基于表面增强拉曼散射的靶物质检测用基板的制造方法，基于其的靶物质检测用基板及使用其的靶物质检测方法

摘要

本发明涉及利用离心分离从而便于在靶物质的表面上涂覆金属纳米粒子的一种基于表面增强拉曼散射的靶物质检测用基板的制造方法，基于其的靶物质检测用基板及使用其的靶物质检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于表面增强拉曼散射的靶物质检测用基板的制造方法，基于其的靶物质检测用基板及使用其的靶物质检测方法。

背景技术

表面增强拉曼散射(Surface enhanced Raman scattering,SERS)作为最有前途的分析方法之一，意味着在要分析的物质吸附至如同被粗糙地处理的金属的拉曼活性物质表面上或者位于几百纳米之内的距离时，测定分析物质的拉曼散射的分光法，其强度由于根据所述表面的粗糙度被提供的表面等离子体相较于一般的拉曼强度增加了104～106倍以上。

拉曼发射光谱的波长显示样本内的光吸收分子的化学组成及结构特性，因此分析这种拉曼信号可以直接分析分析对象物。

进一步的，对于蛋白质的分析，至今的检测蛋白质的内在的SERS信号的现有研究结果大部分是在试料内包含单一蛋白质或者利用分离及提取的蛋白质为对象的示例。但是，实际活检样本内混合了复杂的物质，检测之前分离/提取靶蛋白质的过程复杂且需要多量的试料。事前分离/提取所述靶蛋白质的简单方法是利用抗体等进而利用免疫结合。例如，在金属粒子的表面上靶蛋白质上结合特异的抗体，利用了在所述抗体上结合了靶蛋白质的复合粒子。

一方面，SERS信号具有根据与纳米间隙的距离以指数方式减少的特征，由于所述复合粒子具有金属粒子的表面与靶蛋白质的预定距离，因此有检测灵敏度下降的问题。

同时，由于制备具有高灵敏度的纳米结构体需要Focused ion-beamlithography、E-beamlithography、ion-milling等制备时间长且费用高的高性能的装备，还没有商业化。

因此，需要没有另外的蛋白质分离/提取过程且制造过程简单的传感器等的制造方法，需要可以进行均匀的信号检测的生物传感器。

发明内容

技术问题

本发明旨在解决上述问题，并提供制造工序容易的一种基于表面增强拉曼散射的靶物质检测用基板的制造方法，基于其的靶物质检测用基板及使用其的靶物质检测方法。

技术方案

为了达到上述目的，本发明提供一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造方法，其包括以下步骤：

将黏附生物受体的基板浸入包含靶物质的试料液中，从而形成结合靶物质及生物受体的一次捕获结构体；

将形成所述一次捕获结构的基板设置在离心机的内部，将包含金属纳米粒子的溶液放入到离心机；及

通过操作离心机，形成在靶物质的表面涂覆金属纳米粒子的二次捕获结构体。

此外，本发明提供基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板，其包括：

黏附生物受体的基板；

通过生物受体捕获的靶物质；

加盖靶物质的金属纳米粒子；及

黏附在金属纳米粒子的拉曼染料。

其中，所述靶物质被夹入到生物受体与金属纳米粒子之间，从而形成捕获结构体。

此外，本发明提供：

使用基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板而检测靶物质为特征的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测方法。

技术效果

根据本发明的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造方法，可以利用离心分离，而在靶物质的表面上快速、均匀地进行涂覆。

此外，通过在靶物质上直接涂覆金属纳米粒子，可以缩短金属离子的表面与靶物质之间的距离，据此可以提高靶物质的检测灵敏度，可以易于检测基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质。

附图说明

图1是示意性地显示根据本发明的一实施例的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造过程的图。

图2是显示根据本发明的一实施例的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造过程的流程图。

图3是显示根据本发明的一实施例的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的示意图的图。

图4是显示在基板上黏附靶蛋白质的过程的示意图。

图5是显示在本发明的实施例中，基于离心分离的纳米粒子黏附过程的图((a)为离心分离前，(b)为离心分离后)。

图6的左侧为离心分离后的基板的扫描电子显微镜(SEM)照片，图6的右侧为离心分离后的基板的暗视野显微镜照片。

图7(a)是显示离心分离过程的示意图，图7(b)是根据离心分离重复(循环数)的基板的颜色变化和SEM照片，图7(c)是显示根据离心分离重复(循环数)的靶蛋白质的SERS信号的曲线图。

图8(a)是显示分析将检测点每移动2μm至总计120μm的光谱的结果的曲线图，图8(b)是显示在随机设置检测点分析光谱的结果的曲线图。

图9是显示利用在实施例和比较例中制备的蛋白质传感器检测靶蛋白质信号的结果的曲线图((a)为实施例，(b)为比较例)。

附图标记

100：基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板

110：基板

120：生物受体

121：阻断分子

130：靶物质

140：金属纳米粒子

具体实施方式

在本发明中，可以进行各种修改并且可以具有各种实施例，因此要在附图中示出特定的实施例并且在详细描述中详细描述。

但是，这并不是将本发明限制于特定实施例，应该要被理解为包括在本发明的技术精神和范围内的所有改变、同等物及替代物。对本发明的说明，当对相关公知技术的功能的具体描述被判断为使本发明的主题模糊时，将省略其详细说明。

本说明书中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的并且并非意在限制本发明。除非上下文另外明确指出，否则单数的表示包括复数的表示。

在本发明，包括或者具有等术语旨在指示说明书中记载的特征、数字、步骤、动作、构成要素、部件或其组合的存在，要被理解为不事先排除一个或多个其他特征、数字、步骤、动作、构成要素、部件或其组合的存在或者附加可能性。

本发明涉及一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造方法，基于其的靶物质检测用基板及使用其的靶物质检测方法，更详细地说涉及对免疫黏附金属纳米粒子的靶物质利用离心分离工序的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造方法，基于其的靶物质检测用基板及使用其的靶物质检测方法。

特别地，根据本发明的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造方法，可以利用离心分离，而在靶物质的表面上快速、均匀地进行涂覆。

此外，通过在靶物质上直接涂覆金属纳米粒子，可以缩短金属离子的表面与靶物质之间的距离，据此可以提高靶物质的检测灵敏度，可以易于检测基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质。

下面，详细说明本发明。图1是示意性地表示根据本发明的一实施例的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造过程的图，图2是显示根据本发明的一实施例的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造过程的流程图。

参考图1和图2，根据本发明的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造方法包括以下步骤：

步骤S110，将黏附生物受体的基板浸入包含靶物质的试料液中，从而形成结合靶物质及生物受体的一次捕获结构体；

步骤S120，将形成所述一次捕获结构的基板设置在离心机的内部，将包含金属纳米粒子的溶液放入到离心机；及

步骤130，通过操作离心机，形成在靶物质的表面涂覆金属纳米粒子的二次捕获结构体。

在本发明中使用的术语“黏附生物受体的基板”可以意味着通过基板的表面处理固定有生物受体的基板。

黏附生物受体的基板可以是通过以下步骤的制备方法得到：将基板浸入包含表面改性物质和生物受体的溶液中，从而在所述基板黏附生物受体的步骤；及，在所述基板的表面中未黏附生物受体的部分上黏附阻断分子的步骤。

在此，表面改性物质旨在便于将生物受体黏附到基板上，是从由APTES((3-氨丙基)三乙氧基硅烷)、APTMS((3-氨丙基)三甲氧基硅烷)、半胱胺、AEAPTMS(N-[3-(三甲氧基硅烷基)丙基]乙二胺)、MPTMS((3-巯丙基)三甲氧基硅烷)、MPTES((3-巯丙基)三乙氧基硅烷)、MPA(巯基丙酸)、MHA(6-巯基己酸)、BDT(1,4-苯二硫醇)、MBA(4-巯基苯甲酸)、MBIA(2-巯基苯并咪唑-5-羧酸)组成的组中选择的至少一种，并不限于此，但作为一具体例可以是APTES。

例如，该基板可以准备为由胺基(-NH2)改性的基板，作为另一示例，通过额外的处理可以将硫醇基(-SH)用作生物受体固定用结合器。

进一步地，“生物受体”对靶物质具有特异性，是固定于基板上从而可以捕获靶物质的，可以包括对靶物质具有结合亲和力(binding-affinity)的物质。例如，生物受体可以是“抗体(antibody)”，所述抗体意味着可以结合在靶物质的由氨基酸和糖链结合的蛋白质。

所述生物受体不限于此种类，作为一具体例，可以是由蛋白质抗体、适体、酶、核酸、DNA、RNA、细胞、细胞模仿体(biometic)、蛋白质、有机化合物及聚合物组成的组中选择的至少一种，可以根据靶物质的种类选择合适的生物受体。例如，在靶物质为cyt C时，生物受体可以为蛋白质抗体。

作为一特定示例，将基板浸入包含为基板表面改性的物质和生物受体的溶液中，从而可以制备黏附生物受体的基板。

所述基板可以是从由硅(Si)、砷化镓(GaAs)、玻璃(glass)、石英(Quartz)及聚合物(polymer)组成的组中选择的至少一种非金属物质。并不限于此，但作为一具体例基板可以为玻璃(glass)

一方面，未黏附生物受体的基板上可以结合有生物受体。阻断分子可以是从由牛血清白蛋白(BSA：Bovine SerumAlbumin)、酪蛋白(casein)及脱脂乳(skimmilk)组成的组中选择的至少一种，作为一具体例，阻断分子可以为BSA(Bovine Serum Albumin)。

阻断分子黏附在基板表面上进而可以发挥更恒定地保持生物受体的定向的作用。据此，生物受体的结合部位容易露出进而可以促进与靶物质的结合。

此外，阻断分子结合于生物受体所在的基板的其余位点(site)，从而可以防止金属纳米粒子直接与基板或者生物受体结合。

接下来，为了进行根据本发明的离心分离涂覆，基板或者已形成一次捕获结构的基板设置在离心机的内部。在此，设置基板的离心机可以意味着离心分离用管(tube)，优选地，将基板设置在远离离心机的底部的位置。更详细地，为了使离心分离用管的底面平坦，可以将由PDMS等材料制成的支撑物(support)位于管的底面，且可以将所述基板平坦地放置。

进一步地，为了在已形成一次捕获结构的蛋白质的表面上涂覆金属纳米粒子，可以在所述离心机(或者离心分离用管)放入包含金属纳米粒子的溶液。

所述溶液内包含的金属纳米粒子可以是从由金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)及铝(Al)组成的组中选择的至少一种，并不限于此，但作为一具体例，金属纳米粒子可以为金(Au)纳米粒子。在由所述金属进行制备的情况下，根据本发明的基板具有优秀的信号增幅能及信号均匀性。

一方面，金属纳米粒子的直径可以是在平均10至100nm的范围之内，金属纳米粒子的直径可以是20至95nm，40至90nm，60至95nm或者是平均80nm。例如，在金属纳米粒子的直径小于10nm的情况下，可能不能进行通过离心分离使纳米粒子沉淀的过程，在金属纳米粒子的直径大于100nm的情况下，可能难以认为通常的可合成的纳米粒子的范围。

包含所述金属纳米粒子的溶液的浓度可以是在平均1×10

完成离心机内的基板设置及金属纳米粒子溶液放入，则可以通过操作离心机在靶物质的表面上进行金属纳米粒子涂覆。

更具体的，形成二次捕获结构体的步骤可以在1000×g至6000×g的范围和2至5分钟的范围内操作离心机。作为一具体例，可以将平均80nm的金纳米粒子在1000×g进行3分钟。

通过这种离心分离过程，在形成二次捕获结构体的步骤中，靶物质被夹入到生物受体与金属纳米粒子之间，从而可以形成捕获结构体。即，可以形成“三明治免疫复合体”。在本发明中“三明治免疫复合体”是旨在通过抗体-抗原-抗体反应结合的免疫复合体，由于抗原夹入到抗体中间以使其具有三明治形状而被命名。在本发明中，所述三明治免疫复合体可以包括生物受体-靶物质-金属纳米粒子的结构。此时，通过离心分离金属纳米粒子接近管底面上的靶物质，然后通过靶物质和金属纳米粒子之间的静电、疏水性相互作用、氢键、范德华力(van der Waals forces)、位阻(steric hindrance)在靶物质黏附纳米粒子而进行涂覆。

特别地，在现有技术中大部分是靶物质和金属纳米粒子由抗体保持数十nm的间距，但在本发明中金属纳米粒子直接涂覆于靶物质上，从而靶物质和金属纳米粒子之间形成小于1nm的间距，可以放大及提高非常优秀的SERS信号。

作为所述离心分离过程的形成二次捕获结构体的步骤可以被重复进行3次以上。更具体的，所述离心分离过程可以重复进行3至7次，3至6次，3至5次或4次。作为一特定示例，随着离心分离的重复过程的增加，后述的基于SERS的靶物质检测过程中的信号也可以增加。但是，由于经过重复该过程约4次左右后信号放大饱和，考虑到检测再现的容易性和经济性，所述离心分离过程优选地是重复进行4次。

同时，行程二次捕获结构体的步骤以后，还可以包括在所述金属纳米粒子的表面上黏附拉曼染料(Raman dye)的步骤。拉曼染料是为了通过表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering:SERS)分光法的检测的物质，意味着拉曼活性有机化合物，只要是在本技术领域中广泛使用的物质则可以不受限制地使用任何物质。

例如，可以从由可以从由MGITC(孔雀石绿异硫氰酸酯)、RBITC(罗丹明B异硫氰酸酯)、罗丹明6G、腺嘌呤、4-氨基-吡唑(3,4-d)嘧啶、2-氟腺嘌呤、N6-苯甲酰腺嘌呤、激动素、二甲基-烯丙基-氨基-腺嘌呤、玉米素、溴-腺嘌呤、8-氮杂-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤、4-巯基吡啶、6-巯基嘌呤、4-氨基-6-巯基吡唑(3,4-d)嘧啶、8-巯基腺嘌呤、9-氨基-吖啶及其混合物组成的组中选择，但并不限于此。

图3是显示根据本发明的一实施例的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的示意图的图。

参考图3，根据本发明的基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板100包括：

黏附生物受体120的基板110；

通过生物受体120捕获的靶物质130；

加盖靶物质130的金属纳米粒子140；及

黏附在金属纳米粒子140的拉曼染料(未图示)。

靶物质被夹入到生物受体与金属纳米粒子之间，从而形成捕获结构体为特征。

再次，“黏附生物受体120的基板110”可以意味着通过基板110的表面处理固定有生物受体120的基板110。

黏附生物受体120的基板110，可以是由表面改性物质进行表面改性的基板110，例如，可以是在由氨基(-NH2)改性的基板上黏附生物受体120的基板。

进一步地，“生物受体”对靶物质具有特异性，是固定于基板110上从而可以捕获靶物质130的，可以包括对靶物质130具有结合亲和力(binding-affinity)的物质。例如，生物受体120可以是“抗体(antibody)”，所述抗体意味着可以结合在靶物质130的由氨基酸和糖链结合的蛋白质。

所述生物受体120不限于此种类，作为一具体例，可以是由蛋白质抗体、适体、酶、核酸、DNA、RNA、细胞、细胞模仿体(biometic)、蛋白质、有机化合物及聚合物组成的组中选择的至少一种，可以根据靶物质的种类选择合适的生物受体。例如，在靶物质为cyt C时，生物受体可以为蛋白质抗体。

同时，所述基板110可以是从由硅(Si)、砷化镓(GaAs)、玻璃(glass)、石英(Quartz)及聚合物(polymer)组成的组中选择的至少一种非金属物质。并不限于此，但作为一具体例基板可以为玻璃(glass)

一方面，基板110的表面中，未黏附生物受体120的部分上还可以包括阻断分子121。阻断分子121可以是从由BSA(Bovine Serum Albumin)、酪蛋白(casein)及脱脂乳(skim milk)组成的组中选择的至少一种，作为一具体例，阻断分子121可以为BSA(BovineSerum Albumin)。

并且，金属纳米粒子140可以是从由金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)、锡(Sn)、铟(In)、镓(Ga)、铊(Tl)、铅(Pb)、铋(Bi)及铝(Al)组成的组中选择的至少一种，并不限于此，作为一具体例，金属纳米粒子140可以为金(Au)纳米粒子。

一方面，金属纳米粒子140的直径可以在平均10至100nm的范围之内，金属纳米粒子140的直径可以是20至95nm，40至90nm，60至95nm或者平均80nm。例如，在金属纳米粒子的直径小于10nm的情况下，可能不能进行通过离心分离使纳米粒子沉淀的过程，在金属纳米粒子的直径大于100nm的情况下，可能难以认为通常的可合成的纳米粒子的范围。

此时，靶物质上可以由金属纳米粒子140形成金属层，且所述金属层的厚度可以为平均10至100nm。

在现有技术中大部分是靶物质13和金属纳米粒子140由抗体保持数十nm的间距，但在本发明中金属纳米粒子140直接涂覆于靶物质130上，从而靶物质130和金属纳米粒子140之间形成小于1nm的间距，可以放大及提高非常优秀的SERS信号。

本发明提供使用基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板而检测靶物质的方法。

所述靶物质的检测可以通过SERS分光法进行。在这种情况下，通过测定由在所述基板上结合靶物质而发生的拉曼散射的强度，可以进行靶物质的定量分析。

可供参考的是，SERS是通过在金属纳米粒子的表面上放大光入射物质时根据分子的振动状态所发送的固有的SERS信号而获得的。各物质所具有的特异性最近经常用于SERS信号定性测定身体物质等方面。根据本发明，可以通过表面增强拉曼散射法(SurfaceEnhanced Raman Scattering,SERS)测定平均500至2000cm

所述靶物质可以为蛋白质、核酸、DNA、RNA、酶、有机分子、病毒、细胞外囊泡(extracellular vesicles)、微囊泡(Microvesicles)、外泌体(Exosomes)、细胞、脂肪、代谢物或病原体，更具体的，靶物质可以为蛋白质，且作为一具体例，可以为蛋白质。

即，本发明可以通过离心分离使金属纳米粒子与靶物质黏附从而强化SERS信号提高检测灵敏度，可以提供为了靶物质检测的SERS信号改善方法，其包括：(a)反应黏附与靶物质特异结合的生物受体的基板和靶物质，形成一次捕获结构体(生物受体-靶物质)的步骤；及(b)在包含金属纳米粒子的溶液的存在下使形成所述一次捕获结构体的基板离心分离，从而形成具有生物受体-靶物质-纳米粒子的三明治结构的二次捕获结构体的步骤。

在本发明中，SERS信号改善包括信号放大的意思，被放大的SERS信号可以有助于提高靶物质的检测灵敏度。

此外，本发明提供利用所述SERS信号改善方法检测靶物质的方法。

以下，由实施例和实验例更详细地说明本发明。

但是，以下实施例和实验例仅是对本发明的说明，本发明的内容不限于以下实施例和实验例。

[实施例]蛋白质传感器的制造

步骤1：靶蛋白质的黏附

用于为了在基板上固定为抗原-抗体反应的靶蛋白质的玻璃基板蛋白质芯片的表面处理法应用了在“One-step antibody immobilization-based rapid and highly-sensitive sandwich ELISA procedure for potential in vitro diagnostics.”(Scientific reports,2014,4,4407.)中介绍的方法。

参考图4，说明在基板上的靶蛋白质的黏附过程。

首先，用水和乙醇洗涤5cm×5cm的盖玻片，并进行干燥。然后，为了使所述基板羟化(hydroxylate)在食人鱼溶液(溶液(H2SO4:H2O2＝7:3(v/v))中浸入30分钟，用水进行洗涤后，在混合1％的3-氨丙基三甲氧硅烷(3-Aminopropyltrimethoxysilane，APTMS)和8μg/ml的抗体稀释液的乙醇溶液中浸入30分钟，从而使表面有机硅烷(organosilane)，即，使基板氨基功能化并黏附生物受体。

然后，在1％的BSA(bovine serum albumin)溶液中浸入30分钟而阻断(blocking)未黏附抗体的部分的APTES。并且，将基板浸入包含作为抗原的cyt C的溶液中引导免疫结合，从而制造黏附靶蛋白质的基板。

步骤2：纳米粒子的黏附

图5是显示在本发明的实施例中，基于离心分离的纳米粒子黏附过程的图((a)为离心分离前，(b)为离心分离后)。

参考图5，将由PDMS等材料制成的支撑位于管的底面上，且平坦地放置在步骤1中制备的结合了靶蛋白质抗原的基板，以使离心分离用管的底面平坦。

并且，在所述管内填充400μl的具有80nm的平均直径的金纳米粒子(BBI gold)胶质溶液后进行离心分离。此时，离心分离的条件设置为在1000×g进行3分钟。

接下来，从管取出已制备的蛋白质传感器且用蒸馏水进行洗涤后，用氮气进行干燥。

图6的左侧为离心分离后的基板的扫描电子显微镜(SEM)照片，图6的右侧为离心分离后的基板的暗视野显微镜照片。如图6所示，可以确认金纳米粒子均匀黏附在步骤1的基板上。

[比较例]

在金纳米粒子上固定抗体且黏附作为抗原的cyt C，从而制造蛋白质传感器。

更具体的，向通过食人鱼溶液(H2SO4:H2O2＝7:3(v/v))洗涤的玻璃基板提供金纳米粒子溶液，进行干燥后将10mM MPA(mercaptopropionic acid)处理12小时并洗涤。接下来，将以1:1的比例混合了0.2M的EDC和0.2M的NHS的溶液处理1小时，通过洗涤过程制造可以黏附抗体的基板。并且，将0.1mg/ml的抗体处理1小时后进行洗涤而在基板上导入抗体。

然后，为了阻断将1％(w/v)BSA处理20分钟后黏附作为抗原的cyt C而制造蛋白质传感器。

<实验例>

实验例1.通过重复离心分离过程的信号放大

制造蛋白质传感器时重复离心分离过程，从而在黏附靶蛋白质的基板重复纳米粒子黏附过程。并且，确认了根据重复过程(循环数)的基板的SEM照片和可视颜色，测定了靶蛋白质的SERS信号。

其结果在图7中显示。

图7(a)是显示离心分离过程的示意图，图7(b)是根据离心分离重复(循环数)的基板的颜色变化和SEM照片，图7(c)是显示根据离心分离重复(循环数)的靶蛋白质的SERS信号的曲线图。

参考图7(a)、7(b)，可以通过SEM照片和可视颜色确认随着重复纳米粒子黏附过程而被黏附的纳米粒子的数逐渐增多。

此外，参考图7(c)，其显示随着离心分离重复(循环数)的增加靶蛋白质的SERS信号也增加，可以确认重复进行3次左右后信号增幅减小。

即，可以知道通过3次左右的重复过程可以进行足够的信号放大。

实验例2.纳米粒子涂覆均匀性分析

通过APTES将金纳米粒子适用到导入氨基的表面上，处理4-氨基苯硫酚(4-ATP：4-aminothiophenol)从而涂覆了SERS探测表面。

并且，分析了光谱。更具体的，分析了将检测点每移动2μm至总计120μm的光谱，且在随机设置的检测点分析光谱。其结果在图8中显示。

图8(a)是显示分析将检测点每移动2μm至总计120μm的光谱的结果的曲线图，图8(b)是显示在随机设置检测点分析光谱的结果的曲线图。

参考图8，分析将检测点每移动2μm至总计120μm的光谱的结果显示，从基板得出的4-ATP的信号非常均匀。

同时，从随机设置的检测点中获得信号的结果也显示相同结果，由此可以确认本发明的技术是制造均匀的基板的技术。

实验例3.靶蛋白质的信号检测

通过利用在实施例和比较例中制备的蛋白质传感器的表面增强拉曼散射法(Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)检测了C-反应蛋白质(靶蛋白质)的信号。

具体而言，使用拉曼显微镜(Nicolet Raman spectrometer(Almeca XR))观察了表面增强拉曼散射法光谱(SERS spectra)，使用此，计算了抗原信号检测效率。

并且，其结果在图9中显示。

图9是显示利用在实施例和比较例中制备的蛋白质传感器检测靶蛋白质信号的结果的曲线图((a)为实施例，(b)为比较例)。

可以通过以下[式1]计算抗原信号检测效率。

[式1]

S

在此，S

W

W

由蛋白质传感器检测的信号将显示为抗原(cytochrome c)的拉曼信号和抗体的信号的线性组合。因此，在首先只黏附抗体的情况下获得抗体的SERS信号，进行寻找与将个别地获得的抗原(cytochrome c)的拉曼信号和抗体的信号线性组合而检测的信号最相近的信号的实验。

其结果可以确认实施例中制备的蛋白质传感器相对于比较例中制备的蛋白质传感器具有更优秀的抗原信号检测效率。更具体的，比较例中只包括3.61％左右的抗原信号，相反，通过本发明的实施例检测的信号包括高6倍左右的抗原信号。

综上所述，可以判断为本发明的蛋白质传感器由于金纳米粒子单一层与靶蛋白质直接黏附，从而金纳米粒子与靶抗原(靶蛋白质)之间的间隔小，相对于比较例具有优秀的信号检测效率。

产业上的可利用性

本发明涉及一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的靶物质检测用基板的制造方法等，通过提供本发明可以提高靶物质的检测灵敏度，本发明被期待广泛用于分子诊断检测法等。