或Fisher精确检验)和多变量分析(逻辑回归)测试与病毒清除相关的因素，包括高风险HPV基因组的各种整合参数。通过单变量(Student's test、Wilcoxon、Chi2或Fisher精确检验)和多变量分析(逻辑回归)测试与宫颈病变进展相关的因素(回归或进展)，特别是高风险HPV基因组整合的不同参数。一项中期分析是通过在较小的组中招募约100名受试者后累积横截面数据来完成的。中期分析的主要目标是重新估计样本量。没有正式的停止规则。由于研究的探索性设计，不会调整可能的I类错误率膨胀。
排除/包含标准。纳入标准包括25至65岁的女性在宫颈涂片异常(ASC-US、ASC-H、腺体异常、LSIL、HSIL)的情况下访问该网站进行阴道镜检至少1个月，最多6几个月前同意参加研究以及书面同意。排除标准包括那些接受过HPV疫苗治疗的宫颈疾病患者，细胞学随访正常不到2年，已知HIV检测呈阳性，患有产生免疫抑制的慢性疾病，正在进行免疫抑制治疗，在最近6个月内一般皮质激素治疗2周或更长时间、怀孕以及在入组前最近3个月内或在本试验期间曾参与试验药物临床试验的患者。
评估。评估参与者的HPV整合。这包括整合(存在/不存在)、每个细胞基因组的HPV整合位点数、每个整合位点整合的HPV基因组平均数(或整合位点的平均尺寸)、每个整合位点整合的HPV基因组的最大数(或最大整合位点的尺寸)、每个整合位点整合的HPV基因组的最小数(或整合位点的最小规模)、每个细胞基因组整合的HPV基因组数、病变状态、病毒清除、临床结果和治愈。
本次调查的主要目的是研究通过分子梳理检测到的高风险HPV基因组的整合与宫颈抹片检查异常后有阴道镜检指征的患者宫颈病变严重程度之间的关联。其他目标包括评估接受阴道镜检发现巴氏涂片检查异常的患者并对其进行简单监测：通过分子梳理检测到的HR-HPV基因组整合与病毒清除之间的关联；分子梳理检测到的HR-HPV基因组整合与宫颈病变临床结果之间的关联；并评估通过分子梳理检测到的每种类型的HR-HPV的整合率。
通过分子梳理研究的HPV基因组的整合。对于每个患者，在分子梳理分析过程中评估的参数是：盖玻片上的梳理细胞基因组的估计数。梳理的细胞基因组的数因一张盖玻片而异，具体取决于提取的DNA量和梳理密度。因此，它用于结果的标准化。盖玻片上HPV整合位点数。HPV基因组整合的千碱基尺寸(kb)。在每个整合位点整合的HPV基因组数。整合模式由以下变量定义，其值直接由上述数据确定：整合(存在/不存在)、每个细胞基因组的HPV整合位点数、每个整合位点整合的HPV基因组平均数(或平均尺寸)整合位点数)、每个整合位点整合的HPV基因组的最大数(或整合位点的最大尺寸)、每个整合位点整合的HPV基因组的最小数(或整合位点的最小尺寸)、每个细胞基因组整合的HPV基因组数。将计算这些值：针对所有检测到的HPV信号，然后仅针对10kb以上的HPV信号。这种信号选择克服了在处理过程中可能被线性化的病毒游离形式的潜在污染问题，从而允许这些形式通过它们的自由端进行梳理。
病变状态。根据2014年发布的新WHO分类，尽可能提供阴道镜下活组织检查和锥切样本的活组织检查结果：正常组织学(包括没有上皮内病变或病毒感染迹象的所有异常，如化生、宫颈炎、蜕膜病变或腺病)，低等级(LG)病变，对应于原CIN1，高等级(HG)病变，对应于原CIN2,3和CIS(原位癌)，AIS(原位腺癌)。尽管如此，仍有可能继续使用WHO 2003分类(正常宫颈、尖锐湿疣、CIN1、CIN2、CIN3、AIS)。如果宫颈阴道镜活组织检查的组织学数据与锥切样本的组织学数据存在差异，则将考虑最坏情况的组织学结果。
法语术语：在本研究中，法国和国际术语将用于阴道镜分类：正常宫颈：包括外翻、化生和纳氏囊肿。1级非典型转化(AT)：对应于上皮再形成的向心区(如正常化生)，但具有不产生糖原的营养不良上皮。该区将显示为：未经准备检查时无充血，轻微醋酸白，边缘清晰，不含任何隐窝开口，碘阴性，使用Lugol氏碘溶液后，边缘清晰。2级非典型转化(AT)：在检查时定义为存在充血区，然后是强烈的醋酸白区，边缘模糊，存在隐窝开口和使用Lugol氏碘溶液后边缘模糊的碘阴性外观。这种病变复合体呈现出朝向外宫颈和宫颈内膜的离心进展，显示出其发育不良的性质。根据图像上严重程度的迹象(血管糜烂、溃疡、赘生物、坏死等)的数，这种2级AT有几个严重程度增加的阶段。TAG2 a，如果没有主要体征，TAG2 b，如果有主要体征，TAG2c，当出现提示浸润性癌时。对于每个阴道镜外观：正常、TAG1或TAG2，将指定鳞柱连接处(SCJ)的水平：可见或不可见。当SCJ不可见时，阴道镜检被认为是无贡献的。
国际术语：这主要集中在没有准备和应用醋酸后的检查，因为Lugol氏碘溶液不是阴道镜检的一个组成部分和系统部分(特别是对于讲英语的从业者)。正常宫颈：包括法语术语中正常宫颈的所有方面。非典型转化：对应于转化区(即原始SCJ和新SCJ之间：修复区)中出现醋白区。这种非典型转化(AT)可能是：轻微的：很少有醋白区，没有任何严重的迹象，主要对应于CIN1病变，但也包括1级非典型转化，这里被认为是醋白的轻微外观主要：更明显的醋白，具有额外迹象的区可能主要对应于CIN2+病变。对于每次阴道镜检：将指定鳞柱连接处(SCJ)的水平：可见或不可见。当SCJ区不可见时，阴道镜检被认为是无贡献的。
细胞学分类。使用Bethesda系统术语(2001)报告了宫颈涂片的细胞学分析。这提供了以下信息：样本类型：常规宫颈涂片，单层，样本质量：分析满意与否，一般分类：异常上皮细胞的存在/不存在。
解释/结果：上皮内病变或恶性肿瘤阴性，异常鳞状细胞，非典型鳞状细胞(ASC)，意义未定(ASC-US)，不能排除高等级鳞状上皮内病变(ASC-H)，低等级鳞状上皮内病变(LSIL)、高等级鳞状上皮内病变(HSIL)、鳞状细胞癌、异常腺细胞、非典型腺细胞(AGC)：宫颈内膜(未另行说明(NOS)或评论)、子宫内膜或未另行说明，非典型腺细胞，有利于肿瘤性：宫颈内或未另行说明，宫颈内原位腺癌(AIS)。腺癌：宫颈内膜癌、子宫内膜癌、宫外癌或未另行说明。
简单随访患者宫颈病变的临床结果。宫颈病变的临床结果将仅针对参与研究纵向部分的患者进行评估。在决定监测的异常涂片中发现的组织学病变的结果将根据结肠镜、细胞学和组织学标准进行评估。这三种可能性是进展、稳定或回归。如果出现差异，将考虑最坏情况的端点。
病毒清除。病毒清除率仅针对参与研究纵向部分的患者进行评估。病毒清除率将通过2种方式进行评估：HR-HPV清除率：每次就诊时检测到的所有高风险HPV都将被全局考虑。因此，HR-HPV病毒清除将通过随访期间不存在任何HR-HPV和特定类型清除来定义：将独立考虑每种HR-HPV。特定病毒类型的清除将通过对基线时存在的aHPV亚型的监测访问期间的阴性测试来定义。不会考虑在随访期间可以检测到的未呈现基线的HR-HPV亚型。
治愈。治愈的定义是在连续2次随访时宫颈病变完全消退并清除HR-HPV。
调查计划。如图5提供了研究设计图。该研究是开放标签、单臂、多中心探索性研究，包括两部分：横截面部分(一次研究访问)和纵向部分(随访)——36个月内最多6次访问。
估计的患者人数为993名入组患者/655名可评估患者。样品尺寸是根据对大约100名受试者登记在较小严重程度组(无论是哪个)时对累积数据参数的估计重新计算的。
患者参与研究的持续时间可能因患者护理而异：如果决定是定期随访：根据决定，患者的参与将持续至少6个月，不超过3年治疗或康复，或者如果决定治疗：患者的参与将是一次性的(无随访)，并且仅包括初次阴道镜检。
为了达到主要目标，我评估了两组患者：一组宫颈涂片异常、HR-HPV基因分型阳性、组织学结果正常或组织学病变低等级。一组宫颈子宫涂片异常、HR-HPV基因分型阳性和高等级组织学病变的患者。
中期分析。在将大约100名受试者纳入较小的组(无论哪个)时，将通过累积横截面数据进行一项中期分析。中期分析的主要目标是重新估计样品量，但也将分析所有主要变量。没有独立的数据监测委员会来评估中期结果。中期统计报告可直接提供给发起人；没有计划数据评估会议。没有正式的停止规则。尽管如此，申办者将根据中期结果决定是继续还是中止、寻求额外数据和/或修改研究设计。但是，除非发生这种情况，否则主要调查人员和中央行政人员将继续对累积数据的中期结果一无所知。有关中期分析的统计考虑，请参阅本研究方案的统计部分。
横截面部分分析。在纳入688名受试者后停止了患者登记。其中410人被归类为HPV高风险被考虑进行统计分析。
本研究方案的统计部分描述了统计考虑，并且统计报告可直接提供给发起人。
M0、M12、M24和M36的宫颈子宫样品管理。将使用ThinPrep(Hologic)设备收集宫颈子宫样品。获得的细胞悬浮液总体积为20mL。样品将在-20℃下通过特殊快递运送到认可的中心实验室进行基因分型。服务提供者将取4mL样品进行HPV基因分型，剩余体积的样品(16mL)将在-20℃下冷冻。根据HPV基因分型结果，实验室销毁HR-HPV阴性样品(向申办者出具销毁证明)，-20℃保存HR-HPV阳性样品，分批转运经同意后在-20℃下进行GenomicVision。Genomic Vision通过分子梳理对HR-HPV阳性样品进行分析。Genomic Vision将在研究结束后的10年内存储已进行分子梳理分析的其余样品(生物收集)。申办者负责通过索取销毁证书来销毁这些样品。
M6、M18、M30的宫颈子宫样品管理。宫颈子宫样品收集将使用ThinPrep(Hologic)设备进行，并将照常运送到现场的细胞学实验室，该实验室将对样品进行细胞学分析。
分子梳理以寻找HPV整合。寻找HPV基因组整合包括5个步骤：
第1步：DNA提取。待分析的生物样品中的细胞被放置在一块称为“塞”的琼脂糖块中，其中几个酶处理阶段导致样品裂解并消除所有附着在DNA上的蛋白(组蛋白、转录因子等))。然后消化琼脂糖以获得溶液中的裸DNA。
第2步：梳理。将涂有一层硅烷的载玻片浸入DNA溶液中。双链DNA通过疏水相互作用不可逆地固定在硅烷化载玻片的一端和/或另一端。然后以300μm/s的恒定速度从溶液中垂直取出载玻片。拉伸DNA的力仅作用于弯液面，并导致DNA分子的均匀拉伸，而不管其长度如何。因此，DNA链彼此平行排列并在载玻片上形成一个垫子，根据其密度，其中包含大约100个完整的基因组。
第3步：杂交。拉伸后的DNA分子在梳理后不可逆地固定在载玻片上；然而，它们仍然可用于覆盖HPV基因组16、18、31、33、45、35、39、51、52、56、58、59、66和68的探针的其他DNA序列。这些探针是通过随机引物获得的，允许在与荧光染料偶联的每个修饰核苷酸的特异性抗体的帮助下，将修饰核苷酸掺入序列中，从而产生荧光信号。
研究的HPV基因组由3个探针覆盖(图3)：一个特定于包含基因L1和L2的病毒基因组区，第二个特定于包含病毒基因E1和E2的区，第3个特定于包含病毒癌基因E6和E7的区。对应于区L1L2和E1E2的探针将显示为蓝色，对应于区E6E7的探针将显示为青色(绿色+蓝色)。此外，生成覆盖宿主DNA参考位点的探针，以定量梳理的宿主基因组数并标准化患者细胞的HPV整合。这些参考信号以红色显示。见图6。
第4步：荧光信号的采集。图像采集是通过落射荧光显微镜进行的。载玻片通过过滤光(激发光谱)由对应于各种荧光染料的波长点亮，并以适当的波长(发射光谱)捕获重新发射的荧光。为了获取图像，Genomic Vision配备了一台扫描仪，能够将载玻片分成数千个视野，并为每个视野捕获图像。如此生成的图像通过软件进行分析，该软件允许检测包含目标荧光信号的目标区并对其进行测量；见图7。
第5步：分析。HPV 16、18、31、33、45、35、39、51、52、56、58、59、66和68基因组被探针覆盖：覆盖L1L2和E1E2的探针显示为蓝色，覆盖E6E7的探针显示为青色(蓝色+绿色)。参考轨迹显示为红色，参见图8，其显示了在载玻片上检测到的信号类型。
对于每位患者，在分子梳理分析期间记录的参数如下：
载玻片上梳理的宿主基因组估计数：计算方法是将分析载玻片上可见的所有参考信号(红色)的尺寸(以kb为单位)相加，然后将该总和除以理论尺寸(以kb为单位)基因座，然后乘以2(因为每个基因组有2个等位基因)。对于提示癌性病变的涂片，其具有相当大的遗传不稳定性，我们将从该区未被修改的前提下开始。事实上，由于基因座在重复序列中特别差，被修改的风险较低。根据提取的DNA量和梳理密度，梳理宿主基因组的数因载玻片而异。因此，它用于标准化结果。
载玻片上HPV整合位点数。它对应于载玻片上检测到的HPV信号(蓝色)的数。在上图中的例子中，我们可以数到5。
以千碱基(kb)为单位的HPV基因组整合尺寸：这对应于以kb为单位测量的HPV信号(蓝色)的尺寸。
每个整合位点的整合HPV基因组数。这对应于每个蓝色HPV信号可见的青色信号的数。例如，在上图中，框定的HPV信号在该位点有4个整合的HPV基因组。
整合概况将由以下变量定义，其值直接从上述数据推导出：每个患者基因组的HPV整合位点数，每个整合位点的整合HPV基因组的平均数(或平均尺寸整合的数)，每个整合位点的整合HPV基因组的最大数(或整合的最大尺寸)，每个整合位点整合的HPV基因组的最小数(或整合位点的最小尺寸)，每个患者基因组整合的HPV基因组数。
这些值是针对所有检测到的HPV信号(蓝色)计算的，然后仅针对大于10kb的HPV信号(蓝色)计算。这种信号选择允许消除在处理过程中线性化的游离病毒形式的潜在污染，允许这些形式通过它们的自由端进行梳理。
活组织检查和锥体的集中读取。对于所采集的组织学样品(如果是可见病变则进行活组织检查，如果病变被治疗则为锥体样品)，由经认可的实验室对组织学样品进行集中读取的组织学分析。为此，研究地点将样品(组织块或载玻片)送到该实验室进行评估，该实验室还对p16和Ki67转化标记进行免疫组织化学染色测试。样品由实验室存档10年(组织块)和5年(载玻片)。
集中阅读宫颈照片。在阴道镜检期间连续3次拍摄宫颈照片：无准备检查，可选择使用绿色滤光片拍摄的照片以分析上皮和血管；等待30秒至1分钟后应用3％乙酸进行检查，以识别鳞柱连接处并寻找嗜酸菌；应用Lugol的解决方案后进行考试。基于应用醋酸后的结果的阴道镜图(可选)可以显示鳞柱连接处、嗜酸菌的范围，尤其是活组织检查或活组织检查的确切位置和数。由2名独立于研究的经验丰富的妇科医生对宫颈照片进行集中阅读。为每张照片确定阴道镜情况。
下面描述了一个样品研究计划。
此处使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本发明。例如，如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指示。将进一步理解，术语“包含”和/或“包含”，当在本说明书中使用时，指定所述特征、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作、元素、组件和/或它们的组。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何和所有组合并且可以缩写为“/”。
在本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则“包括”一词以及诸如“包括”和“包括”之类的变体是指可以在方法和物品中共同使用的各种组件(例如，包括装置和方法的组合物和设备)。例如，术语“包括”将被理解为暗示包括任何陈述的要素或步骤，但不排除任何其他要素或步骤。
如本文在说明书和权利要求中使用的，包括在实施例中使用的，除非另有明确规定，所有数字都可以理解为好像以“基本上”、“大约”或“大约”一词开头，即使该术语没有明确出现。当描述幅度和/或位置时可以使用短语“大约”或“大约”以指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，一个数值可能是规定值(或值范围)的+/-0.1％、规定值(或值范围)的+/-1％、规定值的+/-2％规定值(或值范围)，规定值(或值范围)的+/-5％，规定值(或值范围)的+/-10％，规定值的+/-15％值(或值范围)、规定值(或值范围)的+/-20％，等等。本文所述的任何数字范围旨在包括其中包含的所有子范围。
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本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用整体并入本文，其程度就好像每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用并入一样，特别是引用的是出现在以引用方式并入的说明书中相同的句子、段落、页面或部分。
本文引用的参考文献并不构成承认这些参考文献是现有技术或与本文公开的技术的可专利性有任何相关性。对引用的参考文献内容的任何讨论仅旨在提供参考文献作者所作断言的一般摘要，并不构成对此类参考文献内容准确性的承认。
序列表
<110> GENOMIC VISION
<120> 病毒性HPV或HIV基因组的整合与HPV相关宫颈病变或艾滋病病理学疾病的严重程度和/或临床结果之间的关联
<130> B14181WO/AD/CG
<140> PCT/IBxxxxx
<141> 2019-11-29
<150> US62/773831
<151> 2018-11-30
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<400> 1
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tgcatggaga tacacctaca ttgcatgaat ata 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
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agatgtttta catttcagtg tatttttttt tttttttgag acggagtctc gctctgtcac 60
ctaggctgga gtgcagtggt gcgatctcgg ctcactacaa gctccacctc ccaggttcac 120
gccattcttc cacctcagcc tccccagtag ctgggactac aggcacccac caacacgccc 180
ggctaatttt ttgtattttt agtagaggcg gggtctcagc gtgttagcca ggatgatctc 240
gatctcctga cctcgtgatc cgcccgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt 300
gagccaccac gcccgaccca tttcaatgta tttctaggaa attgctgtaa caagaagttg 360
aagttttggt ggaaatttca agtagattcc tgggaggaaa ccagggttag atagttgatg 420
ttgaccagat acccaatgtg tggctactgt cttttttttt tttttttttt aagagacgga 480
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tgtatgtatg gtataataaa cacgtgtgta tgtgttttta aatgcttgtg taactattgt 660
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ttgtatataa actatatttg ctacatcctg tttttgtttt atatatacta tattttgtag 780
cgccagcggc cattttgtag cttcaaccga attcggttgc atgctttttg gcacaaaatg 840
tgttttttta aatagttcta tgtcagcaac tatggtttaa acttgtacgt ttcctgcttg 900
ccatgcgtgc caaatccctg ttttcctgac ctgcactgct tgccaaccat tccattgttt 960
tttacactgc actatgtgca actactgaat cactatgtac attgtgtcat ataaaataaa 1020
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<210> 38
<211> 596
<212> DNA
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<220>
<223> 合成序列
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agatgtttta catttcagtg tatttttttt tttttttgag acggagtctc gctctgtcac 60
ctaggctgga gtgcagtggt gcgatctcgg ctcactacaa gctccacctc ccaggttcac 120
gccattcttc cacctcagcc tccccagtag ctgggactac aggcacccac caacacgccc 180
ggctaatttt ttgtattttt agtagaggcg gggtctcagc gtgttagcca ggatgatctc 240
gatctcctga cctcgtgatc cgcccgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt 300
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ttgaccagat acccaatgtg tggctactgt cttttttttt tttttttttt aagagacgga 480
gtcttgctct gttgcccagg ctggagtaca gtggcacaat ctcagctcac tgcaacctct 540
gcctcctggg ttcaagtgat tcttgtgcct cagcctccca agtagctggg actaca 596
<210> 39
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
tgtttgtatg tatggtataa taaacacgtg tgtatgtgtt tttaaatgct tgtgtaacta 60
ttgtgtcatg caacataaat aaacttattg tttcaacacc tactaattgt gttgtggtta 120
ttcattgtat ataaactata tttgctacat cctgtttttg ttttatatat actatatttt 180
gtagcgccag cggccatttt gtagcttcaa ccgaattcgg ttgcatgctt tttggcacaa 240
aatgtgtttt tttaaatagt tctatgtcag caactatggt ttaaacttgt acgtttcctg 300
cttgccatgc gtgccaaatc cctgttttcc tgacctgcac tgcttgccaa ccattccatt 360
gttttttaca ctgcactatg tgcaactact gaatcactat gtacattgtg tcatataaaa 420
taaatcacta tgcgccaacg ccttacatac cgctgttagg cacatatttt tggcttgttt 480
taactaacct aattgcatat ttggcataag gtttaaactt ctaaggccaa ctaaatgtca 540
ccctagttca tacatgaact gtgtaaaggt tagtcataca ttgttcattt gtaa 594
<210> 40
<211> 410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
ccagataccc aatgtgtggc tactgtcttt tttttttttt ttttttaaga gacggagtct 60
tgctctgttg cccaggctgg agtacagtgg cacaatctca gctcactgca acctctgcct 120
cctgggttca agtgattctt gtgcctcagc ctcccaagta gctgggacta catgtttgta 180
tgtatggtat aataaacacg tgtgtatgtg tttttaaatg cttgtgtaac tattgtgtca 240
tgcaacataa ataaacttat tgtttcaaca cctactaatt gtgttgtggt tattcattgt 300
atataaacta tatttgctac atcctgtttt tgttttatat atactatatt ttgtagcgcc 360
agcggccatt ttgtagcttc aaccgaattc ggttgcatgc tttttggcac 410
<210> 41
<211> 910
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 41
atggctgatc ctgcaggtac caatggggaa gagggtacgg gatgtaatgg atggttttat 60
gtagaggctg tagtggaaaa aaaaacaggg gatgctatat cagatgacga gaacgaaaat 120
gacagtgata caggtgaaga tttggtagat tttatagtaa atgataatga ttatttaaca 180
caggcagaaa cagagacagc acatgcgttg tttactgcac aggaagcaaa acaacataga 240
gatgcagtac aggttctaaa acgaaagtat ttgggtagtc cacttagtga tattagtgga 300
tgtgtagaca ataatattag tcctagatta aaagctatat gtatagaaaa acaaagtaga 360
gctgcaaaaa ggagattatt tgaaagcgaa gacagcgggt atggcaatac tgaagtggaa 420
actcagcaga tgttacaggt agaagggcgc catgagactg aaacaccatg tagttcccct 480
gattctgacc ttgagtttgt agccaatact aaggcaaggg tcaaagagct tcagcaagag 540
gccgaacgct tggaaaaggc tttcagaagt taccatcgga gagtcattaa aaactctgcc 600
aaaagcccac tagcagcaaa gagcccacca tctctgcact tgctggaagc cttcaaaaac 660
attacttcca gttccccgga aagacatatt tttggagagg acagagttgt ctctgagcag 720
cctcaagtgg gcacacttga agaaaggaat gacgtcgtgg aagcactgac aggcagtgca 780
gcctcgaggc tccgcggggg cacttcctcc agacgcctct cttccacacc ccttccaaaa 840
gcaaaaagaa gcctcgaaag tgaaatgtat ctggaaggta agccacccgc acaaagggtt 900
gcggggtgct 910
<210> 42
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
atggctgatc ctgcaggtac caatggggaa gagggtacgg gatgtaatgg atggttttat 60
gtagaggctg tagtggaaaa aaaaacaggg gatgctatat cagatgacga gaacgaaaat 120
gacagtgata caggtgaaga tttggtagat tttatagtaa atgataatga ttatttaaca 180
caggcagaaa cagagacagc acatgcgttg tttactgcac aggaagcaaa acaacataga 240
gatgcagtac aggttctaaa acgaaagtat ttgggtagtc cacttagtga tattagtgga 300
tgtgtagaca ataatattag tcctagatta aaagctatat gtatagaaaa acaaagtaga 360
gctgcaaaaa ggagattatt tgaaagcgaa gacagcgggt atggcaatac tgaagtggaa 420
actcagcaga tgttacaggt agaagggcgc catgagactg aaacaccatg tagt 474
<210> 43
<211> 436
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
tcccctgatt ctgaccttga gtttgtagcc aatactaagg caagggtcaa agagcttcag 60
caagaggccg aacgcttgga aaaggctttc agaagttacc atcggagagt cattaaaaac 120
tctgccaaaa gcccactagc agcaaagagc ccaccatctc tgcacttgct ggaagccttc 180
aaaaacatta cttccagttc cccggaaaga catatttttg gagaggacag agttgtctct 240
gagcagcctc aagtgggcac acttgaagaa aggaatgacg tcgtggaagc actgacaggc 300
agtgcagcct cgaggctccg cgggggcact tcctccagac gcctctcttc cacacccctt 360
ccaaaagcaa aaagaagcct cgaaagtgaa atgtatctgg aaggtaagcc acccgcacaa 420
agggttgcgg ggtgct 436
<210> 44
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
ttactgcaca ggaagcaaaa caacatagag atgcagtaca ggttctaaaa cgaaagtatt 60
tgggtagtcc acttagtgat attagtggat gtgtagacaa taatattagt cctagattaa 120
aagctatatg tatagaaaaa caaagtagag ctgcaaaaag gagattattt gaaagcgaag 180
acagcgggta tggcaatact gaagtggaaa ctcagcagat gttacaggta gaagggcgcc 240
atgagactga aacaccatgt agttcccctg attctgacct tgagtttgta gccaatacta 300
aggcaagggt caaagagctt cagcaagagg ccgaacgctt ggaaaaggct ttcagaagtt 360
accatcggag agtcattaaa aactctgcca aaagcccact agcagcaaag agcccaccat 420
ctctgcactt gctggaagcc ttcaaaaaca ttacttccag ttccccggaa agacat 476
机译： 病毒作为HPV或HIV基因组的整合与疾病的严重程度和/或临床结果与HPV相关的宫颈病变或艾滋病病理学
机译： 病毒作为HPV或HIV基因组的整合与疾病的严重性和/或临床结局之间的关联，例如HPV相关的宫颈病变或艾滋病病理学
机译： 分子梳法检测高危型HPV基因组整合与宫颈病变的严重程度和/或临床结果之间的联系
