一种多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法

摘要

本发明涉及一种多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法，所述的测定方法包括如下步骤：(1)样品预处理，包括：去佐剂：多价疫苗离心去除佐剂，取上清液样品；去保护剂：上清液样品于10kDa超滤离心管内离心后弃滤过液，去除保护剂得待水解样品；待水解样品加入盐酸水解得水解液；水解完成后，中加入NaOH中和并过滤得到供试样品；(2)色谱检测：包括：洗脱液为浓度300～400mmol/L的NaOH溶液，洗脱液流速为0.3ml/min；使用标准曲线法计算出B型流感嗜血杆菌多糖含量。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法。

背景技术

DTacP-sIPV-Hib联合疫苗为含有无细胞百白破疫苗(后简称：DTacP疫苗)、脊髓灰质炎灭活疫苗(后简称：IPV疫苗)、和B型流感嗜血杆菌结合疫苗(后简称：Hib结合疫苗)的联合疫苗，其核心优势在于合并复数种单苗以提供免疫保护，显著减少了免疫接种次数。国际上通常将DTacP为基础的新型联合疫苗列为优先开发项目。由于DTacP疫苗、IPV疫苗与Hib结合疫苗的免疫程序接近，将它们制成联合疫苗并进行免疫接种可以简化接种过程并增强家长和婴幼儿接种的依从性，从而减轻疫苗管理上的困难，降低接种和管理费用。但是联合疫苗的成分较多，给检定工作增加了困难，因此寻找适合检测联合疫苗中各成分含量，同时不受其他抗原干扰的方法也成为目前的热门。

B型流感嗜血杆菌多糖含量为DTacP-sIPV-Hib联合疫苗内Hib组分的核心质控指标。目前《中华人民共和国药典》中用于B型流感嗜血杆菌多糖含量的分析方法为以核糖或磷为标示物的分光光度法，但由于DTacP-sIPV-Hib联合疫苗内包含的组分较多，诸如IPV内的三组分、糖类保护剂及磷酸铝佐剂等均会对这两种检定方法造成干扰，且分光光度法分析精度及最低检测限较低，故对联合疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的检定产生了挑战。

为避免DTacP-sIPV-Hib联合疫苗内其他组分对B型流感嗜血杆菌多糖含量的检测干扰，并提高检测灵敏度，本发明开发了一种测定DTacP-sIPV-Hib联合疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的高效阴离子色谱-脉冲安培检测方法。

发明内容

本发明涉及一种多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法，所述的多价疫苗为无细胞百白破疫苗-脊髓灰质炎灭活疫苗-B型流感嗜血杆菌结合疫苗五联型疫苗(DTacP-sIPV-Hib联合疫苗)，所述的测定方法包括如下步骤：

(1)样品预处理，包括如下步骤：

去佐剂：DTacP-sIPV-Hib联合疫苗置于离心机内，离心去除佐剂，取上清液样品；

去保护剂：上清液样品于10kDa超滤离心管内离心后弃滤过液后补加去离子水，去除保护剂得待水解样品；

水解：待水解样品，加入盐酸，振荡混匀，于100℃条件下水浴2小时得水解液；水解完成后，待样品冷却至室温。于水解液中加入NaOH，混匀，使用0.22μm针头滤器对水解液进行过滤，得到供试样品；

(2)色谱检测：包括以下步骤：

检测参数如下：柱温：35℃；进样体积：25μL；信号收集速率：1Hz；

洗脱液为浓度300～400mmol/L的NaOH溶液，洗脱液流速为0.3ml/min；

使用标准曲线的回归方程计算出B型流感嗜血杆菌多糖含量。

优选的，

步骤(1)所述的样品预处理步骤中，

去佐剂步骤中，DTacP-sIPV-Hib联合疫苗取样量为5-10ml；离心参数为：4℃，6500rpm，离心15min；

去保护剂步骤中，上清液取样量为5-8ml；离心参数为：4℃，6500rpm离心30min；离心后补加等体积的去离子水；且离心与补水溶解的步骤重复三次；

水解步骤中，加入盐酸至终浓度0.28M；加入NaOH至终浓度至0.34M(不计算酸碱中和消耗量)。

步骤(2)所述的色谱检测步骤中，

洗脱液为浓度350mM的NaOH溶液；

使用标准曲线法计算出B型流感嗜血杆菌多糖含量的方法为：使用标准曲线法，根据峰面积计算核糖醇含量，按照核糖醇占B型流感嗜血杆菌多糖干重质量分数(41.3％)计算出B型流感嗜血杆菌多糖含量。

本发明还涉及所述的多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法在检测分析多价疫苗质量中的应用，所述的多价疫苗为为无细胞百白破疫苗-脊髓灰质炎灭活疫苗-B型流感嗜血杆菌结合疫苗五联型疫苗(DTacP-sIPV-Hib联合疫苗)。

本发明的有益效果是：

本发明采用离子色谱法测定DTacP-sIPV-Hib联合疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量，以核糖醇为标示物进行测定，由于其他组分中不存在核糖醇的相关结构，可以排除对于检测产生的干扰。本发明所述方法可进行大批量检测，具有操作简单、灵敏度高、选择性好、重复性强、准确度高等特点，可以为企业标准或行业标准的建立提供重要参考依据。

附图说明

图1、实施例1中的核糖醇标准品组的离子色谱图，附图中各部件的标记如下：1、核糖醇信号峰；2、1.20μg/ml核糖醇标准品；3、1.05μg/ml核糖醇标准品；4、0.75μg/ml核糖醇标准品；5、0.45μg/ml核糖醇标准品；6、0.15μg/ml核糖醇标准品；

图2、实施例5中的DTacP-sIPV-Hib联合疫苗待测样品的离子色谱图，附图中各部件的标记如下：1、核糖醇信号峰；

图3、实施例6中的专属性研究的离子色谱图，附图中各部件的标记如下：1、核糖醇信号峰；2、DTacP-sIPV-Hib疫苗；3、Hib结合疫苗；4、1μg/ml核糖醇标准品；5、DTacP组分；6、DTacP-sIPV组分；7、DTacP-sIPV-Hib疫苗保护剂。

具体实施方式

仪器设备

Dionex公司：

ICS-5000+离子色谱系统(离子色谱仪，脉冲安培检测仪，自动进样器，Chromeleon6.8工作站)；

CarboPac MA1色谱柱分析柱(4mm×250mm)；

CarboPac MA1保护柱(4mm×50mm)；

德国Hettich公司：

Universal 320R高速冷冻离心机。

试剂：

氢氧化钠溶液(色谱纯)，浓盐酸(药用级)，实验用水为去离子水。

样品：

DTacP-sIPV-Hib联合疫苗待测样品，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供。

实验流程：

1、样品预处理

去佐剂：精密量取6ml DTacP-sIPV-Hib联合疫苗置于15ml离心管中，置于高速冷冻离心机内，4℃，6500rpm离心15min，取上清液备用；

去保护剂：精密量取样品5ml置于10kDa超滤离心管内，4℃，6500rpm离心30min，离心后弃滤过液并补加去离子水至5ml，重复该步骤3次；

水解上样：精密量取样品4ml，盛装于10ml试管内，加入200μL盐酸(6mol/L)，振荡混匀，盖上试管塞将试管置于100℃条件下水浴2小时；

水解完成后，待样品冷却至室温。于水解液中加入1.2ml NaOH(1.5mol/L)，混匀，使用0.22μm针头滤器对水解液进行过滤，得到供试品。

将供试品转移至进样管内，上样至离子色谱仪进行检测。

2、标准品工作液组的制备

使用去离子水配制质量浓度分别为0.15、0.45、0.75、1.05、1.20μg/ml的核糖醇标准品工作液组；

水解：将标准品工作液组与盐酸(6mol/L)按照体积比25:1混匀，置于沸水浴中2小时；

将标准品工作液组取出冰浴10min后，加入1.5mol/L NaOH进行中和，混匀后将中和后的标准品工作液组转移至进样瓶内。

3、色谱检测

色谱检测过程包括以下步骤：

打开离子色谱仪，设置检测参数如下：柱温：35℃；检测时间：45min；进样体积：25μL；信号收集速率：1Hz；

配制洗脱液(浓度为350mmol/L的NaOH溶液)，使用氮气脱气，打开柱温箱开关；

打开泵开关，令洗脱液在0.3ml/min流速下冲洗色谱柱、电导检测器，冲洗2小时后打开电极池开关；

当色谱工作站中显示电压数值无明显变化时，将预处理的样品及标准品工作液组进样至离子色谱仪进行分析。

4、绘制标准曲线，通过标准曲线的回归方程(y＝6.8785x+0.0006，式中，x为核糖醇含量，单位为μg/ml；y为目标峰峰面积，单位为nC*min)，根据峰面积计算核糖醇含量，按照核糖醇占B型流感嗜血杆菌多糖干重质量分数(41.3％)计算出B型流感嗜血杆菌多糖含量。

实施例1、检测标示物核糖醇的标准曲线的绘制

配置15μg/ml的核糖醇储备液：精密称取核糖醇标准品15mg，加入去离子水溶解，定容至1000ml，得到终浓度为15μg/ml的核糖醇储备液，置于2～8℃保存。

检测前取出核糖醇储备液平衡至室温，继续使用去离子水对核糖醇储备液逐级稀释后配制成质量浓度分别为0.15、0.45、0.75、1.05、1.20μg/ml的核糖醇标准品工作液组。

将核糖醇标准品工作液组依照上述步骤2～4进行检测，绘制浓度-峰面积关系标准曲线，核糖醇分析的线性范围及相关系数见表1。

表1、核糖醇分析的线性范围及相关系数

实施例2、水解时长的优化过程

使用去离子水将核糖醇储备液稀释制备0.75μg/ml核糖醇标准溶液，与盐酸(6mol/L)按照体积比25:1混匀，置于沸水浴分别水解110min、120min、130min；待水解完成后将各标准品取出冰浴10min，加入1.5mol/L NaOH进行中和。混匀后将中和后的标准品工作液组转移至进样瓶内，依照上述[实验流程]段落中的色谱检测方法进行检测。

实验结果显示，在水解时长110min～130min内，核糖醇标准品峰均与临峰分离情况显示，120min为最优反应时长。

实施例3、水解温度的优化过程：

使用去离子水将核糖醇储备液稀释制备0.75μg/ml核糖醇标准溶液，与盐酸(6mol/L)按照体积比25:1混匀，分别置于90℃、95℃、100℃条件下水浴水解120min，待水解完成后将各标准品取出冰浴10min，加入1.5mol/L NaOH进行中和。混匀后将中和后的标准品工作液组转移至进样瓶内，依照上述[实验流程]段落中的色谱检测方法进行检测。

实验结果显示，在水解温度90℃～100℃内，核糖醇标准品峰均与临峰分离情况显示，100℃为最优反应温度。

实施例4、色谱检测参数的优化过程：

使用去离子水将核糖醇储备液稀释制备0.75μg/ml核糖醇标准溶液，依照上述[实验流程]段落中标准品工作液组的制备中的水解步骤进行水解，并上样至离子色谱仪。

分别采用下列洗脱程序进行检测以分析最优的色谱检测参数，不同的参数如下表2所示：

表2.色谱检测参数优化实验参数

实验结果显示，采用上述3种洗脱程序对同一标准品溶液进行检测，表现出的峰面积关系为：洗脱程序1<洗脱程序2<洗脱程序3，即：随着NaOH浓度减小，核糖醇标准品的峰面积逐渐增大；随着洗脱液流速减小，核糖醇标准品的峰面积逐渐增大。在上述洗脱程序中，洗脱程序3可将核糖醇标准品峰与临峰完全分离，故洗脱程序3(NaOH浓度350mmol/L；流速0.3ml/min)为最优色谱检测参数。

实施例5、对DTacP-sIPV-Hib联合疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的检测方法：

样品：DTacP-sIPV-Hib联合疫苗待测样品

将3份DTacP-sIPV-Hib联合疫苗待测样品依照上述[实验流程]步骤1～4进行检测，每份样品测定3次，依照标准曲线计算出样品内核糖醇含量，再根据核糖醇占B型流感嗜血杆菌多糖干重质量分数(41.3％)计算出B型流感嗜血杆菌多糖含量，取其均值作为最终结果，并计算各样品3次测定的相对标准差RSD。结果显示3份DTacP-sIPV-Hib联合疫苗待测样品内B型流感嗜血杆菌多糖含量分别为11.97μg(RSD＝1.88％)、11.33μg(RSD＝0.71％)、11.32μg(RSD＝0.48％)。

实施例6、检测方法的精密度、准确度、回收率、检测限、专属性实验：

1.精密度-重复性

两组实验分别取同批Hib结合疫苗原液，精密制备26μg/ml的Hib结合物供试品2份，依照上述[实验流程]步骤1～4进行检测，每份样品测定3次，收集核糖醇信号峰峰高、峰面积。检测结果表明峰高、峰面积的批内精密度-重复性RSD分别为2.07％、2.95％，见表3

表3.批内精密度-重复性检测结果

2.精密度-中间精密度

两组实验分别取同批Hib结合疫苗原液，精密制备多糖浓度26μg/ml的Hib结合物供试品1份，依照上述[实验流程]步骤1～4进行检测，每份样品测定3次，收集核糖醇信号峰峰高、峰面积。检测结果表明峰高、峰面积的批内精密度-重复性RSD分别为2.07％、2.95％，见表4。

表4.批内精密度-中间精密度检测结果

3.准确度

精密配置0.2、0.6、1.0μg/ml核糖醇标准品溶液各3份，编为1～9号，分别精密加入等体积1.0μg/ml核糖醇标准品溶液，混匀，制备成低、中、高三个浓度的供试品溶液，依照上述[实验流程]步骤1～4进行检测，每份样品测定3次，代入当日制作的标准曲线，计算样品终浓度，将测得量与理论浓度比较，计算回收率及RSD。检测结果表明低、中、高核糖醇浓度的样品回收率分别为92.8％～100.7％(RSD＝2.37％)、87.1％～91.6％(RSD＝2.35％)、81.3％～94.3％(RSD＝3.97％)见表5。

表5.准确度检测结果

4.检测限

取平衡至室温的核糖醇储备液，使用去离子水对核糖醇储备液逐级稀释后配制成质量浓度分别为10.0、7.5、5.0、2.5、0.5ng/ml的核糖醇工作液组。

将核糖醇工作液组依照上述[实验流程]步骤1～4进行检测，每份样品测定3次，以满足信噪比(S/N)≥3的最低浓度为检测限。检测结果表明，该方法最低检测限为5.0ng/ml。

5.专属性

依照上述[实验流程]步骤1、3，对三类可能引入而产生干扰的物质(DTacP-sIPV-Hib疫苗保护剂、DTacP-sIPV组分、DTacP组分；其各含量与DTacP-sIPV-Hib疫苗内各组分含量一致)进行预处理(水解上样)及色谱检测，

与1μg/ml核糖醇标准品、Hib结合疫苗、DTacP-sIPV-Hib疫苗的谱图进行对比。如图3所示，上述三类干扰物质在核糖醇信号峰区域内均不产生信号峰。表明DTacP-sIPV-Hib疫苗保护剂、DTacP-sIPV组分、DTacP组分在本发明所述的检测方法中不产生干扰。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不对本发明的保护范围加以限定。