基于普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应变化影响的研究方法

摘要

本发明公开了一种基于普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应影响的研究方法，包括以下步骤，S1：分析比较正常动物和慢性肾脏病动物肠道菌群组成和结构；S2：确定不同类型动物肠道中的优势菌群；S3：计算不同类型动物中有显著差异的微生物群落的LDA分值；S4：根据步骤S3的分析结果可知，普氏粪杆菌在慢性肾脏病动物肠道中含量较低；S5：分析普氏粪杆菌丰度与肾功能指标之间的相关性；S6：分析比较不同类型动物血液中肠道菌群代谢产物的变化；S7：分析研究普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应变化的影响。通过本发明中的研究方法，可以得出普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应变化的影响，为防治慢性肾脏病的研究提供新方向。

说明书

技术领域

本发明涉及动物肾脏炎症反应变化研究技术领域，尤其涉及基于普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应变化影响的研究方法。

背景技术

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是世界范围内危害人类健康的公共卫生问题。在全球流行病学调查中发现CKD的患病率高达8％-16％，并呈增长趋势，在我国，慢性肾病患病率高达10％-13％。慢性肾病发病率高、预后差，尤其存在多种合并症(如各种代谢异常、高血压、或其他脏器疾病，如冠心病等)不仅加重肾脏病的进展，同时可导致多器官如心脏、脑和血管的损害更加严重，不但致残、致死率高，且严重消耗医疗和社会资源，给家庭和社会都造成严重的负担。尽管我们积极控制原发病，减少相关并发症的发生，仍然无法阻止疾病的进一步发展。尤其CKD发展至终末期肾病，患者需要进行血液透析治疗或接受肾脏移植手术，不仅医疗费用昂贵，而且严重影响病人生活质量。CKD患者肾脏往往处于慢性炎症状态。这种持续炎症状态是CKD患者肾损伤和功能恶化的重要原因之一，同时也是心血管并发症的危险因素。因此，探索既能改善肾脏炎性损伤又对心血管并发症有防治作用的新靶点或新药物，对CKD患者的治疗尤为重要。

近年研究表明，肠道菌群失调在导致肾脏炎症反应和慢性肾脏病的进展中扮演着重要角色，尤其是补充益生菌对改善肾脏炎症反应具有潜在收益，为防治慢性肾脏病的研究提供了新方向。因此，进一步寻找改善CKD患者炎症反应的新型益生菌，研究其相关效应机制，是防治慢性肾脏病及其并发症的新策略，但是目前的研究中并没有明确与慢性肾脏病有关的菌群种类。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种基于普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应变化影响的研究方法，研究普氏粪杆菌对动物的肾脏炎症反应变化影响，从而为防治慢性肾脏病的研究提供新方向。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

基于普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应变化影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1：分析比较正常动物和慢性肾脏病动物肠道菌群组成和结构；

S2：确定正常动物和慢性肾脏病动物肠道中的优势菌群；

S3：计算正常动物和慢性肾脏病动物中有显著差异的微生物群落的LDA分值；

S4：根据步骤S3的分析结果可知，普氏粪杆菌在慢性肾脏病动物肠道中含量较低；

S5：分析普氏粪杆菌丰度与肾功能指标之间的相关性；

S6：分析比较正常动物和慢性肾脏病动物血液中肠道菌群代谢产物的变化；

S7：分析研究普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应变化的影响。

进一步的，所述慢性肾脏病动物包括慢性肾脏病1-4期动物和慢性肾脏病5期动物。

进一步的，步骤S1中分析比较正常动物和慢性肾脏病动物肠道菌群组成和结构的指标包括：肠道微生物厚壁菌门和拟杆菌门的比值、操作分类单元数、菌群丰富度、均一性和多样性。

进一步的，步骤S3中按影响性及关联性，以多样性分析中的组间比较分析算法计算正常动物和慢性肾脏病动物中有显著差异的微生物群落的LDA分值。

进一步的，步骤S5中所述的肾功能指标包括肾小球滤过率、血肌酐、血尿素氮、血尿酸和血胱抑素。

进一步的，步骤S6中所述的代谢产物包括乙酸、丁酸、丙酸、氧化三甲胺和内毒素。

本发明的有益效果是：

通过本发明中的研究方法研究普氏粪杆菌与动物肾脏炎症反应变化之间的关系，从而可以得出普氏粪杆菌可降低肾脏炎症反应，改善肾脏纤维化和损伤，为慢性肾脏病的防治研究提供了新的方向。

附图说明

图1为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人肠道菌群F/B比值对比结果；

图2为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人肠道微生物操作分类单元数对比结果；

图3为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人肠道微生物Ace指数对比结果；

图4为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人肠道微生物Chao1指数对比结果；

图5为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人肠道微生物Shannon指数对比结果；

图6为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人肠道微生物Simpson指数对比结果；

图7为本发明中在门的水平上，正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人菌群的相对比例对比结果；

图8为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人的菌群分支图；

图9为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人中有显著差异的微生物群落的LDA分值计算结果；

图10为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人间梭菌纲的相对丰度变化情况；

图11为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人间梭菌目的相对丰度变化情况；

图12为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人间瘤胃球菌科的相对丰度变化情况；

图13为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人间普雷沃氏菌科的相对丰度变化情况；

图14为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人间粪杆菌属的相对丰度变化情况；

图15本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人间罕见小球菌属的相对丰度变化情况；

图16本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人间无杆菌属的相对丰度变化情况；

图17为本发明中对Top30的属与肾小球滤过率、血肌酐、血尿素氮、血尿酸和血胱抑素的相关性进行分析的结果；

图18为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人血液中乙酸含量对比结果；

图19为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人血液中丁酸含量对比结果；

图20为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人血液中丙酸含量对比结果；

图21为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人血液中氧化三甲胺含量对比结果；

图22为本发明中正常人、CKD1-4期病人、CKD5期病人血液中内毒素含量对比结果。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

基于普氏粪杆菌对动物肾脏炎症反应变化影响的研究方法，包括以下步骤，

S1：分析比较正常人和慢性肾脏病病人肠道菌群组成和结构；具体分析比较的指标包括：菌群F/B(厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值)的比值、操作分类单元数、菌群丰富度、均一性和多样性，其中，菌群丰富度使用微生物Ace指数和微生物Chao1指数表示，菌群均一性使用微生物Shannon指数表示，菌群多样性使用微生物Simpson指数表示。

所述慢性肾脏病动物包括慢性肾脏病1-4期动物和慢性肾脏病5期动物。

在本实施例中，选取正常人n＝30例，CKD1-4期病人n＝32例和CKD5期病人n＝43例对其菌群F/B的比值、操作分类单元数、微生物Ace指数、微生物Chao1指数、微生物Shannon指数和微生物Simpson指数进行比较，结果如附图1-6所示，在门的水平上，比较分析正常人、CKD1-4期病人和CKD5期病人菌群的相对比例，结果如附图7所示，在附图7中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。Control：正常人；CKD1-4：慢性肾脏病1-4期病人；CKD5：慢性肾脏病5期病人。

从附图1中可以看出，与正常人相比，慢性肾病病人菌群F/B的比值升高，提示慢性肾病病人肠道菌群紊乱；从附图2-6中可以看出，与正常人相比，慢性肾病病人菌群操作分类单元数(OTU)、菌群丰富度(Ace richness和Chao1richness)、均一性(Simpsondiversity)和多样性(Shannon diversity)降低；与正常人相比，慢性肾病病人肠道菌群紊乱，菌群丰富度和多样性降低。附图7为在门的水平上，比较分析三组菌群的相对比例，发现与正常人相比，慢性肾病病人拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度降低，厚壁菌门(Firmicutes)丰度升高。

S2：确定正常人和慢性肾脏病病人肠道中的优势菌群；

具体的，正常人、CKD1-4期病人和CKD5期病人的菌群分支图如附图8所示，附图8中显示出了正常人、CKD1-4期病人和CKD5期病人的优势菌群，其中，正常人肠道中优势菌群包括梭菌纲(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、无杆菌属(Agathobacter)、真细菌属(Eubacterium__coprostanoligenes_group)、普雷沃菌属(Prevotella_9)、Dorea属、罗斯氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌属(Ruminococcaceae_UCG_002)、啮齿真杆菌属(Eubacterium__ruminantium)、梭菌属(Butyricicoccus)；慢性肾病1-4期病人肠道中优势菌群包括瘤胃球菌属(Ruminococcaceae_UCG_009)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus__gnavus)、黄杆菌属(Flavonifractor)、Hungatella属；慢性肾病5期病人肠道中优势菌群包括腔隙杆菌属(Lachnoclostridium)、真杆菌(Eubacterium__ventriosum)。

S3：计算正常人和慢性肾脏病病人中有显著差异的微生物群落的LDA分值；

具体的，按影响性及关联性，以多样性分析中的组间比较分析算法计算正常人和慢性肾脏病病人中有显著差异的微生物群落的LDA分值，结果如附图9所示，其中，有显著差异的微生物群落也即步骤S2中确定出来的正常人、CKD1-4期病人和CKD5期病人各自的优势菌群。

附图10-16为通过LefSe(LDA>4)分析得到菌群相对丰度的变化，其中，附图10为正常人与慢性肾脏病病人间梭菌纲的相对丰度，附图11为正常人与慢性肾脏病病人间梭菌目的相对丰度，附图12为正常人与慢性肾脏病病人间瘤胃球菌科的相对丰度，附图13为正常人与慢性肾脏病病人间普雷沃氏菌科的相对丰度；附图14为正常人与慢性肾脏病病人间粪杆菌属的相对丰度；附图15为正常人与慢性肾脏病病人间罕见小球菌属的相对丰度；附图16为正常人与慢性肾脏病病人间无杆菌属的相对丰度；在属水平上，Faecalibacterium(含量为13.63％)、Subdoligranulum(含量为7.04％)和Agathobacter(含量为6.65％)在正常人肠道中含量较高的细菌属在CKD1-4期病人或CKD5期病人肠道中含量较低。尤其是粪杆菌属(Faecalibacterium)和罕见小球菌属(Subdoligranulum)含量高，组间差异明显。

S4：根据步骤S3的分析结果可知，普氏粪杆菌在慢性肾脏病病人肠道中含量较低；

S5：分析普氏粪杆菌丰度与肾功能指标之间的相关性，所述肾功能指标包括肾小球滤过率、血肌酐、血尿素氮、血尿酸和血胱抑素；

具体的，对Top30的属(在属的水平，正常人和慢性肾脏病病人显著差异的微生物群落)与肾小球滤过率、血肌酐、血尿素氮、血尿酸和血胱抑素的相关性进行分析，结果如附图17所示，从附图17中可以看出，普氏粪杆菌的丰度与慢性肾脏病病人临床指标变化相关性最高。

S6：分析比较正常人和慢性肾脏病病人血液中肠道菌群代谢产物的变化；所述的代谢产物包括乙酸、丁酸、丙酸、氧化三甲胺和内毒素。

附图18-20分别为正常人、CKD1-4期病人和CKD5期病人血中乙酸、丁酸和丙酸的含量，从附图18-20中可以看出，与正常人相比，CKD1-4期病人和CKD5期病人血中短链脂肪酸含量降低，尤其是丁酸变化显著；附图21和22为三类人群血中氧化三甲胺和内毒素的水平，与正常人相比，CKD1-4期病人和CKD5期病人血中氧化三甲胺和内毒素水平升高。

S7：分析研究普氏粪杆菌对肾脏炎症反应变化的影响。

具体的，普氏粪杆菌在正常人和动物肠道中丰度较高，慢性肾病病人中丰度降低，尤其在慢性肾病末期病人中；普氏粪杆菌通过增加其代谢产物丁酸的含量，抑制肾脏炎症因子的生成，减缓肾脏炎症反应。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。