一种防治食管狭窄的可降解支架

摘要

本发明涉及一种防治食管狭窄的可降解支架，属于医疗器械技术领域。包括负载PLGA/曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原的贴膜材料和可降解支架；可降解支架的外周设有负载PLGA和曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原的贴膜材料。本发明的可降解支架主要用于食管良性狭窄的预防与治疗，尤其是内镜黏膜下剥离术(Endoscopic Submucosal Dissection,ESD)治疗食管早癌的术后创面，以及胸外科食管术后吻合口狭窄和食管化学损伤后的疤痕挛缩狭窄等一系列的良性狭窄问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种防治食管狭窄的可降解支架，属于医疗器械技术领域。

背景技术

食道癌是我国高发的一种消化道肿瘤，2015年的癌症数据统计，我国食道癌新发病例数超过世界总新发病例的一半，更是我国排名前五的致死肿瘤之一[1]。近年来，受益于NBI(narrow band imaging,窄带成像)放大内镜技术和ESD(endoscopic submucosaldissection,内镜黏膜下剥离术)技术以及消化道早癌筛查普及，使得我国食道癌早期诊断及治疗获得了长足的进步。ESD是内镜消化道早癌切除的技术，其在保证切缘洁净的基础上具有安全、微创等特点，研究表明对于食道黏膜内癌，ESD同比外科手术有着类似的生存获益[2]。随着ESD推广而带来的食管病变内镜术后良性狭窄逐年递增。由于食道的管腔结构，对于大范围黏膜剥离的患者，其生理性的疤痕修复过程往往会造成不可逆的管腔狭窄进而引起严重的进食困难，不同研究表明食道半周以上ESD患者在无干预措施条件下发生显著狭窄的概率约为70％-90％，且狭窄程度与剥离半径范围正相关[3-4]。这些病例虽然不是恶性疾病，但因为无法进食甚至进水而基本丧失劳动能力，需要家人看护甚至静脉营养维持，同时这部分患者因为生存预期远远大于恶性疾病患者，所以病程中往往会耗费更多的社会医疗资源，有些患者最后不得不行胃造瘘手术，影响终身。倘若能妥善解决ESD术后食管狭窄，就能让这部分人群重新获得不打折扣的健康，使其完全融入正常人的社会生活中。

1.食管ESD术后狭窄的治疗现状；

食管ESD术后创面的修复愈合以及疤痕形成的分子机制比较复杂，炎症在其中起到了重要作用，当组织受到各种化学、机械损伤后，炎症细胞发生活化，促进创面愈合和修复，当此过程短暂而有序时，组织重构完好；而一旦损伤变迁延，过度活化的炎症细胞尤其是单核巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子及生长因子(TNF-α，IL-6，TGF-β1)作用于成纤维细胞使其分化为肌成纤维细胞，分化的肌成纤维细胞大量表达骨架蛋白α-SMA而具备了部分肌细胞的表型导致创面收缩，并大量分泌各型胶原蛋白，过量沉积的胶原蛋白形成胶原纤维导致纤维化疤痕形成[5-6]。食管逐渐狭窄，约2周狭窄形成，再加上食管无气管软骨这样的结构提供径向支撑力塑造形状，所以疤痕形成后创面会一直狭窄至仅剩1-2mm的缝隙[7]。目前食管ESD术后狭窄的治疗主要包括物理力学层面的方法：内镜下扩张(如球囊、探条扩张)、放射状切开、支架置入；和直接作用疤痕产生的分子机制层面的方法：狭窄段局部注射曲安奈德等药物，或直接口服激素全身作用。其中内镜下扩张(如球囊、探条)需要短时间内多次扩张才有效果，且对复杂性狭窄治疗效果有限，狭窄复发率较高[8]。内镜下放射状切开狭窄段的主要作用机制同内镜下球囊或探条扩张术，风险相对较高，且目前效果并不优于内镜球囊扩张等治疗[9]。临床上支架置入主要为植入金属支架，是治疗复杂食管狭窄的“王牌”方法，但是金属支架作为异物长期滞留体内，容易引起食道壁炎症、黏膜过度增生以及损伤食管，刺激发生再狭窄，导致患者吞咽困难。因此ESD术后狭窄的病例，金属支架辅助食管完成重塑形后，支架没有继续存在的意义，需要二次手术回收支架。然而置入支架后由于上皮细胞增生，使支架易嵌顿于增生处，常常很难取出；同时金属支架在回收过程中，还会对食管造成二次损伤，导致其他并发症，并且首次置入后再狭窄率虽然低于内镜扩张的方法，但也达到50％以上[10]。现阶段改进支架的一个热点是设计研发一种新型可降解食管支架，在管腔内短期支撑狭窄，通过控制材料的降解速率，在人体特定的病理生理过程中完成它的治疗使命后，支架因为不断降解失去力学性能而崩解，最终在体内降解消失或碎片化胃肠道排出，避免了长期异物影响带来的并发症，以及再取出支架的痛苦[11]。药物应用上系统性口服激素和创面注射都有一定效果[12-13]。其抗纤维化作用一方面来源于对巨噬细胞等炎症细胞功能的抑制[14]，一方面则来源于直接对成纤维细胞分化的阻碍[15]。相较而言，ESD创面局部注射长效激素(曲安奈德)操作简便，药物使用量较少，不会引起明显的全身免疫抑制，产生骨质疏松、股骨头坏死、糖代谢异常等[16]。由此可见，目前而言防治食管ESD术后狭窄的方法中最具发展前途的是研发新型支架和精准局部应用长效激素。

2.食管可降解支架的国内外研究现状

聚乳酸和聚二氧六环酮是食管可降解支架研究中最为广泛、生物相容性和力学性能较好的材料。其降解速度取决于分子量大小、亲水性以及周围环境的酸碱度[17]。国外Saito Y等人已有食管ESD术后植入可降解支架的病例研究，但样本量偏少。与普通支架类似，可降解支架一周后移位率达到80％，再狭窄率约50％。国内可降解支架的研究虽有跟进，但还未有产品进入临床。目前可降解支架放置时间多长才可以达到预期效果还不明确，一般推测可降解支架保持在合适的位置需要至少2-3周。可降解支架机械强度较差，以致其放置过程不同于金属支架，较为复杂，且置入后部分还需用辅助手段固定于食管壁上以防其移位脱落。作为食管良性狭窄的一种治疗方法还有待大样本量的研究[18-19]。所以，食管可降解支架虽然克服了传统支架的异物炎性反应，以及需要二次取出等不足，但单独应用长期效果并不明确，仍然需要进一步改进其力学性能、抗移位性能，目标使其在位时间超过2周。

3.曲安奈德防治食管ESD术后狭窄的研究现状

曲安奈德是目前临床上局部使用防治ESD术后狭窄最常用的激素药物，其抗炎作用强而持久，可抑制细胞的有丝分裂和DNA的合成，从而抑制瘢痕组织内的纤维细胞增生，减少胶原合成，增加胶原酶活性，加快胶原降解，防止粘连及瘢痕形成[20]。然而目前临床上较多的是一次性局部给药，药效持续时间偏短，需要反复给药，才有可能长时间维持有效药物浓度。术中单次注射曲安奈德虽可初始有效减轻局部炎症、抑制纤维组织增生，但当瘢痕形成达到高峰时，曲安奈德的药效已减弱达不到有效浓度，从而无法干预纤维化和疤痕的形成。若采取反复多次注射，又容易导致局部组织药物高浓度，造成局部肌肉萎缩、毛细血管扩张和溃疡形成等，进而有迟发性穿孔风险。此外，作为不同时期的纤维化，应用曲安奈德局部注射治疗所需的剂量其实是不同的，瘢痕形成时间越长所需的药物剂量越大[21]。鉴于此，为维持稳定而有效的药物浓度，确保在狭窄形成的各个阶段均有持续的炎症抑制作用，有必要开发一种长效的曲安奈德缓释体系，用于防治ESD术后狭窄。

4.局部精准缓释曲安奈德体系的研究现状

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是由两种单体聚合而成的高分子可降解有机化合物，具有良好的生物相容性以及成球、成膜特性，广泛应用于药物、多肽的包裹，是FDA认证的药物辅料。有报道在眼葡萄膜炎模型中，球内注射PLGA/曲安奈德纳米微球颗粒较之裸药有着更长的释放周期及更佳的治疗效果[22-23]，因此将PLGA作为曲安奈德的包裹材料构建缓释体系以治疗食道狭窄具有一定的理论依据。壳聚糖化学名聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，由于其结构类似于天然细胞外基质成分粘多糖(GAG)[24]且具有极高的生物相容性、可降解能力以及安全性，已被广泛应用于生物材料领域[25]。其具有促进巨噬细胞/多形核白细胞等炎症细胞活化的功能，进而被认为是一种促伤口修复因子[26]，另外基于壳聚糖的生物材料在真皮缺损修复以及真皮烧伤修复中有卓越功能[27-28]。同时，壳聚糖也被证明是一种黏膜黏附因子，可自发与多种动物细胞粘合[29]，并可促进大分子药物在小肠及鼻腔黏膜内的渗透[30]，C.Padula等人在猪食道黏膜体外模型中也证实了富含壳聚糖的微乳液显著提高了曲安奈德在黏膜内的渗透作用[31]。此外，虽然壳聚糖并没有显著抑制纤维化及疤痕形成的功能，但由于其优良的生物学性能，许多复合材料将其作为重要组成部分用以预防纤维化形成，如原位交联的壳聚糖透明质酸水凝胶可以显著改善外科术后粘连[32]。胶原蛋白(I,II,III,V，XI型)作为细胞外基质的最主要成分，由成纤维及肌成纤维细胞分泌，并形成网状纤维结构维持了皮肤、肌腱、黏膜下等组织的结构稳定，因而胶原蛋白已被作为一种表皮替代物[33]，而负载自体角化细胞的多孔胶原蛋白支架已被证明能够促进真皮的再血管化及愈合过程，在真皮创伤性修复过程中有着优异的效能[34]。在治疗食道狭窄领域，也有胶原蛋白的应用报道，Shigehisa Aoki等人证明，利用透明化处理的高密度胶原蛋白垫贴附ESD创面可以有效促进创面的再上皮化以及预防纤维化狭窄的形成[35]。因而，利用壳聚糖及胶原蛋白制备多孔骨架载体以负载包裹曲安奈德的PLGA微球，理论上可以促进细胞黏附，加强药物渗透并预防纤维化狭窄形成。然而，由于胶原蛋白特殊的理化特性，在成型后往往不具备稳定的力学性能且易短期降解，故需加入特定的交联剂将壳聚糖及胶原的游离氨基进行交联以获得稳定的结构。京尼平是栀子苷经β葡萄糖苷酶水解后的产物，作为交联剂，具有一定的交联强度且细胞毒性较小[36]。同时，京尼平作为一种天然抗炎因子，在胆汁淤积以及肝炎的治疗中已有相关应用[37]。此外，京尼平还具有抑制纤维化的作用，研究表明在肝脏中，京尼平能有效抑制肝星状细胞的活化，从而抑制了肝纤维化的形成[38]，而在另一个体外模型中，京尼平则能显著阻碍结膜下成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化[39]。因而，将京尼平作为壳聚糖胶原的交联剂不仅能够稳定材料结构，更有可能协同激素发挥抗纤维化预防狭窄的作用。所以研究并试制负载PLGA/曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原贴膜材料预期具有抑制疤痕形成的同时不使创面延期愈合的属性。

参考文献：

1.Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015.CACancer J Clin.2016；66(2):115-32.

2.Ono S,Fujishiro M,Niimi K,et al.Long-term outcomes of endoscopicsubmucosal dissection for superficial esophageal squamous cellneoplasms.Gastrointest Endosc.2009；70(5):860-6.

3.Ono S,Fujishiro M,Niimi K,et al.Predictors of postoperativestricture after esophageal endoscopic submucosal dissection for superficialsquamous cell neoplasms.Endoscopy.2009；41(8):661-5.

4.Katada C,Muto M,Manabe T,et al.Esophageal stenosis after endoscopicmucosal resection of superficial esophageal lesions.Gastrointest Endosc.2003；57(2):165-9.

5.Wynn TA,Ramalingam TR.Mechanisms of fibrosis:therapeutictranslation for fibrotic disease.Nat Med.2012；18(7):1028-40.

6.Honda M,Nakamura T,Hori Y,et al.Process of healing of mucosaldefects in the esophagus after endoscopic mucosal resection：histologicalevaluation in a dog model.Endoscopy.2010；42:1092-1095.

7.Nonaka K，Miyazawa M，Ban S,et al.Different healing process ofesophageal large mucosal defects by endoscopic mucosal dissection betweenwith and without steroid injection in an animal model.BMCgastroenterology.2013；13:72.

8.van Boeckel PG,Siersema PD.Refractory esophageal strictures:what todo when dilation fails.Curr Treat Options Gastroenterol.2015Mar；13(1):47-58.

9.龙思泽,曹磊,白一景,等.内镜下放射状切开术与球囊扩张术治疗食管吻合口良性狭窄的对比研究.国际消化病杂志,2019；39(5):363-5.

10.Tandon S,Burnand KM,De Coppi P,McLaren CA,et al.Self-expandingesophageal stents for the management of benign refractory esophagealstrictures in children:A systematic review and review of outcomes at a singlecenter.J Pediatr Surg.2019 Dec；54(12):2479-2486.doi:10.1016/j.jpedsurg.2019.08.041.Epub 2019 Aug 30.

11.Imaz-Iglesia I,García-Pérez S,Nachtnebel A,et al.Biodegradablestents for the treatment of refractory or recurrent benign esophagealstenosis.Expert Rev Med Devices.2016 Jun；13(6):583-99.doi:10.1080/17434440.2016.1184967.Epub 2016 May 18.

12.Yamaguchi N,Isomoto H,Nakayama T,et al.Usefulness of oralprednisolone in the treatment of esophageal stricture after endoscopicsubmucosal dissection for superficial esophageal squamous cellcarcinoma.Gastrointest Endosc.2011；73(6):1115-21.

13.Hanaoka N,Ishihara R,Takeuchi Y,et al.Intralesional steroidinjection to prevent stricture after endoscopic submucosal dissection foresophageal cancer:a controlled prospective study.Endoscopy.2012；44(11):1007-11.

14.Ehrchen JM,Roth J,Barczyk-Kahlert K.More Than Suppression:Glucocorticoid Action on Monocytes and Macrophages.Front Immunol.2019；10:2028.

15.Lee FT,Mountain AJ,Kelly MP,et al.Enhanced efficacy ofradioimmunotherapy with 90Y-CHX-A”-DTPA-hu3S193 by inhibition of epidermalgrowth factor receptor(EGFR)signaling with EGFR tyrosine kinase inhibitorAG1478.Clin Cancer Res.2005；11(19 Pt 2):7080s-6s.

16.Yang CH,Wu TS,Chiu CT.Chronic hepatitis B reactivation:a word ofcaution regarding the use of systemic glucocorticosteroid therapy.Br JDermatol.2007；157(3):587-90.

17.Kai Yang,Christopher Ling,Tianwen Yuan,et al.PolymericBiodegradable Stent Insertion in the Esophagus.Polymers(Basel).2016；May；8(5):158.Published online 2016 Apr 26.doi:10.3390/polym8050158.

18.Saito Y,Tanaka T,Andoh A,et al.Novel biodegradabIe stents forbenign esophageal strictures following endoscopic submucosal dissection.DigDis sci.2008,53:330-333.

19.Saito Y,Tanaka T,Andoh A,et al.Usefulness of biodegradable stentsconstructed of poly-l-lactic acid monofilaments in patients with benignesophageal stenosis.World J Gastroenterol.2007,13:3977—80.

20.Cho YW,Cho YN,Chung SH,et al.Water-soluble chitin as a woundhealing accelerator.Biomaterials.1999；20(22):2139-45.

21.Yamashina T,Uedo N,Fujii M,et al.Delayed perforation afterintralesional triamcinolone injection for esophageal stricture followingendoscopic submucosal dissection.Endoscopy.2013；45 Suppl 2 UCTN:E92.

22.Li W,He B,Dai W,et al.Evaluations of therapeutic efficacy ofintravitreal injected polylactic-glycolic acid microspheres loaded withtriamcinolone acetonide on a rabbit model of uveitis.Int Ophthalmol.2014；34(3):465-76.

23.Sabzevari A,Adibkia K,et al.Polymeric triamcinolone acetonidenanoparticles as a new alternative in the treatment of uveitis:in vitro andin vivo studies.Eur J Pharm Biopharm.2013；84(1):63-71.

24.Correlo VM,Boesel LF,Pinho E,et al.Melt-based compression-moldedscaffolds from chitosan-polyester blends and composites:Morphology andmechanical properties.J Biomed Mater Res A.2009；91(2):489-504.

25.Ueno H,Mori T,Fujinaga T.Topical formulations and wound healingapplications of chitosan.Adv Drug Deliv Rev.2001；52(2):105-15.

26.Boucard N,Viton C,Agay D,et al.The use of physical hydrogels ofchitosan for skin regeneration following third-degreeburns.Biomaterials.2007；28(24):3478-88.

27.Kweon DK,Song SB,Park YY.Preparation of water-soluble chitosan/heparin complex and its application as wound healingaccelerator.Biomaterials.2003；24(9):1595-601.

28.Guo R,Xu S,Ma L,et al.The healing of full-thickness burns treatedby using plasmid DNA encoding VEGF-165 activated collagen-chitosan dermalequivalents.Biomaterials.2011；32(4):1019-31.

29.Peh K,Khan T,Ch'ng H.Mechanical,bioadhesive strength andbiological evaluations of chitosan films for wound dressing.J Pharm PharmSci.2000；3(3):303-11.

30.Ahn JS,Choi HK,Chun MK,et al.Release of triamcinolone acetonidefrom mucoadhesive polymer composed of chitosan and poly(acrylic acid)invitro.Biomaterials.2002；23(6):1411-6.

31.Padula C,Telo I,Di Ianni A,et al.Microemulsion containingtriamcinolone acetonide for buccal administration.Eur J Pharm Sci.2018；115:233-9.

32.Li L,Wang N,Jin X,et al.Biodegradable and injectable in situcross-linking chitosan-hyaluronic acid based hydrogels for postoperativeadhesion prevention.Biomaterials.2014；35(12):3903-17.

33.Supp DM,Boyce ST.Engineered skin substitutes:practices andpotentials.Clin Dermatol.2005；23(4):403-12.

34.Tremblay PL,Hudon V,Berthod F,et al.Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skintransplanted on mice.Am J Transplant.2005；5(5):1002-10.

35.Aoki S,Sakata Y,Shimoda R,et al.High-density collagen patchprevents stricture after endoscopic circumferential submucosal dissection ofthe esophagus:a porcine model.Gastrointest Endosc.2017；85(5):1076-85.

36.Cauich-Rodriguez JV,Deb S,Smith R.Effect of cross-linking agentson the dynamic mechanical properties of hydrogel blends of poly(acrylicacid)-poly(vinyl alcohol-vinyl acetate).Biomaterials.1996；17(23):2259-64.

37.Cao H,Feng Q,Xu W,et al.Genipin induced apoptosis associated withactivation of the c-Jun NH2-terminal kinase and p53 protein in HeLacells.Biol Pharm Bull.2010；33(8):1343-8.

38.Inao M,Mochida S,Matsui A,et al.Japanese herbal medicine Inchin-ko-to as a therapeutic drug for liver fibrosis.J Hepatol.2004；41(4):584-91.

39.Kitano A,Saika S,Yamanaka O,et al.Genipin suppressessubconjunctival fibroblast migration,proliferation and myofibroblast transdifferentiation.Ophthalmic Res.2006；38(6):355-60.

发明内容

本发明的目的是为解决如何获得一种防治食管ESD术后狭窄的可降解支架的技术问题。为临床上体系化治疗食管ESD术后狭窄提供坚实的理论基础和实践经验，解决该疾病人群的临床迫切需要。进一步深度研发将载药缓释材料与可降解支架融合为一体的载药全覆膜可降解支架，同时可推动相关可降解、载药材料的产业化发展。

为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种防治食管狭窄的可降解支架，包括负载PLGA/曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原的贴膜材料和可降解支架；可降解支架的外周设有负载PLGA/曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原的贴膜材料。

优选地，所述可降解支架的主体材料包括聚乳酸，可降解支架通过静电纺丝编织工艺编织而成。

本发明提供的一种防治食管狭窄的可降解支架在治疗食管良性狭窄上的应用。

本发明提供的一种防治食管狭窄的可降解支架在治疗食管ESD术后狭窄上的应用。

本发明提供的一种防治食管狭窄的可降解支架在治疗胸外科食管术后吻合口狭窄和食管化学损伤后的疤痕挛缩狭窄上的应用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明的可降解支架，通过缓释曲安奈德抑制瘢痕组织内的纤维细胞增生，减少胶原合成，增加胶原酶活性，加快胶原降解，防止粘连及瘢痕形成；用于食管良性狭窄的预防与治疗，尤其是内镜黏膜下剥离术(Endoscopic Submucosal Dissection,ESD)治疗食管早癌的术后创面，以及胸外科食管术后吻合口狭窄和食管化学损伤后的疤痕挛缩狭窄等一系列的良性狭窄问题。为临床上体系化治疗食管ESD术后狭窄提供坚实的理论基础和实践经验，解决该疾病人群的临床迫切需要。为进一步深度研发将载药缓释材料与可降解支架融合为一体的载药全覆膜可降解支架，同时可推动相关可降解、载药材料的产业化发展。

附图说明

图1为本发明负载曲安奈德的PLGA微球光镜结构(a图和c图)以及电镜结构(b图和d图)。

图2为本发明裸的壳聚糖/胶原贴膜的光镜结构(a图)和电镜结构(c图和e图)；负载曲安奈德/PLGA微球的壳聚糖/胶原贴膜的光镜结构(b图)和电镜结构(d图和f图)。

图3为模拟在体内环境下载球贴膜材料的药物缓释能力；其中a图为PLGA/曲安奈德载药微球液相色谱药物释放曲线图；b图为负载曲安奈德/PLGA微球的壳聚糖/胶原贴膜的药物释放曲线图。

图4为贴膜材料对炎症细胞鼠巨噬细胞(Raw264.7)和纤维细胞成纤维细胞(L929)的影响；其中a图为对巨噬细胞(Raw264.7)的影响；b图为对成纤维细胞(L929)的影响。

图5为通过WB检测贴膜材料对炎症细胞，鼠巨噬细胞(Raw264.7)和纤维细胞，成纤维细胞(L929)的影响。其中a图为对巨噬细胞(Raw264.7)的影响；b图为对成纤维细胞(L929)的影响。

图6为贴膜材料对炎症细胞鼠巨噬细胞(Raw264.7)活性的影响；其中24h各组对巨噬细胞活性未有差异性(a图)，但C/C/P high组48h可对巨噬细胞有促进作用(b图)，C/C组和C/C/P组巨噬细胞calcein标记均多于对照组(c图)，相反PI指标上两者均低于对照组(d图),*：P＜0.05。

图7为贴膜材料对成纤维细胞(L929)活性的影响。其中C/C/P high组24h即有抑制成纤维细胞作用(a图)，48h各实验组除了C/C low组相较对照组均有抑制作用，C/C/P high组的抑制作用要强于C/C/P low组(b图)；C/C组和C/C/P组成纤维细胞calcein标记均低于对照组(c图)，相反PI指标上两者均高于对照组(d图),*：P＜0.05。

图8为贴膜材料对炎症细胞活化影响。图中对照组巨噬细胞呈圆形(a图)，LPS刺激下巨噬细胞可见触角生成(c图)，所有实验干预组均具有抑制其活化的能力(b图、d图、e图)，其中载药贴膜组比空载贴膜组能力更强(f图)，*：P＜0.05。

图9为贴膜材料对炎症细胞分泌因子影响。图中PCR方法测定各实验组炎症因子TGF-β1(a图)，IL-6(b图)和TNF-α(c图)的表达情况，ELISA方法测定各实验组炎症因子TGF-β1(d图)，IL-6(e图)和TNF-α(f图)的释放。各实验组均具有抑制炎症因子分泌的能力，其中C/C/P组相比空载贴膜组能力更甚，*：P＜0.05。

图10为贴膜材料可通过抑制炎症因子的释放而抑制纤维化。图中重组TGFβ-1诱导L929细胞向肌成纤维细胞分化，表现为α-SMA，胶原I及胶原III的表达显著增高，48h内空载贴膜和负载PLGA贴膜的浸出液并不能显著逆转这种活化，但是曲安奈德裸药可以抑制活化(a图、c图和e图)；而96h C/C和C/C/P组浸出液均可以显著逆转成纤维细胞的活化(b图、d图和f图)，*：P＜0.05。

图11为WB检测图，空载贴膜及载药贴膜均可以抑制TGFβ-1诱导的成纤维细胞活化。

图12为贴膜材料通过抑制炎症因子的释放而抑制纤维化的作用。图中分组：最左侧设为泳道1，在L929成纤维细胞中加入普通培养基及LPS；泳道2：在L929中加入未刺激的RAW264.7巨噬细胞上清及LPS；泳道3：在L929中加入LPS刺激24小时的RAW264.7上清；泳道4：在L929中加入用空载贴膜材料浸出液培养的LPS刺激的RAW264.7上清；泳道5：在L929中加入用载球贴膜浸出液培养的LPS刺激的RAW264.7上清；泳道6：在L929中加入曲安奈德裸药处理的LPS刺激的RAW264上清)，从而佐证了贴膜材料通过抑制炎症因子的释放而抑制纤维化的作用。

图13为于大鼠背部建立真皮缺损区(a图)，创面予以贴膜覆盖(b图)，再以纱布敷盖(c图)并固定(d图)，7天后观察(e图)并解剖取材分析创面。

图14为7天时间点解剖创面免疫组化分析巨噬细胞(CD68)，中性粒细胞(MPO)，TGF-β1以及α-SMA表达情况。

图15为各实验干预组创面巨噬细胞指标CD68表达均低于对照组(a图)；中性粒细胞指标MPO也低于对照组(b图)；同样增生指标TGF-β1(c图)以及α-SMA(d图)也偏低；同时，C/C/P组对于巨噬细胞、中性粒细胞及成纤维增生能力的抑制性要强于空载的C/C贴膜组；*：P＜0.05。

图16为42天时间点不同染色方法检测创面情况。联合曲安奈德/PLGA药物微球贴膜(壳聚糖/胶原蛋白)共同作用于创面，可有效抑制疤痕厚度及疤痕硬度。

图17检测创面情况：曲安奈德、空载贴膜及载药贴膜均抑制创面疤痕的收缩性，载药贴膜的抑制能力强于空载贴膜材料(a图)；创面疤痕厚度上各实验组小于对照组，载药贴膜抑制增生能力强于空载贴膜材料(b图)；6周后的疤痕组织中成纤维细胞量并没有统计学差异(c图)；*：P＜0.05。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：

如图1-17所示，本发明提供一种防治食管狭窄的可降解支架，包括负载PLGA/曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原的贴膜材料和可降解支架；可降解支架的外周设有负载PLGA/曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原的贴膜材料。可降解支架的主体材料包括聚乳酸，可降解支架通过静电纺丝编织工艺编织而成。本发明提供的一种防治食管狭窄的可降解支架可在治疗食管良性狭窄上应用。本发明提供的一种防治食管狭窄的可降解支架可在治疗食管ESD术后狭窄上应用。本发明提供的一种防治食管狭窄的可降解支架可在治疗胸外科食管术后吻合口狭窄和食管化学损伤后的疤痕挛缩狭窄上应用。

本发明以聚乳酸材料为主体通过静电纺丝编织工艺，制备食管可降解支架以及相应的支架释放装置(如表1)，并进行了体外实验及动物实验。通过体外降解试验，验证保证径向支撑力的同时调整可降解支架降解时间(崩解)为12周(如表2、3)。随后进行动物实验，申请人先期使用ESD方法对实验动物猪贲门上5cm的食管黏膜做3cm长的环周食管黏膜剥离来构建模拟临床客观实际的食管狭窄模型。ESD术后2-3周内镜下观察可见实验动物食管管腔狭窄，仅留1-2mm缝隙。确认动物模型建立成功后，行可降解支架置入，置入后密切观察，可见狭窄段被扩张开，至一周左右可见可降解支架移位至胃腔，狭窄段仍保持畅通(内镜可通过)。

前期可降解支架的动物实验结果认为单纯应用可降解支架虽然能克服传统支架的种种问题，但随着狭窄段被支架径向力扩张一段时间后不再狭窄，约7天左右可降解支架便会发生移位，后续研究通过金属夹辅助固定、改进支架形状直径、优化编织工艺、增加表面摩擦力等方法延长一定的支架在位时间，但支架移位最终是不可避免的。一旦支架从原狭窄段移位，狭窄段丧失了物理径向支撑力，但创面疤痕组织增生的时间跨度要大于支架暂时性解决狭窄问题的这“7天”，所以没有了支架的径向支撑力，疤痕组织的持续增生不可避免地会发生再次狭窄。因此单纯的通过物理的方法(支架)，而不从抑制疤痕组织增生的分子机制角度出发，仅能短时间解除狭窄，并不能达到长期效果，这也是临床上食管狭窄反复扩张却反复再狭窄的根本原因之一。因此不仅仅需要物理上的径向力去支撑狭窄段，同时还需要结合药物从分子机制上抑制纤维组织的增生才能对ESD术后狭窄治标治本。

本发明成功试制负载PLGA/曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原贴膜材料。通过电镜观察结构和液相质谱法检测药物浓度证实，本发明所试制的负载PLGA/曲安奈德缓释微球的京尼平交联壳聚糖胶原贴膜可以长期(高达3个月以上)有效释放曲安奈德。体外细胞实验证实，其通过抑制炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)释放细胞因子TNF-α，IL-6和TGF-β1等，抑制α-SMA表达，阻止胶原蛋白沉积，从而抑制了肌细胞的纤维化(图3-图12)。小动物皮肤疤痕修复的实验发现其在一周左右即对ESD创面具有明确的组织纤维化的抑制作用，并有中长期效果(图13-17)。

若联合应用，体系化防治食管狭窄，既可帮助载药贴膜紧密贴附创面7天以释放药效，又可解决可降解支架7天移位后再狭窄的问题，有望达到标本兼治的效果。

实施例

1.建立食管ESD术后狭窄动物模型

(1)使用上海白猪(15-20kg，雄性)，禁食一天后行插管麻醉，内镜黏膜下全周剥离贲门上5cm的食管黏膜，纵径长约3cm。

(2)内镜下食管环周ESD术后3、7、14、21、42d内镜观察效果，记录狭窄发生的时间及管腔直径。ESD术后约2-3周明确食管狭窄，内镜下可见食物残渣，清理后可见狭窄孔隙约1-2mm。

2.可降解支架

(1)对比国内外材料研究及临床实际需求，选择聚乳酸作为可降解支架的主体材料，应用静电纺丝编织工艺制备支架。

(2)结合临床需求和实验预计，设计支架规格形状、编织密度等特性，设计输送装置，生产制备，为后续改进提供经验。

(2.1).预实验支架尺寸信息。见表1：

表1.支架尺寸信息

(2.2)准备实验支架；

(2.3)准备实验输送器；

(3)对比测试三种类型食道支架，验证预实验样品力学性能。

使用Blockwise径向力测试仪(上海市医疗器械检测所)，对临床上使用的A覆膜金属支架，B金属裸支架以及本项目组预实验样品支架C，进行测试。

测试条件：加载速度0.1mm/s，测试温度37℃，循环次数3次。见表2：

表2.三种支架测试结果对比表

预实验结论：从力值分析可降解支架逊于金属腹膜支架样品A，但可降解支架样品C优于金属裸支架样品B。可降解支架样品C初始阶段柔软(力值小)，能随食道管径变化而变化，降低对食道壁的刺激；后期随管径降低能快速提升支撑力，满足食道狭窄治疗需求。

(4)加速降解支撑性能测试：

降解条件：55℃人工胃液中加速降解7天(模拟实际降解6周左右时间)测试结果提示径向力(上下均为曲面压头，支架扩口直径23mm，测试行程15mm)。见表3：

表3.降解前后支架的力学性能变化

预实验结论：所试制的可降解支架在6周的模拟环境中可以提供满足要求的径向支撑性。继续加速降解14天、21天，模拟置入体内3-6个月，可见支架出现降解、碎片化，符合预期。

(5)预实验样品支架用于食管狭窄动物模型实验

具体操作，食管狭窄动物模型应用可降解支架内镜下观察目标狭窄段，予以斑马导丝通过狭窄处后，导丝引导下置入扩张球囊，先行扩张狭窄段至10mm，可见创面渗血，随后使用输送器经导丝引导内镜下置入可降解支架，确认位置后，再以球囊扩张使可降解支架紧密固定于目标狭窄段，球囊扩张直径15mm，为防移位辅以金属夹固定；术后定期观察，约7天后内镜下可见支架移位，但目标狭窄段内镜仍可顺利通过，支架移位后2周可见狭窄段再次完全狭窄。术后7天左右可见可降解支架移位、食管管腔稍狭窄但内镜完全可通过；内镜下观察支架移位脱落至胃腔中，并见大量消化液浸泡支架，支架移位后约2周，食管原狭窄处再次狭窄，内镜不能通过并可见少量食糜。

预实验可降解支架动物实验结论：单纯从物理力学层面置入可降解支架虽可立即进行性扩张狭窄段至7天左右暂时性解决狭窄，但随后因狭窄解除后无压迫作用，支架移位难以避免，移位后不久原狭窄段再次狭窄。

3.研制分子机制层面上具有抑制疤痕增生效果的贴膜材料

(1)制备PLGA/曲安奈德缓释微球以及负载微球的壳聚糖胶原贴膜材料；PLGA/曲安奈德载药微球的制备：本发明采用经典的溶剂挥发法制备载药微球，并采用正交法分析不同制备条件(乳化剂/转速/挥发时间等)对微球的理化性质(粒径/溶胀能力/降解)及缓释能力的影响。

京尼平交联的壳聚糖胶原贴膜的制备：将壳聚糖粉末以及去端肽胶原蛋白按照(1：1)比例共溶于稀醋酸(2％)，辅以交联剂(0.1％京尼平)，并加入制备完成的载药微球，37℃交联不同时间后冻干，滴定至中性。

通过光镜和电镜观察PLGA/曲安奈德缓释微球的粒径(如图1)，以及负载曲安奈德/PLGA缓释微球京尼平交联的壳聚糖/胶原贴膜结构(如图2)。

(2)PLGA/曲安奈德缓释微球以及载球骨架缓释能力的测定

由于食道的特殊酸性环境，故体外测定不同食道pH状态下微球以及载微球贴膜对曲安奈德的缓释表现，模拟在体内环境下载球贴膜材料的药物缓释能力。

如图3所示：将PLGA/曲安奈德缓释微球及载球贴膜置于不同pH 5，6，7的磷酸盐缓冲液，选取时间点1，3，6，10，15，22，32，42……92天分别吸尽含药缓冲液并替换新缓冲液，HPLC测定不同时间点释放药量并绘制缓释曲线，比较不同pH以及支架对于微球缓释能力的影响。其中a图为PLGA/曲安奈德载药微球液相色谱药物释放曲线图和b图为负载曲安奈德/PLGA微球的壳聚糖/胶原贴膜的药物释放曲线图。

(3)体外细胞实验

①贴膜材料对炎症细胞和纤维细胞的直接影响：

分别培养鼠巨噬细胞(Raw264.7)和成纤维细胞(L929)进行CCK8细胞活性实验，并辅以Western blot检测，证明负载药物微球的贴膜材料可以促进炎症细胞活性同时抑制成纤维细胞活力。

如图4、5、6、7所示，附图中分组代表如下：NC空白培养基，C/C低壳聚糖/胶原贴膜2.5mg/ml材料浸出液，C/C高壳聚糖/胶原贴膜5mg/ml材料浸出液，C/C/P低壳聚糖/胶原/PLGA载药微球贴膜2.5mg/ml材料浸出液，C/C/P高壳聚糖/胶原/PLGA载药微球贴膜5mg/ml材料浸出液。

图4中C/C组和C/C/P组可以促进炎症巨噬细胞增值，抑制细胞死亡(如a图)；C/C组和C/C/P组在成纤维细胞中均抑制了细胞的增值和死亡，但比较而言其抑制增值更加明显(如b图)。

图5中的WB检测进一步验证了C/C组和C/C/P组相比对照组促进炎症细胞，抑制成纤维细胞。

图6为贴膜材料对炎症细胞鼠巨噬细胞(Raw264.7)活性的影响；图中24h各组对巨噬细胞活性未有差异性(如a图)，但C/C/P high组48h可对巨噬细胞有促进作用(如b图)，C/C组和C/C/P组巨噬细胞calcein标记均多于对照组(如c图)，相反PI指标上两者均低于对照组(如d图),*：P＜0.05。

图7为贴膜材料对成纤维细胞(L929)活性的影响；图中C/C/P high组24h即有抑制成纤维细胞作用(如a图)，48h各实验组除了C/C low组相较对照组均有抑制作用，C/C/Phigh组的抑制作用要强于C/C/P low组(如b图)；C/C组和C/C/P组成纤维细胞calcein标记均低于对照组(如c图)，相反PI指标上两者均高于对照组(如d图),*：P＜0.05

②贴膜对炎症细胞活化及分泌因子影响的进一步分析；

LPS刺激活化后的鼠巨噬细胞RAW264.7会从圆形变为成触角细胞，并分泌大量的致纤维化因子，但本发明的空载贴膜及载球贴膜均可抑制其活化，降低促进纤维化的细胞因子(TNF-α，IL-6和TGF-β1)的分泌。见图8、9：

图8、9中分组为con组不刺激，LPS组刺激24小时，LPS+C/C组LPS+含有5mg/ml壳聚糖/胶原贴膜浸出液的培养基共刺激24小时，LPS+C/C/P组LPS+含有5mg/ml壳聚糖/胶原/PLGA贴膜浸出液的培养基共刺激24小时，LPS+ta组LPS+含有同等曲安奈德裸药的培养基共刺激24小时。

如图8所示，对照组巨噬细胞呈圆形(如a图)，LPS刺激下巨噬细胞可见触角生成(如c图)，所有实验干预组均具有抑制其活化的能力(如b图、d图、e图)，其中载药贴膜组比空载贴膜组能力更强(如f图)，*：P＜0.05

如图9所示，为PCR方法测定各实验组炎症因子TGF-β1(如a图)，IL-6(如b图)和TNF-α(如c图)的表达情况，ELISA方法测定各实验组炎症因子TGF-β1(如d图)，IL-6(如e图)和TNF-α(如f图)的释放。各实验组均具有抑制炎症因子分泌的能力，其中C/C/P组相比空载贴膜组能力更甚，*：P＜0.05

③贴膜对成纤维细胞活化抑制作用：

成纤维细胞活化为肌成纤维细胞是纤维化发生的重要细胞事件，过程为各种炎症因子(特别是TGFβ-1)作用于成纤维细胞，导致其骨架蛋白α-SMA增高，因而细胞具有更大的收缩表型，并且分泌大量胶原蛋白导致疤痕形成。进一步的细胞实验分析推论，贴膜材料可通过抑制炎症因子的释放而抑制纤维化。如图10、11、12：

图10为重组TGFβ-1诱导L929细胞向肌成纤维细胞分化，表现为α-SMA，胶原I及胶原III的表达显著增高，48h内空载贴膜和负载PLGA贴膜的浸出液并不能显著逆转这种活化，但是曲安奈德裸药可以抑制活化(如a图、c图和e图)；而96h C/C和C/C/P组浸出液均可以显著逆转成纤维细胞的活化(如b图、d图和f图)，*：P＜0.05。

图11通过进一步WB检测，空载贴膜及载药贴膜均可以抑制TGFβ-1诱导的成纤维细胞活化。

图12为通过WB检测进一步研究贴膜是否通过抑制炎症细胞的活化，从而减少炎症因子的释放，进而抑制纤维化过程。用LPS刺激的RAW264.7细胞的上清(含有细胞因子)去刺激L929细胞，由于前面证明了48h内浸出液并不能直接显著抑制成纤维细胞的活化，因此选用48h作为节点以排除贴膜材料对成纤维细胞活化的直接干扰作用。图中分组自左向右，图中最左侧设为泳道1，在L929成纤维细胞中加入普通培养基及LPS；泳道2，在L929中加入未刺激的RAW264.7巨噬细胞上清及LPS；泳道3，在L929中加入LPS刺激24小时的RAW264.7上清；泳道4，在L929中加入用空载贴膜材料浸出液培养的LPS刺激的RAW264.7上清；泳道5，在L929中加入用载球贴膜浸出液培养的LPS刺激的RAW264.7上清；泳道6，在L929中加入曲安奈德裸药处理的LPS刺激的RAW264上清，从而佐证了贴膜材料通过抑制炎症因子的释放而抑制纤维化的作用。

(4)大鼠真皮缺损实验

(4.1)

7天时间点，所研究的贴膜材料可在分子机制层面上抑制巨噬细胞(CD68)，中性粒细胞(MPO)，TGF-β1以及α-SMA的表达。见图13、14、15：

图13为于大鼠背部建立真皮缺损区(如a图)，创面予以贴膜覆盖(如b图)，再以纱布敷盖(如c图)并固定(如d图)，7天后观察(如e图)并解剖取材分析创面。

图14为7天时间点解剖创面免疫组化分析巨噬细胞(CD68)，中性粒细胞(MPO)，TGF-β1以及α-SMA表达情况。

图15为各实验干预组创面巨噬细胞指标CD68表达均低于对照组(a图)；中性粒细胞指标MPO也低于对照组(如b图)；同样增生指标TGF-β1(如c图)以及α-SMA(如d图)也偏低；同时，C/C/P组对于巨噬细胞、中性粒细胞及成纤维增生能力的抑制性要强于空载的C/C贴膜组；*：P＜0.05。

(4.2).42天时间点，检测创面疤痕情况：联合曲安奈德/PLGA药物微球贴膜(壳聚糖/胶原蛋白)共同作用于创面，长期而言可有效抑制疤痕厚度及疤痕硬度。见图16、17：

图16为42天时间点不同染色方法检测创面情况。

图17为曲安奈德、空载贴膜及载药贴膜均抑制创面疤痕的收缩性，载药贴膜的抑制能力强于空载贴膜材料(如a图)；创面疤痕厚度上各实验组小于对照组，载药贴膜抑制增生能力强于空载贴膜材料(如b图)；6周后的疤痕组织中成纤维细胞量并没有统计学差异(如c图)；*：P＜0.05。

(5)联合应用：

(1)预防性使用：动物模型食管ESD术后立即予以载药贴膜覆盖，再以可降解支架压迫固定载药贴膜，用以预防食管ESD术后狭窄。

(2)治疗性使用：制备含有曲安奈德微球的载药全覆膜可降解支架，并应用于动物实验。

随着内镜诊疗技术的推广，食管肿瘤病灶越来越多地可以通过内镜黏膜下剥离术来治疗，但是随之而来的食管狭窄问题，成为术后影响病人生活质量的主要矛盾，迁延不愈，反过来也影响了内镜诊疗的深入发展与推广。同时，一些食管良性狭窄，比如胸外科食管癌术后吻合口的良性狭窄，广大农村较多见的误食强酸强碱导致的食管化学性灼伤而产生的炎性狭窄等，也是目前临床上亟待解决的难题。

食管良性狭窄病人，比如ESD术后狭窄，使用导丝通过狭窄段后，内镜下导丝引导通过输送器释放全覆膜可降解支架于狭窄段。另外可以作为预防性使用，在ESD术后，立即于ESD创面区使用该新型可降解支架作用于可能狭窄的节段。

内镜到达目标区域，留置导丝，导丝引导下通过输送器将全覆膜可降解支架放置于目标狭窄段或可能狭窄的创面，退镜。随后定期随访。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。