密码子优化的cry1Da核酸分子、核酸构建体、载体、宿主细胞、植物细胞、转基因植物、转化细胞的方法、生产转基因植物的方法、控制作物植物中的无脊椎害虫的方法和该核酸分子的用途

摘要

本发明涉及基于以下基因序列的密码子优化的新的cry1Da核酸分子，所述基因序列从细菌苏云金芽孢杆菌中分离。这些分子用于制备核酸构建体、载体和宿主细胞，允许产生对无脊椎害虫抗性的转基因植物例如玉米，所述无脊椎害虫例如来自鳞翅目的昆虫，特别是草地贪夜蛾（夜蛾科，鳞翅目）和小蔗螟（草螟科，鳞翅目）。本发明还涉及包含根据本发明的分子或构建体的植物细胞和转基因植物。特别地，根据本发明的转基因植物可控制对含有cry1F基因的植物已变得抗性的上述物种的毛虫。本发明另外涉及用于转化细胞的方法、用于控制作物植物中的无脊椎害虫的方法、以及所述分子或核酸构建体用于生产转基因植物以及用于控制无脊椎害虫的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及来自基因序列的新的密码子优化的

基因工程技术中的一致进步已使得能够开发具有商业重要性的转基因植物，所述转基因植物含有可以对此类植物赋予期望性状的目的异源基因。例如，在目的基因中有对植物赋予针对除草剂、环境胁迫和无脊椎害虫的抗性的基因。

在编码可用于控制无脊椎害虫的蛋白质的基因的背景下，可以提及衍生自革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌（Bt）的

一般而言，Cry蛋白的作用机制涉及昆虫幼虫的中肠中的晶体溶解、蛋白酶对原毒素的作用、活性毒素对中肠受体的粘附以及所述活性毒素插入顶端细胞膜内，产生离子通道或孔（细胞溶解）。

来自Cry蛋白使用的一个优点是其针对各种昆虫物种的活性，相对于其它生物例如哺乳动物被视为安全的。另一个优点是其针对来自不同作物的害虫昆虫的相对特异性。几种

市场上可获得的基于Bt的制剂占生物杀虫剂销售的高百分比，并且已用于控制来自鳞翅目和双翅目（Diptera）的害虫超过40年。含有

已知不同物种特别是对于编码蛋白质使用优选的密码子，并且这些密码子变异可以在转基因学的背景下负面影响基因表达（Gustafsson，2004）。例如，在玉蜀黍中，对于氨基酸赖氨酸，密码子AAG优先于密码子AAA使用（Liu，2009）。由于不同生物群的这种独特特征，将天然苏云金芽孢杆菌

此外，与植物基因形成对比，细菌基因具有低的C+G含量（Cambel & Gowri，1990；Murray等人，1989）。富含A + T的细菌核苷酸序列可以被植物识别为剪接位点（Liu，2009）、多聚腺苷酸化信号（Joshi，1987；Diehn等人，1998）、或RNA失稳元件例如ATTTA（Ohme-Takagi等人，1993）。因此，为了增加Bt细菌

考虑到通过组合Cry杀昆虫蛋白和害虫昆虫而实现的应答的多样性，以及在作物植物中控制此类昆虫的重要性，预期更好地阐明用于获得令人满意的杀昆虫效应的决定性特征的研究，以及旨在开发对昆虫抗性的新转基因植物的研究具有重要意义。

在先前的研究中，在体外针对草地贪夜蛾或秋粘虫测试了Bt分离株，并且执行了最有效分离株的分子表征。借助于相差显微镜，通过观察蛋白质晶体，来确认Bt菌株的分离。然后，通过使人工饮食饲养的二日龄幼虫暴露于孢子和晶体的悬浮液，进行评价Bt菌株的毒性的生物测定。将毛虫（25条幼虫/生物测定/菌株）置于一次性塑料容器（50 mL）中，在27℃的温度、70%的相对湿度和14小时/10小时的光周期下。当死亡率高于75%时，菌株被视为有效的。

文献提到了在草地贪夜蛾幼虫中测试了13种苏云金芽孢杆菌血清变种，并且报道了血清变型（sv）蜡螟亚种、鲇泽亚种和多窝亚种引起高于90%的死亡率。这一数据通过在Embrapa Milho e Sorgo实验室取得的结果得到部分确认，其中sv多窝亚种杀死了超过95%。然而，sv蜡螟亚种和鲇泽亚种并不引起大于15%的死亡率。Bohorova等人（1996）针对主要玉蜀黍作物害虫测试了多于400个菌株，并且结果已显示99%的分离株引起低于50%的死亡率。这些数字很重要，因为它们显示了在找到有效控制秋粘虫的Bt分离株中的困难。用Cry蛋白控制草地贪夜蛾毛虫中的这种困难通过Baum（1999）加以确认，他声称在同一属内可能存在变异。

目前，聚合酶链反应（PCR）是最广泛使用的表征苏云金芽孢杆菌菌株的分子技术之一（Carozzi等人1991，Cerón等人1994，Cerón等人1995，Bravo等人1998，Valicente等人2000）。在来自Embrapa Milho e Sorgo收集的最有效菌株中，大多数分离株携带

对于转基因植物例如Bt转基因玉蜀黍的生产，三个基本要求是必要的：（i）待转化的植物组织的体外再生；（ii）将

与重组DNA技术组合的细胞和组织培养技术的发展，已相当大地扩展了使用体外培养方法用于生产转基因玉蜀黍植物的潜力。作为该过程的部分，从体细胞建立植物再生系统是非常重要的先决条件。用于体外玉蜀黍再生的最常用方法是体细胞胚胎发生，其具有产生双极结构的优点，所述双极结构理论上可以在一个步骤中发芽且再生。

特别地，在玉蜀黍中，可以从I型或II型愈伤组织制备经由体细胞胚胎发生的植物再生（Armstrong & Green，1985）。I型愈伤组织是致密、黄色或白色的，且通常能够使植物再生，而II型愈伤组织是柔软、松脆和高度胚胎发生的。II型愈伤组织形成培养物迅速生长，可以维持长时间段，并且形成大量易于再生的体细胞胚（Vasil，1987）。

尽管II型愈伤组织在生产转基因玉蜀黍植物中是最有效的，但也可以使用I型愈伤组织。松脆的II型胚胎发生愈伤组织的出现不太常见，仅有限数目的玉蜀黍基因型能够在培养基中表达此类表型，特别是A188品系（Armstrong & Green，1985）和HiII杂交种（Armstrong等人1991）。

随着体外培养方法的改善，且特别是培养基组成以及生长调节剂的比率和剂量中的变化，越来越多的基因型的再生已成为可能（Novac等人，1983；Rapela，1985；Duncan等人，1985；Phillips等人，1988；Prioli & Silva，1989；Lupotto，2004；Petrillo等人，2008）。然而，大多数这些基因型仅形成I型致密型愈伤组织。

尽管能够使植物再生的大多数玉蜀黍基因型适应温带气候，但能够再生的热带气候适应的基因型也已得到鉴定（Carvalho等人，1994；Bohorova等人，1995，Santos-Serejo& Aguiar-Perecin，2000；Petrillo等人，2008），这指出了经由遗传转化来操纵优良热带基因型的可能性。未成熟的合子胚是用于生成胚胎发生作物和生产转基因玉蜀黍植物的优选外植体。

遗传植物转化的不同方法可以分为两大类：间接方法和直接方法。间接遗传转化使用细菌根癌农杆菌（

多年来，单子叶植物的农杆菌属（

为了使得能够在基因转移到植物内的生物技术过程中使用农杆菌属，必须使引起肿瘤的T-DNA内源基因失活，并且必须将外源基因、目的基因（GDI）和选择标记物基因（GMS）插入T-DNA的左末端和右末端之间。将所得到的重组质粒再一次置于农杆菌属内，以转移到植物细胞（Gelvin，2003）。转化的组织或细胞可以用于转基因植物的再生（Schafer等人，1987；Hiei等人，1994；Ishida等人，1996）。

Ti质粒由于太大而难以操纵。因此，创建了二元载体（Bevan，1984），所述二元载体较小，并且能够在农杆菌属和大肠杆菌（

根癌农杆菌是用于将基因引入植物细胞内的极佳系统，因为：（i）可以将DNA引入所有植物组织内，这消除了原生质体产生的需要；并且（ii）T-DNA整合是相对准确的过程。待转移的DNA区域由右末端和左末端的侧翼序列限定。偶然地，出现重排，但在大多数情况下，该区域完整插入植物基因组内。整合的T-DNA通常显示一致的遗传图谱和足够的隔离。此外，通过这种途径引入的特征显示经过许多代杂交是稳定的。当生成的转基因植物待商业化时，此类稳定性是至关重要的（Hiei等人，1994；Ishida等人，1996）。

特别地，对于玉蜀黍，与生物弹道（biobalistics）相比，农杆菌属技术已报道以高效率导致大量的在基因组中含有单个或少数拷贝的转基因的事件（Ishida等人，1996；Zhao等人2001；Gordon-Kamm等人1990；Frame等人2002；Lupotto等人2004；Huang和Wei 2005；Ishida等人2007）。

转基因，即经由分子生物学技术插入的基因，基本上由目的基因或选择标记物基因的编码区和基因表达的调控序列构成。目的基因（GDI）和选择标记物基因（GMS）是某种蛋白质的编码序列或ORF（开放读码框），当表达时，其限定了目的性状。GMS用于鉴定且选择具有整合到基因组内的异源DNA的细胞。它们是用于开发植物转化技术的基础，因为在大多数实验中，将转基因转移到受体细胞内及其整合到基因组内的过程是非常低效的，使得无需选择而回收转基因系的机会一般非常低。目前，用于产生转基因植物如玉蜀黍的最常用GMS是赋予对除草剂的耐受性的那些。在其中频繁使用从吸水链霉菌（

编码目的蛋白质的核苷酸序列以及编码在转基因愈伤组织的选择中使用的蛋白质的核苷酸序列，两者均伴随着负责控制基因表达的调控序列，例如启动子和终止子。

启动子是通常存在于编码区5’末端处的DNA序列，其由RNA聚合酶和转录因子用于启动基因转录过程（Buchanan等人，2000）。从花椰菜花叶病毒（CaMV35S）中分离的35S病毒启动子是靶向植物中的高水平组成型表达的最常用启动子之一（Odell等人，1985），然而，它在单子叶植物中不像它在双子叶植物中一样有效地发挥作用。目前，靶向玉蜀黍中的组成型蛋白表达的最广泛使用的启动子是从玉蜀黍遍在蛋白基因Ubi1中分离的启动子（Christensen & Quail，1996）。

3' UTR区，也称为终止区，用于发出转录结束的信号（Lessard等人2002），防止了嵌合RNA分子的产生，并且相应地，如果聚合酶复合物继续转录超出其末端信号，防止了新蛋白质的形成。用于玉蜀黍转化的基因构建体中最常用的3' UTR序列包括来自农杆菌属胭脂碱合酶基因（

尽管对于一些前述技术，已强调了在玉蜀黍中实现的结果，但用于获得转基因植物的技术是本领域技术人员一般已知的，并且可以根据待使用的目的植物而变。无需过度实验，并且基于他的一般知识和可获得的科学文献，技术人员可以容易地修改本文件中报道的优选方法，以便获得几种转基因植物。

尽管关于Cry蛋白在针对作物害虫的杀昆虫活性中的作用的科学知识的增加，但迄今为止尚未发现足够有希望的方法，因为对于某些作物，害虫对那些蛋白存在显著的抗性，所以不断需要新策略。

特别是对于玉蜀黍作物，已发现存在于巴西市场中的转基因植物，例如在其基因组中带有

在这个意义上，本发明为了满足现有技术的需要而开发，其公开了新的密码子优化的

如通过本发明公开的且具有优化的G + C含量的

在这个意义上，本发明代表了超过现有技术的重大改善。

SEQ ID NO：1指本发明的

SEQ ID NO：2指由其进行优化的从苏云金芽孢杆菌中分离的

SEQ ID NO：3指由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2翻译的氨基酸序列（Cry1Da蛋白）。

SEQ ID NO：4指在本发明的构建体中使用的、玉蜀黍遍在蛋白基因（

SEQ ID NO：5指在本发明的构建体中使用的、农杆菌属胭脂碱合酶基因（

SEQ ID NO：6指在本发明的构建体中使用的、花椰菜花叶病毒的重复的CaMV 35S基因启动子区的核酸序列。

SEQ ID NO：7指在本发明的构建体中使用的、烟草蚀纹（

SEQ ID NO：8指在本发明的构建体中使用的、编码来自吸水链霉菌的膦丝菌素乙酰转移酶选择基因（

SEQ ID NO：9指在本发明的构建体中使用的、编码大豆营养贮藏蛋白质的Tvsp基因的3’ UTR终止区的核酸序列。

SEQ ID NO：10指本发明的核酸构建体的核酸序列（包含玉蜀黍遍在蛋白基因启动子（

SEQ ID NO：11指以其整体的本发明的核酸构建体的核酸序列，其包含（Tvsp基因的3' UTR终止区（SEQ ID NO：9）；编码膦丝菌素乙酰转移酶（

SEQ ID NO：12指在基因构建体克隆实验中使用的引物U4的5'-3'核酸序列。

SEQ ID NO：13指在基因构建体克隆实验中使用的引物U1的5'-3'核酸序列。

SEQ ID NO：14指在基因构建体克隆实验中使用的正向引物BAR的5'-3'核酸序列。

SEQ ID NO：15指在基因构建体克隆实验中使用的反向引物BAR的5'-3'核酸序列。

SEQ ID NO：16指在基因构建体克隆实验中使用的正向引物Ubi的5'-3'核酸序列。

SEQ ID NO：17指在基因构建体克隆实验中使用的反向引物

SEQ ID NO：18指在基因选择实验中使用的正向

SEQ ID NO：19指在基因选择实验中使用的反向

SEQ ID NO：20指在从Bt 1132C菌株中分离全长基因的实验中使用的正向

SEQ ID NO：21指在从Bt 1132C菌株中分离全长基因的实验中使用的反向

图1是本发明的密码子优化的

图2是描绘pTF101.1植物中的表达载体的图。RB/R25：T-DNA右边界；LB：T-DNA左边界；2XP35S：花叶病毒的重复的CaMV35S启动子（Odell等人，1985）；TEV增强子：烟草蚀纹病毒的翻译增强子（Gallie等人，1995；Wilson，1999）；ORF bar：吸水链霉菌的膦丝菌素乙酰转移酶基因的编码区，其赋予对除草剂膦丝菌素及其衍生物的抗性（Thompson等人，1987；White等人，1990；Becker等人，1992）；Tvsp：编码大豆营养贮藏蛋白质的基因的3'终止子（Mason等人，1993）；aadA：弗氏志贺氏菌（

图3指描绘基因构建体

图4指关于（A）非转基因玉蜀黍以及（B）包含本发明的密码子优化的

图5指代表关于（A）非转基因玉蜀黍以及（B）包含本发明的密码子优化的

图6指显示了根据1970年的橡树量表，由草地贪夜蛾侵染引起的损伤评分（±IC，P= 0.05）的曲线图。处理1 – 包含本发明的密码子优化的

图7是显示了由cry1F抗性草地贪夜蛾毛虫侵染的（A）包含本发明的密码子优化的cry1Da核酸分子（SEQ ID NO：1）的转基因玉蜀黍以及（B）非转基因对照植物的上述损伤结果的照片。

本发明涉及来自基因序列的新的密码子优化的

因此，本发明的第一个目的是密码子优化的

在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少90%相似性的核酸序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述核酸分子如SEQ ID NO：1中定义的。

因此，本发明的第二个目的是包含密码子优化的

在本发明的一个优选实施方案中，所述构建体进一步包含与所述核酸分子可操作地连接的启动子序列，其中所述启动子序列优选为玉蜀黍遍在蛋白（

在本发明的另一个优选实施方案中，所述构建体进一步包含3' UTR终止序列，其中所述3' UTR终止序列优选为胭脂碱合酶（

在本发明的另一个优选实施方案中，所述构建体进一步包含与至少一个启动子序列和至少一个终止序列可操作地连接的选择基因，其中所述启动子序列优选为花椰菜花叶病毒的重复的CaMV 35S基因启动子序列，并且所述终止序列优选为编码大豆营养贮藏蛋白质的Tvsp基因终止序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述构建体进一步包含其它调控序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，构建体包含如SEQ ID NO：10定义的核酸分子。

因此，本发明的第三个目的是包含密码子优化的

本发明的第四个目的是包含密码子优化的

本发明的第五个目的是包含密码子优化的

本发明的第六个目的是包含密码子优化的

因此，本发明的第七个目的是转化细胞的方法，其包括将密码子优化的

本发明的第八个目的是生产转基因植物的方法，其包括用密码子优化的

在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法进一步包括由所述植物细胞再生转基因植物。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述转基因植物对作物害虫是抗性的，其中所述转基因植物优选为单子叶植物，优选为玉米、水稻、甘蔗、高粱、小麦或臂形草属植物。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述作物害虫优选为昆虫，更优选来自鳞翅目，甚至最优选为草地贪夜蛾和/或小蔗螟。

本发明的第九个目的是控制无脊椎作物害虫的方法，其中所述作物植物包含密码子优化的

因此，本发明的第十个目的是密码子优化的

在本发明的一个优选实施方案中，所述用途包括转基因植物对无脊椎害虫抗性的事实。

本发明的第十一个目的是密码子优化的

如上所述的任何目的或其优选实施方案也可以充当构成其它目的及其优选实施方案的基础，即使此类关系没有明确描述。

本发明的发明人已公开了借助于如本文件中定义的密码子优化的

除非另有定义，否则本文使用的本领域中使用的所有术语、注释和其它科学术语，预期具有本发明领域的本领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，具有普遍理解的含义的术语在本文件中进行定义，用于清楚和/或迅速参考的目的，并且此类定义在本文件中的包括不应必然解释为表示相对于现有技术中通常理解的内容基本差异。

本文件中描述或提及的技术和程序一般由本领域技术人员充分理解且使用常规方法采用。适当时，涉及商购可得的试剂盒和试剂的使用的过程一般根据由制造商限定的方案和/或参数进行，除非另有说明。

值得一提的是，在适当的情况下，本发明并不限于如所述的方法、方案、细胞系、属或动物物种、构建体和具体试剂，这些显然可以变化。另外，在本文件中使用的术语仅用于描述其具体实施方案的实例的目的，并不预期限制本发明的范围。

本文件自始至终，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种”和“该/所述”或者任何术语或表达的单数形式都包括对复数的提及。

本文件自始至终，词语“包含”及其任何变化例如“包括”或“含有”，应该解释为“开放式术语”，其可能暗示包括没有明确提到的没有限制性特征的另外的要素或要素组。

本文件自始至终，词语“由……组成（consists）”以及任何变化例如“由……组成（consist）”或“由……组成（consisting）”，应该解释为“封闭式术语”，并且可能并不暗示包括没有明确描述的具有限制性特征的另外的要素或要素组。

本文件自始至终，关于特定因子、量、浓度或特定优选提供的精确值或精确值范围，应该解释为也提供近似值的相应值或范围，例如通过表达“约”进行。

本文件自始至终，词语和表达例如“优选地”、“特别地”、“例如”、“诸如”、“如”、“更特别地”等等及其变化，必须解释为完全任选的特征、优选实施方案或可能的非穷举性实例，而不限制本发明的范围。

本文件自始至终，词语和表达例如“核酸”、“核苷酸”等等，应该解释为天然存在的、合成的或人工的核酸或核苷酸。它们包含单链或双链的，以

表达“核酸分子”、“核酸序列”等等指从5'末端到3'末端读取的单链或双链DNA或RNA碱基的聚合物。它尤其包括染色体DNA、自我复制质粒、起主要结构作用的感染性DNA或RNA聚合物。它们也指代表核苷酸或基因的缩写、字母、字符或词语的连续列表，如本发明的技术领域中通常使用的。

本文件自始至终，当提及本发明的分子或序列时，表达“密码子优化的”应该解释为这样的核苷酸分子或序列，其已经历使其核苷酸构成（C+G和A+T含量）适应宿主或受体生物的构成的过程，使得它可以更有效地表达异源蛋白质。密码子优化过程是本领域技术人员已知的。

本文件自始至终，词语和表达例如关于另一个序列的“序列相似性”、“同一性”等等，应该解释为在序列比对以及必要时引入

本文件自始至终，表达“核酸构建体”应该解释为能够引起目的蛋白表达的单链或双链、线性或环状DNA构建体。通常，它包含启动子序列和编码序列。但是，通常地，构建体也可能包含3’ UTR区。此类构建体可以包含本领域技术人员已知的其它调控序列或信号传导序列。优选地，本发明的构建体包含如SEQ ID NO：10定义的核酸序列。

本文件自始至终，词语和表达例如“启动子”、“启动子序列”等等应该解释为DNA序列，一旦与目的核苷酸序列可操作地连接，所述DNA序列能够控制目的核苷酸序列转录成RNA。启动子位于它控制其mRNA转录的目的核苷酸序列的转录起始位点的5'（或上游），并且提供了用于转录起始的RNA聚合酶和其它转录因子的特异性结合位点。它可以包括本领域技术人员已知的其它调控序列。根据本发明，启动子对于各自的细胞或宿主可以是异源或同源的。如果核酸序列源自不同物种，或者如果它源自相同物种，它由其原始形式进行修饰，则它对于生物或第二核酸序列是“异源的”。

几种启动子适合于进行本发明。合适的非穷举性启动子尤其是例如来自CaMV花椰菜花叶病毒和FMV玄参(scrofularia)花叶病毒的19S和35S启动子（重复或不重复）、拟南芥属（

本文件自始至终，表达“3’ UTR终止序列”应该解释为跨越终止密码子的非翻译区的3'终止序列。几种3’ UTR终止序列适合于进行本发明。合适的非穷举性3’ UTR终止序列是例如来自农杆菌属的胭脂碱合酶（nos）终止序列、编码大豆营养贮藏蛋白质的基因的Tvsp序列、35S CaMV和马铃薯pinII蛋白酶抑制基因的3'区。优选地，3’ UTR终止序列是如SEQ ID NO：5定义的来自农杆菌属的胭脂碱合酶（nos）终止序列、以及如SEQ ID NO：9定义的编码大豆营养贮藏蛋白质的基因的Tvsp序列。

本文件自始至终，词语和表达例如“选择基因”、“可选择标记物”、“可选择标记物基因（SMG）”等等，应该解释为产生产物的基因，所述产物用于选择或区分表达其的细胞或组织与并不表达其的其它细胞或组织。几种可选择基因适合于进行本发明。合适的非穷举性可选择基因是例如GUS（β-葡糖醛酸酶编码序列），GFP（绿色荧光蛋白编码序列），LUX（萤光素酶编码基因），抗生素抗性标记物基因（如，例如转座子Tns（bla）、Tn5（nptII）、TN7（dhfr）、青霉素、卡那霉素、新霉素、氨甲蝶呤、四环素等），或除草剂耐受性基因（尤其例如修饰的酶5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶（EPSPS）的基因、如SEQ ID NO：8定义的来自吸水链霉菌的膦丝菌素乙酰转移酶基因（

本文件自始至终，表达“其它调控序列”指例如增强子和其它表达控制元件（例如，多聚腺苷酸化信号），其可以位于本发明中描述的其它核苷酸序列的上游（5' UTR区）或下游（3’ UTR区）、或者甚至内部或之间。优选地，调控序列是如SEQ ID NO：7定义的烟草蚀纹病毒（

本文件自始至终，术语“转化”等等应该解释为用于将异源DNA引入细胞、植物组织或植物内的过程。它可以在天然或人工条件下，例如使用本领域众所周知的几种方法，在原核或真核宿主细胞中进行。该方法通常基于待转化的宿主细胞加以选择，并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂转染、粒子轰击（生物弹道）和农杆菌属介导的方法。

本发明的实施方案之一涉及细胞转化方法。任何细胞转化方法都包括在本发明的范围内，并且对于实现本发明的实施方案并不具有特别的相关性，只要它包括通过本领域技术人员已知的手段，将密码子优化的

本文件自始至终，术语“转基因”应该解释为通过实验操纵引入细胞内，整合或未整合到基因组内的任何核酸序列。转基因可以是“内源DNA序列”或“外源DNA序列”（即，“异源的”）。术语“内源DNA序列”指在它引入其内的细胞中天然发现的核苷酸序列。术语“外源DNA序列”指在它引入其内的细胞中并未天然发现的核苷酸序列。提及转化生物的术语“转基因”意指用重组DNA分子转化的生物，所述重组DNA分子优选包含与目的DNA序列可操作地连接的合适启动子。

本文件自始至终，术语“载体”应该解释为含有DNA序列的构建体，所述DNA序列与一个或多个合适的控制序列可操作地连接，所述控制序列能够导致所述DNA序列在合适宿主中的表达。此类控制序列包括例如执行转录的启动子，用于控制此类转录的任选的操纵子序列，编码针对核糖体的合适mRNA结合位点的序列，以及控制转录和翻译结束的序列。

几种载体适合于进行本发明。载体是例如噬菌体，病毒如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒，转座子，IS元件，质粒，噬菌粒，粘粒，线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或由染色体复制。载体也可以是质粒。根据本文件，术语“质粒”和“载体”有时可互换使用。优选地，根据本发明的载体包含密码子优化的

本文件自始至终，表达“宿主细胞”、“宿主生物”等等应该解释为特定宿主生物或特定靶细胞，但也应该解释为这些生物或细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境效应，某些修饰可能在连续世代中出现，因此这些后代不必与亲代细胞等同。然而，它们仍然包括在本发明的保护范围内。根据本发明，宿主细胞可以是原核的或真核的。优选地，根据本发明的宿主细胞是植物宿主细胞。优选地，它包含密码子优化的

本文件自始至终，词语和表达例如“转基因植物细胞”、“转基因植物”等等，应该解释为通过实验操纵具有转基因并优选表达转基因的细胞或植物，并且如上文还指转基因植物的子代以及植物的后续世代。

本文件自始至终，术语“植物”等等应该解释为整体或部分的植物生物。在该上下文中的“部分”意指植物细胞和组织、器官以及以其所有表现形式的植物部分，例如种子、叶、花药、纤维、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收集的材料、植物组织、再生组织和细胞培养物。可以生成根据本发明的转基因植物，并且使其自体受精或与其它个体杂交，以便获得另外的转基因植物。转基因植物也可以通过转基因植物细胞的营养繁殖而获得。

根据本发明获得的任何转化植物都可以用于常规育种方案或体外植物繁殖中，以产生更多具有相同性状的转化植物，和/或可以用于将相同性状引入同一物种的其它变种或相关物种内。这些植物也是本发明的部分。从遗传转化的植物获得的种子也含有相同的性状，并且是本发明的部分。本发明适用于可以用本领域技术人员已知的任何转化方法进行转化的任何植物和培养物。根据本发明的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。优选的单子叶植物包括但不限于玉蜀黍、水稻、甘蔗、高粱、小麦或臂形草属植物，更优选玉蜀黍。仍更优选地，根据本发明的植物是对作物害虫抗性的转基因植物。

本发明的实施方案之一涉及生产转基因植物的方法。生产转基因植物的任何方法都包括在本发明的范围内，并且对于获得本发明的实施方案并不具有特别的相关性。优选地，该方法包括用密码子优化的

本文件自始至终，词语和表达例如“害虫”、“作物害虫”等等应该解释为无脊椎害虫，其包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、蜱虫等等。特别地，昆虫尤其包括选自以下的那些：鞘翅目（Coleoptera）、双翅目、膜翅目（Hymenoptera）、鳞翅目、食毛目（Mallophaga）、同翅目（Homoptera）、半翅目（Hemiptera）、直翅目（Orthroptera）、缨翅目（Thysanoptera）、革翅目（Dermaptera）、等翅目（Isoptera）、虱目（Anoplura）、蚤目（Siphonaptera）、毛翅目（Trichoptera）。鞘翅目、鳞翅目和双翅目是优选的。

特别地，鳞翅目包括但不限于凤蝶科（Papilionidae）、粉蝶科（Pieridae）、灰蝶科（Lycaenidae）、蛱蝶科（Nymphalidae）、斑蝶科（Danaidae）、眼蝶科（Satyridae）、弄蝶科（Hesperiidae）、天蛾科（Sphingidae）、天蚕蛾科（Saturniidae）、尺蛾科（Geometridae）、灯蛾科（Arctiidae）、夜蛾科、毒蛾科（Lymantriidae）、透翅蛾科（Sesiidae）、草螟科和谷蛾科（Tineidae），更特别是灰翅夜蛾属物种（

本发明的实施方案之一涉及控制作物植物中的无脊椎害虫的方法。控制作物植物中的无脊椎害虫的任何方法都包括在本发明的范围内，对于实现本发明的实施方案并不具有特别的相关性，只要根据本发明的作物植物包含密码子优化的

本文件自始至终，所有标题和副标题仅为了方便而使用，并且不应该解释为对本发明的限制。

实施例

在属于Biological Control Laboratory的苏云金芽孢杆菌种质库中进行搜索，以便检测能够控制草地贪夜蛾发育的菌株。通过使用用于

用于合成存在于基因构建体中的Bt基因的序列的定义编码对应于cry1Da蛋白活性位点的625个氨基酸的蛋白质，并且基于三个方面：（i）C末端结构域（内毒素C）、中央结构域（内毒素M）和N末端结构域（内毒素N）的存在；（ii）蛋白质活性核心的大小 - 从aa 1到625的残基（Abdul Aziz，H.，Wei Hong，L.和Yusoff，K. Comparative study of cry1Dgene expressed in E. coli and Baculovirus expression system/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AFK29089.1）；（iii）用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，在计算机芯片上（

在第二步中，修饰了蛋白质活性核心的密码子 - 从aa 1到625的残基/1875 bp的核苷酸序列 - 最初从苏云金芽孢杆菌中分离（SEQ ID NO：2），以便变得与玉蜀黍中发现的密码子相容。使用软件Optimizer（http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/Form.php）（Puigbo，2007），进行了

将合成的片段克隆到具有限制性酶位点的质粒pUC19内，所述限制性酶位点对于克隆到二元载体pTF101内相容。通过使用标准技术的测序确认合成的序列。

在含有玉蜀黍遍在蛋白基因启动子（

一旦确认UBI::cry1Da::NOS基因克隆到质粒pTF101内，就使用电穿孔方法（BioRad/MicroPulser），将这种基因构建体转移到根癌农杆菌EHA101。执行与上文相同的程序，以证实含有

含有目的基因构建体（UBI::cry1Da::NOST和35S::bar::35T）的根癌农杆菌EHA101用于遗传转化玉蜀黍。

这种转化方案中使用的基因型是HiII玉蜀黍（Armstrong等人，1991），根据Frame等人（2002）的方案，伴随较小的修改。简言之，对于该基因型的转化，收集了长度为1.8 -2.0 mm（授粉后10-12天）的未成熟胚。将用于收集胚的穗浸入商业漂白剂（2.5%次氯酸钠）以及具有1至2滴Tween 20的蒸馏H

借助于刮刀，从谷物的浅表切口收集未成熟胚。为了将基因构建体转移至玉蜀黍，使用了根癌农杆菌EHA101。从在-80℃下保存于甘油中的含有目的基因构建体的根癌农杆菌的原种培养物，在含有必要抗生素（100 mg.L

对于未成熟的玉蜀黍胚的感染，在1 mL感染培养基加上乙酰丁香酮中收集50至100个胚。在收集后，将胚漂洗两次，加入1 mL细菌培养物，并且使悬浮液在23℃下温育5分钟。在感染后，将胚转移至共培养基（4.0 g.L

将选择的愈伤组织转移至再生培养基（4.62 g.L

当根充分发育并且叶结构长约5 cm时，将幼苗移植到温室中的盆内，所述盆含有土壤和有机物质的商业混合物（2/3土壤和1/3有机物质（TDP 30/15）。

根据下表2，生成了含有本发明的密码子优化的

为了评估表达Cry1Da蛋白（由本发明的密码子优化的核酸分子编码）的转基因玉蜀黍的易感性，在实验室中执行了生物测定。

如下进行测试：将草地贪夜蛾新生毛虫接种到处于阶段V7和V8的保存在温室中的cry1Da转基因玉蜀黍植物的叶内以及非转基因等基因系（isoline）内（5条毛虫/容器）。在侵染后，将容器密闭，并且在05天后进行损害评价。在每种情况下，实验设计由处理组（转基因的含有cry1Da构建体的玉蜀黍的事件ME240913（事件1））和对照组（非转基因玉蜀黍）组成。

评估的参数为：使用由Carvalho，1970年提出的量表的损伤评分（0：具有未损害的叶的植物；1：具有剃须叶的植物；2：具有穿孔叶的植物；3：具有撕裂叶的植物；4：显示对柱体（cartridge）的损害的植物，以及5：显示破坏柱体的植物）；毛虫存活率（计数每个盆中的存活毛虫数目）；以及毛虫生物量（使用小数点后四位的精密标尺）。

草地贪夜蛾测定：首先，事件ME240913（事件1）就草地贪夜蛾控制进行测试。事件种子在温室中发芽，并且当植物到达10至12叶期的阶段（营养期结束）时，将每株植物的两片最嫩的叶用于草地贪夜蛾生物测定中。执行了三次重复，五条毛虫/重复。HiII和L3玉蜀黍叶用作阴性对照（毛虫正常生长），而Viptera玉蜀黍叶用作阳性对照（毛虫不能生长）。在该第一测试中，发现事件ME240913（事件1）具有控制毛虫发育的良好能力，达到100%的死亡率（表3）。

重复了用该事件的生物测定，但这次用20条毛虫/重复进行四次重复，并且结果确认了该事件具有控制草地贪夜蛾发育的能力（图4代表在非转基因玉蜀黍和本发明的转基因玉蜀黍中用草地贪夜蛾的饲喂生物测定）。在不同的时间，进行了另一种生物测定，以测试另外两个生成的cry1Da事件：ME260913 - 事件2（cry1Da）和ME240913 - 事件4（cry1Da）（表4）。生成的两个事件也能够有效地控制草地贪夜蛾的发育。

使用小蔗螟的测定：对于草地贪夜蛾测试的相同事件也对小蔗螟进行测试。将五条一日龄毛虫放在转基因玉蜀黍事件和对照的叶上。也发现事件ME240913（事件1）能够控制小蔗螟的发育。在这个时间段内，毛虫没有死亡，但无法生长（表5）。

用该事件进行新的生物测定，以确认毒性。这次，四次重复和20条毛虫用于每次重复。在该第二测定中实现了与先前获得的相同的结果（图5代表在非转基因玉蜀黍和本发明的转基因玉蜀黍中用小蔗螟的饲喂生物测定）。在不同的时间，进行了另一种生物测定，以测试另一个生成的cry1Da事件：ME260913 - 事件2（cry1Da）（表6）。该事件也能够有效地控制小蔗螟的发育。

根据本领域技术人员已知的标准技术，使用定量聚合酶链反应（qPCR）测定，来分析

执行测定，以验证本发明的密码子优化的

通过种植包含本发明的密码子优化的

结果已显示，包含本发明的密码子优化的

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