一种基于荧光定量PCR技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法

摘要

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法，并公开三组对红花大金元具有特异性的引物和荧光探针序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑8所示，通过将具有特异性引物转换成TaqMan荧光探针，TaqMan荧光探针具有高度的选择特异性和重复性；该技术的灵敏度和准确度比普通PCR技术较高；该技术操作步骤简单，可实现实时定量检测；实现混合复烤烟叶品种的定性，定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及烟草生物技术领域，特别是涉及一种基于荧光定量PCR技术的混合烟草品种定量鉴定方法。

背景技术

卷烟的在线生产过程中，烟叶配方真实稳定是保障卷烟产品质量稳定的基础，原料的稳定包括产量和烟草品种的稳定两个方面。目前的技术中，对于烟草品种的鉴别，主要还是依据烟草种子的形态特征、田间的农艺性状和调制后烟叶的外观来进行鉴别。但是由于烟支生产涉及烟叶收购，打叶复烤、回潮切丝等多个环节，在多种因素的作用下都有可能造成烟叶品种的不真实或者烟叶配比前后不一致，进而导致卷烟配方的失真，卷烟品质出现波动。传统的烟草品种鉴别方法不能实现上述环节中对烟草品种的准确鉴定与定量检测。随着分子生物学的发展，利用荧光定量技术定性定量检测烟叶配方中烟叶品种真实性与烟叶配比一致性具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于荧光定量PCR技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种红花大金元烟叶构建特异定量PCR精准检测的引物组，所述引物组包括3对，引物序列如下所示：

第一对引物上游序列：SEQ ID NO.1；

第一对引物下游序列：SEQ ID NO.2；

第二对引物上游序列：SEQ ID NO.3；

第二对引物下游序列：SEQ ID NO.4；

第三对引物上游序列：SEQ ID NO.5；

第三对引物下游序列：SEQ ID NO.6；

第一对荧光探针序列：SEQ ID NO.7；

第二对荧光探针序列：SEQ ID NO.8；

第三对荧光探针序列：SEQ ID NO.9。

一种利用权利要求1所述的引物序列进行测定混合烟叶中红花大金元含量的方法，包括如下步骤：

（1）合成序列为SEQ ID NO.1-6的三组引物以及序列为SEQ ID NO.7-9的三对荧光探针；

（2）制备红花大金元DNA稀释液和预混样品DNA稀释液，预混样品DNA稀释液为红花大金元DNA与其他品种烟叶DNA的混合稀释液；

（3）分别以红花大金元DNA稀释液为模板和预混样品DNA稀释液为模板进行PCR扩增反应，然后荧光定量PCR检测。

所述步骤（3）中荧光PCR反应体系为：DNA稀释液模板，1-2µl；2×AceQ UniversalU+ Probe Master Mix，7-10µl；取上述三对引物中一对引物的上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；与上游引物和下游引物对应的荧光探针，10µmol/L，0.1-0.5µl；ddH

所述步骤（3）中荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，45-60℃延伸10-30s，反应40-45个循环。

本发明有益效果：通过采集红花大金元烟叶DNA，并确定具有特异性的引物，通过将具有特异性引物转换成TaqMan荧光探针，TaqMan荧光探针具有高度的选择特异性和重复性；该技术的灵敏度和准确度比普通PCR技术较高；该技术操作步骤简单，可实现实时定量检测；实现混合复烤烟叶品种的定性，定量检测。

附图说明

图1是红花大金元、云烟85、云烟87、K326烟草基因组DNA提取结果；

图2是第一对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；

图3是第二对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker

图4是第三对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；

图5是第四对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；

图6是第五对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；

图7是第一对引物转化成荧光探针后对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；

图8是第二对引物转化成荧光探针后对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；

图9是第三对引物转化成荧光探针后对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；

图10 第一对引物的标准曲线方程 ；

图11 第二对引物的标准曲线方程；

图12 第三对引物样品1的标准曲线方程；

图13 第三对引物样品2的标准曲线方程。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本申请所提供的一种基于荧光定量PCR技术的混合烟草品种定量鉴定方法，以红花大金元与云烟85，云烟87，K326不同比例混合为例，对其进行定性定量检测，其主要技术思路为：首先筛选出针对红花大金元的特异性引物，再将针对红花大金元的特异性引物转化成荧光探针，然后对未知混合品种中是否含有红花大金元以及含量多少进行定性定量检测。

SCAR引物的设计合成：根据已知的基因组DNA序列利用Primer Primer 5 引物设计软件重新设计合成出5对SCAR引物，引物序列如下所示：

SEQ ID NO.1~6与SEQ ID NO.10~13。

提取四种烟叶基因组DNA：四种烟叶为红花大金元、云烟85、云烟87、K326，其提取步骤大体上与改良版的CTAB法提取步骤一样，主要区别在于复烤烟叶的研磨方式采用组织研磨仪在65HZ，120S的条件下研磨2次；水浴时间选择65℃，30min；离心转速全部选择为9000r/min；DNA洗涤剂选用70%的乙醇。分别以提取的四种烟叶DNA稀释液为模板，进行PCR扩增，每种烟叶DNA进行5次扩增，每次选用5对引物中的一种引物，并进行电泳检测，20µl反应体系设计如下：提取烟叶DNA稀释液模板，0.1-1µl；2×Taq Plus Master Mix II，7-10µl；5对引物中的一种上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；ddH

扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测，由图2~6可知，序列为SEQ ID NO.1~6的引物在红花大金元100-250bp之间的位置中出现特异性条带，序列为SEQ ID NO.10~13的引物在四种烟叶样品中均有条带，即无特异性。

将序列为SEQ ID NO.1~6引物根据红花大金元基因组DNA特点和荧光定量精度的要求，探针的上游区域5’的位置选择FAM荧光基团修饰，下游区域的3’位置选用MGB淬灭基团修饰，产物的长度保持在80-200bp，转化成荧光探针。如图7~9所示，转化后的荧光探针只在红花大金元处有特异性条带，且该条带大小也在100-250bp之间，由此可知序列为SEQ IDNO.1~6引物转化成功，转化成功的探针序列为SEQ ID NO.7~9。

利用荧光探针进行荧光定量PCR定性、定量检测配方中烟叶品种真实性和烟叶配比前后是否一致：

制备将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH

红花大金元DNA荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA稀释液模板，1-2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，7-10µl；取三对引物中一对引物的上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；与上游引物和下游引物对应的荧光探针，10µmol/L，0.1-0.5µl；ddH

制备预混样品DNA稀释液，预混样品DNA稀释液为红花大金元DNA与其他品种烟叶DNA的混合稀释液。

预混样品DNA荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：预混样品DNA稀释液模板，50ng/µl、1-2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，7-10µl；取三对引物中一对引物的上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；与上游引物和下游引物对应的荧光探针，10µmol/L，0.1-0.5µl；ddH

将以红花大金元DNA稀释液为模板的体系和以预混样品DNA稀释液为模板的体系同时同一程序进行PCR扩增，其反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，45-60℃延伸10-30s，反应40-45个循环，污染消化步骤主要是除去影响扩增的杂质，如空气气溶胶、加样过程中的一写污染物。在此过程中收集数据，以红花大金元DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到红花大金元DNA浓度与CT值之间的线性方程；预混样品的CT平均值带入到对应引物的标准曲线中，得出待测样品中红花大金元的含量。同样的操作将，将三对引物对应的进行PCR扩增并绘制出标准曲线。

第一对引物上游序列SEQ ID NO.1为：5’-TTGCCAAAAAAAAAAGAAGA-3’；

第一对引物下游序列SEQ ID NO.2为：5’-GCCACAATTATCACATCATA-3’；

第二对引物上游序列SEQ ID NO.3为：5’-GATTGCCAAAAAAAAAAGAA-3’；

第二对引物下游序列SEQ ID NO.4为：5’-GCCACAATTATCACATCATA-3’；

第三对引物上游序列SEQ ID NO.5为：5’-GGGCCACAATTATCACATCATAC-3’；

第三对引物下游序列SEQ ID NO.6为：5’-GCGGATTGCCAAAAAAAAAAGAAG-3’；

第一对荧光探针序列SEQ ID NO.7为：5’-TTCCTCCACATCTCA-3’；

第二对荧光探针序列SEQ ID NO.8为：5’-CCTCCACATCTCACATCATTATCA-3’；

第三对荧光探针序列SEQ ID NO.9为：5’-TTCCTCCACATCTCACATCATTATCAAT-3’；

第四对引物上游序列SEQ ID NO.10为：5’-AAAAAAAAAAGAAGAGAG-3’；

第四对引物下游序列SEQ ID NO.11为：5’-ACATAGTTTGGCATAATA-3’；

第五对引物上游序列SEQ ID NO.12为：5’- TTGCCAAAAAAAAAAGAA-3’；

第五对引物下游序列SEQ ID NO.13为：5’- GGGCCACAATTATCACAT-3’。

实施例1

合成序列为SEQ ID NO.1-6的引物以及序列为SEQ ID NO.7-9的荧光探针；制备预混样品DNA稀释液，预混样品DNA稀释液即为红花大金元DNA与其他烟叶DNA的混合稀释液；配制荧光PCR反应体系并进行荧光PCR扩增反应；利用荧光探针进行荧光定量PCR定性、定量检测配方中烟叶品种真实性和烟叶配比前后是否一致。

将红花大金元DNA与云烟85DNA按照红花大金元质量占比50%、60%、70%、80%、90%、100%进行预混，预混样品按照荧光定量PCR反应条件和反应程序进行荧光定量PCR扩增，每组实验重复3次。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA与云烟85DNA稀释液模板，50ng/µl、2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，10µl；第一对上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.4µl；第一对荧光探针，10µmol/L，0.2µl；ddH

将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH

荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃延伸20s，反应40个循环，在此过程中收集数据。

然后以红花大金元DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到红花大金元DNA浓度与CT值之间的线性方程y= -1.249ln(x) + 28.151，其中标准方程的R

分析结果可知：50%的红花大金元与50%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为42.63%，与实际值的偏差为7.36%，相对误差为14.37%；60%的红花大金元与40% 的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为48%，与实际值的偏差为11.99%，相对误差为19.98%；70%的红花大金元与30%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为73.45%，与实际值的偏差为3.45%，相对误差为4.93%；80%的红花大金元与20%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为72%，与实际值的偏差为8%，相对误差为9.99%；90%的红花大金元与10%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为96.9%，与实际值的偏差为3.1%，相对误差为7.67%；100%的红花大金元与0%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为91.45%， 与实际值的相对误差为8.55%。

表1 第一对引物预混样品的DNA浓度

实施例2

过程同实例1，将红花大金元DNA与云烟85DNA按照红花大金元质量占比50%、60%、70%、80%、90%、100%进行预混，预混样品按照荧光定量PCR反应条件和反应程序进行荧光定量PCR扩增，每组实验重复3次。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA与云烟85DNA稀释液模板，50ng/µl、1µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，8µl；第二对上游引物和下游引物，10µmol/L、各1µl；第二对荧光探针，10µmol/L，0.5µl。

将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH

荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，45℃延伸10s，反应45个循环，在此过程中收集数据。

然后以红花大金元DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到DNA浓度与CT值之间的线性方程y = -1.376ln(x) + 27.793，其中标准方程的R

分析结果可知：50%的红花大金元与50%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为57.04%，相对误差为15.88%；60%的红花大金元与40%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为50.64%，相对误差为-15.77%；70%的红花大金元与30%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为69.71%，相对误差为0.72%；80%的红花大金元与20%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为85.88%，相对误差为7.35%；90%的红花大金元与10%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为80.09%，相对误差为-10.24%；100%的红花大金元与0%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为95.16%，与实际值的相对误差为-4.84%。

表2 第二对引物预混样品的DNA浓度

实施例3

过程同实例1，将红花大金元DNA与云烟85DNA按照红花大金元质量占比50%、60%、70%、80%、90%、100%进行预混，预混样品按照荧光定量PCR反应条件和反应程序进行荧光定量PCR扩增，每组实验重复3次。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA与云烟85DNA稀释液模板，50ng/µl、1.5µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，8µl；第三对上游引物和下游引物，10µmol/L、各1µl；第三对荧光探针，10µmol/L，0.5µl；ddH

将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH

荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，50℃延伸30s，反应43个循环。

然后以DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到DNA浓度与CT值之间的线性方程y = -1.473ln(x) + 27.747，其中标准方程的R2（相关系数）为0.968，如图12所示，根据得到的标准曲线方程，依次带入各实验样品的CT平均值，分别计算出待测样品中红花大金元DNA浓度，如表3所示。

分析结果可知：50%的红花大金元与50%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为50.74%，与实际值的偏差为0.74%，相对误差为1.48%；60%的红花大金元与40%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为58.19%，与实际值的偏差为1.81%，相对误差为3.02%；70%的红花大金元与30%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为77.86%，与实际值的偏差为7.86%，相对误差为11.23%；80%的红花大金元与20%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为93.94%，与实际值的偏差为13.94%，相对误差为17.43%；90%的红花大金元与10%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为94.17%，与实际值的偏差为4.17%，相对误差为4.63%；100%的红花大金元与0%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为106.14%，与实际值的相对误差为6.14%。

表3 第三对引物预混样品的DNA浓度

将实施例1~3实验进行统计分析。分析结果可知：经100组实验后可知，见表4，50%的红花大金元与50%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为40.64%，与实际值的偏差为9.36%，相对误差18.72%；60%的红花大金元与40%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为50.02%，与实际值的偏差为10.02%，相对误差16.64%；70%的红花大金元与30%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为61.00%，与实际值的偏差为9.0%，相对误差12.86%；80%的红花大金元与20%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为73.84%，与实际值的偏差为6.16%，相对误差7.70%；90%的红花大金元与10%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为81.53%，与实际值的偏差为8.47%，相对误差9.41%；100%的红花大金元与0%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为85.10%，相对误差14.91%。

表4 实施例1~3荧光定量检测结果

实施例4

过程同实例1，将质量占比为50%的红花大金元与25%的云烟87、25%的K326进行预混，预混样品按照荧光定量PCR反应条件和反应程序进行荧光定量PCR扩增，实验重复3次。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA与云烟87DNA、K326DNA稀释液模板，50ng/µl、2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，10µl；第三对上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.8µl；第三对荧光探针，10µmol/L，0.4µl；ddH

将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH

荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃延伸30s，反应40个循环。

然后以DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到DNA浓度与CT值之间的线性方程y = -1.498ln(x) + 27.518，其中标准方程的R2（相关系数）为0.986，如图13，根据得到的标准曲线方程，依次带入各实验样品的CT平均值，分别计算出待测样品中红花大金元DNA浓度，如表5所示。

分析结果可知：50%的红花大金元与25%的云烟87、25%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为50.38%，相对误差为0.77%；60%的红花大金元与20%的云烟87、20%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为53.36%，相对误差为-11.07%；70%的红花大金元与20%的云烟87、10%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为58.08%，相对误差为-17.02%；80%的红花大金元与10%的云烟87、10%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为80.02%，相对误差为0.03%；90%的红花大金元与3%的云烟87、7%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为77.79%，相对误差为-13.57%；100%的红花大金元与0%的云烟87、0%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为89.82%，与实际值的相对误差为10.18%。

表5 第三对引物预混样品的DNA浓度

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州轻工业大学

<120> 一种基于荧光定量PCR技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法

<130> 1912714CGCN-ZL-WXL-LPY

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 第一对引物上游序列

<400> 1

ttgccaaaaa aaaaagaaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 第一对引物下游序列

<400> 2

gccacaatta tcacatcata 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 第二对引物上游序列

<400> 3

gattgccaaa aaaaaaagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 第二对引物下游序列

<400> 4

gccacaatta tcacatcata 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 第三对引物上游序列

<400> 5

gggccacaat tatcacatca tac 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 第三对引物下游序列

<400> 6

gcggattgcc aaaaaaaaaa gaag 24

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 第一对荧光探针序列

<400> 7

ttcctccaca tctca 15

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 第二对荧光探针序列

<400> 8

cctccacatc tcacatcatt atca 24

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 第三对荧光探针序列

<400> 9

ttcctccaca tctcacatca ttatcaat 28

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 第四对引物上游序列

<400> 10

aaaaaaaaaa gaagagag 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 第四对引物下游序列

<400> 11

acatagtttg gcataata 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 第五对引物上游序列

<400> 12

ttgccaaaaa aaaaagaa 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 第五对引物下游序列

<400> 13

gggccacaat tatcacat 18