一种用于区分大蒜品种的RAPD引物及其应用

摘要

本发明公开了一种用于区分大蒜品种的RAPD引物，属于分子生物学分子标记领域。该方法通过设计筛选出的3个RAPD随机引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3所示，用于扩增未知大蒜品种的DNA，通过统计凝胶电泳后的谱带，区分出具有唯一特异性谱带的品种，并建立被区分品种的树形鉴别图。本发明的引物提高了RAPD反应的稳定性，操作简便，高效准确，节省引物，仅通过3次PCR就可轻松的将‘中蒜3号’等16个大蒜品种在分子水平上进行快速区分，所得到的品种鉴定图比聚类树更具有直观性，即根据品种鉴定图就可以快速找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现大蒜种苗早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用RAPD分子标记技术快速区分大蒜品种的方法。

背景技术

大蒜为百合科葱属植物球形鳞茎，起源于中亚地区，具有食用、保健、药用的功效，长期以来深受人们的喜爱，我国拥有世界上最大的大蒜种植面积，约占世界总种植面积 的30％多。品种资源丰富，南北方均有栽培，产量占世界总量的1/4多，因此，大蒜是 我国重要的出口创汇蔬菜之一，由于我国大蒜种质资源众多，再加上不同大蒜栽培地区 生态环境迥异，因此不同地区的栽培品种一般具有显著的区域适应性，形成了形态各异 的生态型，产生了众多地方品种，并形成了许多知名大蒜产区。因此，建立大蒜品种快 速可靠的鉴定技术体系对于大蒜品种遗传资源的研究保护、苗期鉴定、品种区分乃至大 蒜产业的持续发展等具有重要的意义。

DNA分子标记是随着分子克隆和重组DNA等生物技术迅速发展而产生的一类遗传标记，由于其直接建立在分子水平上，而不受外界环境、作物发育阶段、取样部位等因 素影响，其检出的多态性位点是无限的，故鉴定结果具有高度的可靠性，且重复性高， 鉴别力强。

由于目前传统单一的形态学品种鉴定方法已无法满足有效鉴别或区分当今日益增 多的品种的要求。分子标记的应用给作物遗传育种研究带来了巨大变化，同时也应用到了品种鉴定的研究中。在常用的RAPD、ISSR、SRAP和AFLP等众多分子标记技术中， 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)基于PCR技术，是 应用较早的分子标记技术之一，它以分析程序简便快捷，周期性短，不易受外界环境影 响，所需费用低，且无需对基因组序列进行预知等优点，已被普遍应用于指纹图谱构建、 种质资源的遗传基础研究、基因的快速定位、基因连锁标记、遗传多样性分析，品种分 类研究等方面。

现有的利用RAPD技术在进行蔬菜作物品种区分与种质鉴定的研究工作中，多采用计算机软件绘制数字化指纹图谱并结合统计学软件聚类分析得出聚类树，但是此聚类分析结果不但无法直观显示出区分品种的引物，无法显示鉴别过程，其操作量大，缺乏实 用性。

发明内容

发明目的：本发明需要解决的技术问题是提供一种利用RAPD技术区分大蒜品种的引物。

本发明还要解决的技术问题是提供上述引物在区分大蒜品种的应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于区分大蒜品种的RAPD引物，包括如下引物：

RP162：5’-TCTGTAGTCAGCCA-3’；

RP0581：5’-AGTCAGCTGGA-3’；

RP203：5’-AGCTGCTGAGTC-3’。

上述用于区分大蒜品种的RAPD引物在区分大蒜品种中的应用在本发明的保护范围之内。

其中，所述的大蒜品种包括：‘中蒜3号’、‘中蒜1号’、‘磨子蒜’、‘三季早’、‘日本大蒜’、‘硬软叶’、‘二季早’、‘正月早’、‘温二月’、‘灰叶子’、‘四六瓣’、‘苍山大蒜’、‘云 南紫皮大蒜’、‘二水早’、‘嘉定2号’、‘普陀大蒜’。

利用上述区分大蒜品种的RAPD引物区分大蒜品种的具体方法如下，包括如下步骤：

(1)提取大蒜叶片基因组DNA；

(2)利用RP162引物对步骤(1)得到的基因组DNA进行RAPD扩增，得到的PCR产 物用琼脂糖凝胶电泳检测，若在800bp、100bp处都出现特征性谱带，而在1200bp无特 征性谱带，大蒜的品种为‘三季早’；若在800bp、100bp、1200bp处都出现特征性谱带， 大蒜品种为‘正月早’；若在800bp处出现特征性谱带，而在1200bp、100bp处都未出现 特征谱带，则大蒜品种为‘日本大蒜’；

(3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用RP0581引物再对基因组DNA进行RAPD扩增，

若利用RP162引物扩增时，在1200bp处出现特征性谱带，而在800bp和100bp处 都未出现特征性谱带，RP0581引物扩增后使用如下方法判断大蒜品种：若利用RP0581 引物扩增时，在1500bp、500bp、200bp处都出现特征性谱带，其品种为‘二季早’；在200bp处出现特征性谱带，而在1500bp、500bp处都未出现特征性谱带，其品种为‘二水 早’；若在1500bp、200bp都出现特征谱带而在500bp未出现特征性谱带的，其品种为‘普 陀大蒜’；若在1500bp未出现特征性谱带，而在500bp、200bp处出现特征谱带，其品 种为‘中蒜3号’；若在1500bp出现特征性谱带，而在500bp、200bp都未出现特征谱带， 则进入步骤(4)；

若利用RP487引物扩增时，在800bp和1200bp处出现特征性谱带，而在100bp处 未出现特征性谱带，利用引物RP0581扩增后使用如下方法判断大蒜品种：经琼脂糖凝 胶电泳检测在2000bp、500bp处均出现特征性谱带，1000bp处未出现特征性谱带，其品 种为‘硬软叶’；若在2000bp、1000bp都出现特征性谱带，而500bp处未出现特征性谱带， 其品种为‘灰叶子’；若在1000bp、500bp出现特征性谱带，而2000bp处未出现特征性谱 带，其品种为‘云南紫皮大蒜’；若在1000bp出现特征性谱带，而2000bp、500bp都未出 现特征性谱带，则进入步骤(5)；

(4)利用RP0581引物进行RAPD扩增，若在1500bp出现特征性谱带，而在500bp、200bp都未出现特征谱带，RP203引物扩增后使用如下方法判断大蒜品种：

若在2000bp、500bp处都出现特征性谱带，其品种为‘磨子蒜’；若在2000bp处出现特征性谱带，500bp处未出现特征性谱带，其品种为‘四六瓣’；若在2000bp和500bp均 未出现特征性谱带的，其品种为‘嘉定2号’；

(5)利用RP0581引物进行RAPD扩增，若在1000bp出现特征性谱带，而2000bp、500bp都未出现特征性谱带，再用RP203引物进行RAPD扩增后使用如下方法判断大蒜 品种：

若在600bp、200bp处都出现特征性谱带的，其品种为‘温二月’；在600bp处出现特征性谱带，而在200bp未出现特征性谱带的，其品种为‘苍山大蒜’；若在200bp处出现 特征性谱带，其品种为‘中蒜1号’。

步骤(1)中，提取大蒜叶片基因组DNA的方法如下：

取大蒜幼嫩叶片0.2g，经液氮研磨，加入500μl CTAB裂解液，转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃， 12000r/min，离心8～10min，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1～2次，加入预冷异丙醇， 在4℃条件下静置3小时以上，收集絮状DNA用体积分数为70％的乙醇洗涤，干燥后 将絮状DNA溶于TE缓冲液中保存；

其中，所述的CTAB裂解液的组成如下：体积分数为2％CTAB，2mol/L NaCl

步骤(2)～(5)中，所述的RAPD扩增，其PCR反应体系为20μl，其中含基因组DNA50ng，MgCl

其PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40S，退火50S，72℃延伸90S， 40个循环；72℃延伸8min，然后于4℃保存；

其中，RP162引物的退火温度为44.1℃，RP0581的退火温度为43.6℃，RP203的 退火温度为42.4℃。

在PCR扩增仪上进行扩增，扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，紫外投射仪观察拍照得到扩增谱带。

本发明通过3个引物就能区分出16个不同大蒜品种，为了清晰、完整地表示鉴别采用的引物和鉴别出的品种，同时为了方便他人对大蒜品种进行区分、鉴定，本发明还 人工绘制了“树型植物品种鉴定图”。通过树形图表示各个品种区分的过程及相应品种， 通过标记引物名称和谱带的有无表示品种的鉴定方法和判断依据。本发明与现有技术不 同的是未采用“0-1”矩阵构建指纹图谱并进行聚类分析，通过对比谱带进行筛选，建立直 观的鉴定图谱。

有益效果：本发明的一种利用RAPD技术快速区分大蒜品种的方法，本发明方法操作简便，快速准确，3次PCR就能够将16个大蒜品种在分子水平上区分开，所得的品 种鉴定图比聚类树更具直观性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引 物，该方法可以实现大蒜种苗的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。

附图说明

图1是本发明16个大蒜品种的编号和品种名称；

图2是利用RP162和RP0581引物对16个大蒜品种进行区分鉴定的树型鉴别图；

图3是利用RP203引物进一步对7个大蒜品种进行区分鉴定的树型鉴别图。

图4是利用RP203引物进一步对7个大蒜品种进行区分鉴定的树型鉴别图。

图5是对研究大蒜品种进行RAPD扩增得到的部分DNA扩增图谱，横列是特征谱 带，纵列的数字与图1对应，M表示DNA marker；

图6是对研究大蒜品种进行RAPD扩增得到的部分DNA扩增图谱，横列是特征谱 带，纵列的数字与图1对应，M表示DNA marker。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：DNA的提取。

本发明的大蒜品种样品均是市面常见的重要大蒜品种，这16个品种包括：‘中蒜3号’、‘中蒜1号’、‘磨子蒜’、‘三季早’、‘日本大蒜’、‘硬软叶’、‘二季早’、‘正月早’、‘温 二月’、‘灰叶子’、‘四六瓣’、‘苍山大蒜’、‘云南紫皮大蒜’、‘二水早’、‘嘉定2号’、‘普 陀大蒜’。

取大蒜幼嫩叶片0.2g，经液氮研磨，加入500μl CTAB裂解液，转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃， 12000r/min，离心8～10min，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1～2次，加入预冷异丙醇， 在4℃条件下静置3小时以上，收集絮状DNA用体积分数为70％的乙醇洗涤，干燥后 将絮状DNA溶于TE缓冲液中保存；

其中，所述的CTAB裂解液的组成如下：体积分数为2％CTAB，2mol/L NaCl

实施例2：RAPD-PCR反应体系与条件。

RAPD-PCR反应体系为20μl，含50ng基因组DNA，2.0mmol·L

RAPD-PCR扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性40S，退火50S，72℃延伸90S， 40个循环；72℃延伸8min，然后于4℃保存。在PCR扩增仪上进行扩增，扩增产物采 用琼脂糖凝胶电泳(含有1.2％溴化乙锭)，1×TAE电泳缓冲液(1L中含有：0.242g Tris, 0.057ml冰醋酸，0.2ml 0.25mol/L EDTApH 8.0)。扩增后的DNA样品加入4μl 6×上样 缓冲液(含0.25％溴酚蓝、30％蔗糖)，在120V恒压下进行电泳0.5～0.8小时，使扩增 的DNA条带清晰明显分离为止，后紫外投射仪观察拍照得到扩增谱带。

实施例3：特异引物的严格筛选。

本发明的3个引物是在原先设计的38个随机引物经过严格筛选而得。先针对现有的大蒜品种的基因组设计38个随机引物，从中选取出13个碱基的多态性好、扩增性强、 稳定性高的RAPD随机引物，后通过连续两次梯度PCR选择条带一致的温度作为退火 温度。详细的说，梯度PCR反应体系为20μl，含50ng基因组DNA，2.0mmol·L

RP162：5’-TCTGTAGTCAGCCA-3’，退火温度44.1℃；

RP0581：5’-AGTCAGCTGGA-3’，退火温度43.6℃；

RP203：5’-AGCTGCTGAGTC-3’，退火温度42.4℃。

实施例4：大蒜品种的快速区分。

选用DNA多态性谱带在不同品种中的有无将大蒜品种进行区分，直到所有待鉴别的品种被单独分开为止。

通过“树型鉴别图”以更好的方便品种鉴定、统计工作。“树型鉴别图”是基于PCR扩增后的谱带形态统计出的结果，树型鉴别图以引物作为节点，节点后是该引物对不同品 种的区分结果，包括区分出的类别或者直接区分出来的品种，在节点后的分支还标记了 不同结果相互区分的依据，即谱带之间的区别。利用RP162、RP0581、RP203三个引物 对16个不同大蒜品种进行RAPD扩增，即可绘制出完整的树型鉴别图(如图1所示)， 具体区分步骤如下：

(1)提取大蒜叶片基因组DNA；

(2)利用RP162引物对步骤(1)得到的基因组DNA进行RAPD扩增，得到的PCR产 物用琼脂糖凝胶电泳检测，若在800bp、100bp处都出现特征性谱带，而在1200bp无特 征性谱带，大蒜的品种为‘三季早’；若在800bp、100bp、1200bp处都出现特征性谱带， 大蒜品种为‘正月早’；若在800bp处出现特征性谱带，而在1200bp、100bp处都未出现 特征谱带，则大蒜品种为‘日本大蒜’；

(3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用RP0581引物再对基因组DNA进行RAPD扩增，

若利用RP162引物扩增时，在1200bp处出现特征性谱带，而在800bp和100bp处 都未出现特征性谱带，RP0581引物扩增后使用如下方法判断大蒜品种：若利用RP0581 引物扩增时，在1500bp、500bp、200bp处都出现特征性谱带，其品种为‘二季早’；在 200bp处出现特征性谱带，而在1500bp、500bp处都未出现特征性谱带，其品种为‘二水 早’；若在1500bp、200bp都出现特征谱带而在500bp未出现特征性谱带的，其品种为‘普 陀大蒜’；若在1500bp未出现特征性谱带，而在500bp、200bp处出现特征谱带，其品 种为‘中蒜3号’；若在1500bp出现特征性谱带，而在500bp、200bp都未出现特征谱带， 则进入步骤(4)；

若利用RP487引物扩增时，在800bp和1200bp处出现特征性谱带，而在100bp处 未出现特征性谱带，利用引物RP0581扩增后使用如下方法判断大蒜品种：经琼脂糖凝 胶电泳检测在2000bp、500bp处均出现特征性谱带，1000bp处未出现特征性谱带，其品 种为‘硬软叶’；若在2000bp、1000bp都出现特征性谱带，而500bp处未出现特征性谱带， 其品种为‘灰叶子’；若在1000bp、500bp出现特征性谱带，而2000bp处未出现特征性谱 带，其品种为‘云南紫皮大蒜’；若在1000bp出现特征性谱带，而2000bp、500bp都未出 现特征性谱带，则进入步骤(5)；

(4)利用RP0581引物进行RAPD扩增，若在1500bp出现特征性谱带，而在500bp、200bp都未出现特征谱带，RP203引物扩增后使用如下方法判断大蒜品种：

若在2000bp、500bp处都出现特征性谱带，其品种为‘磨子蒜’；若在2000bp处出现特征性谱带，500bp处未出现特征性谱带，其品种为‘四六瓣’；若在2000bp和500bp均 未出现特征性谱带的，其品种为‘嘉定2号’；

(5)利用RP0581引物进行RAPD扩增，若在1000bp出现特征性谱带，而2000bp、500bp都未出现特征性谱带，再用RP203引物进行RAPD扩增后使用如下方法判断大蒜 品种：

若在600bp、200bp处都出现特征性谱带的，其品种为‘温二月’；在600bp处出现特征性谱带，而在200bp未出现特征性谱带的，其品种为‘苍山大蒜’；若在200bp处出现 特征性谱带，其品种为‘中蒜1号’。

综上所述，但凡涉及上述16个品种中任意品种或者其组合的大蒜品种，按照上述步骤即可完成品种鉴别和区分。利用本发明的方法统计出的“树型鉴别图”不仅可完成对未知品种的鉴定，还可查询出鉴定不同品种所需要的引物和鉴别依据。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种用于区分大蒜品种的RAPD引物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctgtagtca gcca 14

<210> 2

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtcagctgg a 11

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctgctgag tc 12