一种香菇多糖纳米硒及制备方法以及其在治疗恶性胸腔积液中的应用

摘要

本发明公开了一种香菇多糖纳米硒及制备方法以及其在治疗恶性胸腔积液中的应用。该制备方法包括如下步骤：(1)将香菇多糖、亚硒酸钠和抗坏血酸分别溶于水中，得到对应的溶液；(2)取香菇多糖溶液分别与亚硒酸钠溶液和抗坏血酸溶液混合均匀，得到香菇多糖/亚硒酸钠混合液及香菇多糖/抗坏血酸混合液；(3)将香菇多糖/亚硒酸钠混合液逐滴加入到香菇多糖/抗坏血酸混合液中，搅拌反应，得到香菇多糖纳米硒。本发明经过对比发现，利用本方法制得的香菇多糖纳米硒能够被恶性胸腔积液(MPE)中的免疫细胞所摄取，将处于“冷态”的MPE转变为功能性“热态”，以提高患者的免疫功能，因此，该香菇多糖纳米硒可用于治疗肿瘤以及恶性胸腔积液。

说明书

技术领域

本发明涉及恶性胸腔积液治疗技术领域，特别涉及一种香菇多糖纳米硒及制备方法以及其在治疗恶性胸腔积液中的应用。

背景技术

2018年全球癌症统计数据显示，肺癌仍然是全球癌症发病率(11.6％)和死亡率(18.6％)的首要原因。在新诊断的210万肺癌病例中，大约85％是非小细胞肺癌(NSCLC)。恶性胸腔积液(MPE)以胸膜内存在恶性细胞或转移为特征，约40％的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者发生，肺腺癌(LA)更为常见。

尽管在抗肿瘤治疗领域取得了实质性进展，但LA引起的MPE(MPE-LA)仍面临预后差、预期寿命短(3～12个月)、全身抗肿瘤治疗反应率低等问题。一些依靠表皮生长因子受体(EGFR)-酪氨酸激酶或程序性细胞死亡-1/程序性细胞死亡配体-1(PD-1/PD-L1)抑制剂的先进策略在肿瘤治疗中显示出良好的效果，但上述特殊问题限制了它们在MPE治疗方面的进一步应用。MPE-LA预后不良可能与其自身特点有关。一方面，MPE含有漂浮的恶性细胞，失去了肿瘤血管的支持。这一特征创造了一种天然的“血液-肿瘤屏障”，阻止了常规抗肿瘤药物通过全身循环输送。另一方面，MPE的免疫微环境处于功能性的“冷”态，导致免疫抑制的MPE环境促进肿瘤生长和免疫逃逸。例如，MPE中的B淋巴细胞产生促肿瘤细胞因子，而T细胞和自然杀伤(NK)细胞由于肿瘤细胞呈递能力低而表现出抗原识别能力低下。此外，免疫逃逸的肿瘤细胞在MPE提供的营养物质和血管生成物质的帮助下继续增殖。

虽然血/肿瘤屏障和免疫逃逸有助于肿瘤细胞抵抗常规的抗肿瘤治疗，但免疫细胞仍然从血液中招募并在胸腔中被激活。这些细胞是潜在的治疗靶点，可以通过全身给药直接到达。近年来，有研究表明经过辐照的肿瘤细胞释放的微粒可使耐受的M2肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)重新极化为M1-TAMs，这种治疗增加了PD-L1的表达，加强了随后与抗PD-1的联合治疗，并介导了对顺铂耐药的MPE的治疗。在临床试验中，胸腔内输注肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)比顺铂有更好的治疗疗效。TILs是通过识别肿瘤形成的新抗原而发挥抗癌活性的细胞簇。此外，IL-2在体内通过促进淋巴细胞活化和增殖来抑制MPE中的肿瘤细胞。然而，过量的IL-2会引起发烧、寒战和其他副作用，只有通过停药才能缓解。因此，开发更有效、毒性更低的生物免疫剂对提高MPE-LA的治疗效果仍然至关重要。

纳米药物由于其对先天免疫反应和获得性免疫反应的免疫调节作用，已被广泛应用于抗癌治疗。也就是说，纳米药物可以激活抗原提呈细胞(APC)，作为肿瘤抗原的储存库或刺激细胞免疫。硒(Se)是真核细胞健康和生长所必需的微量元素，在机体免疫调节方面中起重要作用。本实验室在前期的研究中发现多种硒纳米药物，可以增强抗肿瘤免疫治疗效果，突出了硒纳米药物的免疫调节特性。此外，我们发现了各种多糖修饰的SeNPs在体内外都表现出低毒和优异的抗肿瘤效果。香菇多糖(Lentinan，LNT)是从香菇(LentinulaEdodes)子实体中提取的一种具有抗肿瘤、免疫调节和抗感染等多种生物学功能的活性化合物，是一种寄主防御增强剂(HDP)。但现有的多糖以及硒纳米药物对恶性胸腔积液，尤其是肺腺癌引起的恶性胸腔积液几乎没有作用，因此，开发一类可用于治疗恶性胸腔积液的纳米药物具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种香菇多糖纳米硒的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的香菇多糖纳米硒。

本发明的另一目的在于提供所述香菇多糖纳米硒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种香菇多糖纳米硒的制备方法，包括如下步骤：

(1)将香菇多糖(LNT)粉末超声溶解到水中，过滤，得到香菇多糖溶液；将亚硒酸钠(Na

(2)取部分香菇多糖溶液与亚硒酸钠溶液混合均匀，得到香菇多糖/亚硒酸钠混合液；取剩余部分香菇多糖溶液与抗坏血酸溶液混合均匀，得到香菇多糖/抗坏血酸混合液；

(3)在搅拌条件下，将香菇多糖/亚硒酸钠混合液逐滴加入到香菇多糖/抗坏血酸混合液中，再加水后搅拌反应，透析，得到香菇多糖纳米硒。

所述的香菇多糖纳米硒的制备方法，步骤(1)(2)和(3)均在无菌条件进行操作。

步骤(1)中所述的香菇多糖的用量为按每毫升(mL)水配比10mg～20mg香菇多糖计算；优选为按每毫升(mL)水配比15mg香菇多糖计算。

步骤(1)中所述的水优选为无菌超纯水。

步骤(1)中所述的超声的条件为：频率40KHz，功率240W，温度20℃，时间1～5min(优选为2min)。

步骤(1)中所述的过滤为采用无菌滤膜进行过滤；优选为依次用0.45μm的无菌滤膜和/或0.22μm的无菌滤膜过滤；更优选为依次先用0.45μm的无菌滤膜过滤一次，再用0.22μm的无菌滤膜过滤3次以上。

步骤(1)中所述的亚硒酸钠溶液的浓度为5～20mM；优选为10mM。

步骤(1)中所述的抗坏血酸溶液的浓度为20～80mM；优选为40mM。

步骤(1)中所述的亚硒酸钠和抗坏血酸的摩尔比为1～4:4～16；优选为1:4。

步骤(2)中所述的香菇多糖/亚硒酸钠混合液中所用香菇多糖溶液与亚硒酸钠溶液的体积比为1:2。

步骤(2)中所述的香菇多糖/抗坏血酸混合液中所用香菇多糖溶液与抗坏血酸溶液的体积比为1:2。

步骤(3)中所述的搅拌的条件为100～200rpm搅拌20～50min；优选为150rpm搅拌30min。

步骤(3)中所述的加入的水的体积为所述反应体系总体积的2～3倍；优选为所述反应体系总体积的2.33倍。

步骤(3)中所述的搅拌反应的条件为：搅拌速度200～400rpm，反应时间8～12h；优选为：搅拌速度350rpm，反应时间10h。

步骤(3)中所述的透析为采用截留分子量6000～20000kD的透析袋进行透析；优选为采用截留分子量10000kD的透析袋进行透析。

步骤(3)中所述的透析的条件为：透析液为超纯水，透析24h～72h(优选为48h)，每隔8～20h更换一次。

一种香菇多糖纳米硒，通过上述任一项所述的方法制备得到。

所述的香菇多糖纳米硒在制备抗癌药物和/或防治恶性胸腔积液(MPE)的药物中的应用。

所述的抗癌药物包括防治肺癌的药物。

所述的防治肺癌的药物包括肺癌免疫调控药物，该香菇多糖纳米硒可以促进T细胞、NK细胞、B细胞的成熟与分化，并分泌细胞因子，激活免疫应答，降低肺癌相关标志物的表达。

所述的恶性胸腔积液优选为肺腺癌引起的恶性胸腔积液(MPE-LA)，所述香菇多糖纳米硒具有有效调控恶性胸腔积液微环境的效果，免疫激活能力好，且其具有良好的恶性胸腔积液微环境生物响应性能，能够被恶性胸腔积液中的免疫细胞所摄取，促进T细胞、NK细胞、B细胞的成熟与分化并分泌细胞因子，激活免疫应答，降低肺癌相关标志物的表达，将处于免疫抑制的恶性胸腔积液从“冷”态转变为“热”态(即激活被抑制的免疫微环境)，从而实现治疗肺腺癌相关恶性胸腔积液的效果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)通过检测临床肺腺癌相关恶性胸腔积液患者血液及积液中的硒含量我们发现，该类患者的血硒浓度明显低于健康人，且积液中的硒含量更低，这说明肺腺癌恶性胸腔积液患者处于缺硒状态，通过补硒将改善机体的免疫力来预防恶性胸腔积液的发生。

(2)本发明为改善恶性胸腔积液免疫微环境的被抑制状态，基于硒纳米药物具有良好的免疫增强性能，选取香菇多糖纳米硒作为治疗恶性胸腔积液的新药物，特别是作为临床肺腺癌相关恶性胸腔积液防治的综合手段之一。

(3)本发明通过香菇多糖纳米硒形貌及结构的分析，发现香菇多糖在胸腔积液中的形貌及结构随时间的变化而发生一系列改变，说明其具有良好的生物响应性能和生物相容性。

(4)本发明通过免疫细胞生物电镜切片发现，香菇多糖能被积液中的免疫细胞所摄取，提高了其生物利用率，同时说明其具有良好的生物安全性。

(5)本发明通过对比不同类型的含硒纳米药物(亚硒酸钠，硒代蛋氨酸，硒代胱氨酸、纳米硒)，不同类型的多糖如壳聚糖(CS)、虎奶菇多糖(PTR)、枸杞多糖(LBP)、香菇多糖(LNT)，不同多糖修饰的纳米硒如壳聚糖纳米硒(SeNPs@CS)、虎奶菇多糖纳米硒(SeNPs@PTR)、枸杞多糖纳米硒(SeNPs@LBP)、香菇多糖纳米硒(SeNPs@LNT)，发现通过本方法制备的香菇多糖纳米硒调控MPE微环境中NK细胞和CD4

(6)本发明通过免疫细胞功能分析，发现香菇多糖纳米硒能刺激MPE微环境中的T细胞、NK细胞、B细胞等积极响应免疫应答，提高患者的免疫功能，并在抗肿瘤中发挥积极作用。

(7)本发明通过代谢组学分析，发现香菇多糖纳米硒能够下调肺癌相关标志物的表达，而上调免疫应答相关分子的表达，从而达到治疗MPE的目的。

附图说明

图1是肺腺癌相关恶性胸腔积液(MPE-LA)患者的诊断和临床鉴定结果图；其中，A为诊断程序(I～III为胸部CT扫描：I为右上叶肿瘤(黄色箭头标识)；II为右侧胸膜弥漫性增厚和积液(黄色箭头标识右上叶肿瘤)；III为其中1例患者在治疗6个月后服用250mg吉非替尼，右肺实变性肿块明显改善，胸腔积液消失；IV和V为超声引导下胸膜活检：IV为胸膜增厚和胸腔积液；V：活检可见胸膜增厚；VI～IX为胸膜活检组织化学染色：VI中H&E染色表明是腺癌；VII中免疫组织化学显示肿瘤细胞TTF-1阳性；VIII表示NapsinA低表达；IX表示PD-L1阴性)；B和C分别为分析对比肺癌腺相关胸腔积液患者和初诊肺癌患者血液及胸腔积液中LDH、CEA的含量(*P<0.05，**P<0.01)。

图2是原子荧光光谱法测定健康人群(Health)血液、肺腺癌胸患者血液及腔积液中的硒浓度图。

图3是香菇多糖纳米硒(SeNPs@LNT)在MPE微环境中的响应结果图；其中，A为SeNPs@LNT在MPE中孵育48小时发生形态和结构变化示意图；B为SeNPs@LNT的TEM图像；C为HR-TEM图像和HR-TEM-EDS图像；D和E为AFM图像；F和G为SeNPs@LNT在MPE中37℃条件下孵育24小时的TEM图像；H和I为原子力显微镜图像(24h)；J和K为SeNPs@LNT在MPE中37℃条件下孵育48小时的TEM图像；L和M为原子力显微镜图像(48h)；N为SeNPs@LNT在MPE中孵育不同时间的拉曼光谱；O为SeNPs@LNT在MPE中孵育不同时间的XPS光谱；P为SeNPs@LNT在MPE中孵育不同时间的Se 3d精细谱。

图4是香菇多糖纳米硒(SeNPs@LNT)被MPE中的巨噬细胞摄取后的生物电镜切片图；其中，A为巨噬细胞摄取SeNPs@LNT途径示意图；B和C分别为SeNPs@LNT在37℃条件下处理4h和24h的巨噬细胞超薄切片图；a,b为局部放大图(主要累积在溶酶体中，a和b中红色箭头标识SeNPs@LNT)。

图5是不同类型的硒对MPE微环境中NK细胞的调节作用图；其中，A为流式细胞术检测不同类型的硒处理24h后患者MPE中NK细胞(CD3

图6是不同类型的多糖对MPE微环境中NK细胞的调节作用图；其中，A为流式细胞术检测不同类型的单一多糖处理24h后患者MPE中NK细胞(CD3

图7是不同多糖修饰的纳米硒对MPE微环境中NK细胞的调节作用图；其中，A为流式细胞术检测不同多糖修饰的纳米硒处理24h后患者MPE中NK细胞(CD3

图8是不同浓度的香菇多糖纳米硒(SeNPs@LNT)对MPE微环境中NK细胞和CD4

图9是优选的SeCys和SeNPs@LNT对MPE微环境中免疫细胞功能的调节作用对比图；其中，A为多功能流式细胞仪检测SeCys和SeNPs@LNT作用24h后MPE中T淋巴细胞的百分比；B为多功能流式细胞仪检测SeCys和SeNPs@LNT作用24h后MPE中T细胞因子的百分比；C为多功能流式细胞仪检测SeCys和SeNPs@LNT作用24h后MPE中NK细胞、γδT细胞和B细胞的百分比。

图10是代谢组学检测SeNPs@LNT对MPE中代谢物(负离子模式)的影响图；其中，A为主成分分析(PCA)；B为偏最小二乘判别分析(PLS-DA)散点图；C～F为SeNPs@LNT处理前后对MPE中代谢产物生物学过程的影响(*P<0.05，**P<0.01)；G为差异代谢物的热图；H为差异代谢物的火山图(每个点都代表一种代谢物：上调，红点；下调，绿点；点的大小表示VIP值)；I为用超几何检验算法研究了两组差异代谢物KEGG富集相关的代谢途径(点的颜色表示超几何测试的p值；值越小，测试的可靠性在统计上越显著；点的大小代表了相应路径中差异代谢物的数量，路径中差异代谢物的数量越大，该路径中的差异代谢物就越多)。

图11是代谢组学检测SeNPs@LNT对MPE中代谢物(正离子模式)的影响图；其中，A为主成分分析(PCA)；B为偏最小二乘判别分析(PLS-DA)散点图；C～E为SeNPs@LNT处理前后对MPE中代谢产物生物学过程的影响(*P<0.05，**P<0.01)；F为差异代谢物的热图；G为差异代谢物的火山图(每个点都代表一种代谢物：上调，红点；下调，绿点；点的大小表示VIP值)；H为用超几何检验算法研究了两组差异代谢物KEGG富集相关的代谢途径(点的颜色表示超几何测试的p值；值越小，测试的可靠性在统计上越显著；点的大小代表了相应路径中差异代谢物的数量，路径中差异代谢物的数量越大，该路径中的差异代谢物就越多)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1肺腺癌相关恶性胸腔积液(MPE-LA)患者的诊断和临床鉴定

对20名肺腺癌相关恶性胸腔积液患者均进行高分辨率胸部CT扫描，均有MPE或胸膜肺累积。在胸膜活检前，收集所有受试者的胸腔积液进行生化分析。然后，采用超声引导下切割针活检与常规胸膜活检相结合的方法进行胸膜活检。收集超过50mL的胸腔积液进行细胞学检查(H&E染色；NapsinA表达和PD-L1分别是用免疫组化检测得到；乳酸脱氢酶(LDH)和癌胚抗原(CEA)用相应的市售检测试剂盒检测得到)。

诊断结果(由于20名患者的检测结果相近，因此这里只展示了其中一个患者的检测结果)如图1所示：图1A中(I-III)胸部CT的扫描结果显示肺右上叶有肿瘤、右侧胸膜弥漫性增厚和积液(III为其中的1例患者在治疗6个月后(每天口服250mg吉非替尼)，右肺实变性肿块明显改善，胸腔积液消失)；超声引导下胸膜活检结果表明胸膜增厚和胸腔积液(见图1A中的IV)，活检针尖可见胸膜增厚(见图1A中的V)；H&E染色表明是肺腺癌(见图1A中的VI)；免疫组化显示肿瘤细胞TTF-1阳性(见图1A中的VII)；NapsinA低表达(见图1A中的VIII)，PD-L1阴性(见图1A中的IX)。图1B和图1C表明肺癌腺相关胸腔积液患者(MPE-LApatient)的血液及胸腔积液中LDH、CEA的含量均高于初诊肺癌患者(ND)(*P<0.05，**P<0.01)。以此为依据，本发明中所选用的研究对象为肺腺癌相关恶性胸腔积液(MPE-LA)。

实施例2肺腺癌相关恶性胸腔积液患者血液及积液中硒含量的检测

收集肺腺癌相关恶性胸腔积液患者的血液于4℃，3000rpm离心5min，取上清，用体积比为3:1的硝酸和高氯酸(硝酸：16mol/L,高氯酸:12.38mol/L)于180℃消化，取肺腺癌相关恶性胸腔积液患者的积液样本用同样的方法消化，用原子荧光光谱检测硒含量。以健康人的血液样本为对照。

检测结果如图2所示：健康人的血硒含量约为232.6μg/L，而肺腺癌相关MPE患者的血硒含量约为139.6μg/L，可见MPE患者明显处于缺硒状态。此外，MPE中硒含量仅为106.4μg/L。经过上述的初步研究我们认为，肺腺癌相关MPE的形成可能与机体缺硒密切相关，因此通过补硒可以最直接、最快、最有效的增强机体的抗病能力，这对处于免疫功能低下状态的肺腺癌患者而言，无疑是增加了一道抗感染及预防MPE的坚固防线。

实施例3香菇多糖纳米硒的制备、形貌与结构表征

(1)①无菌条件下，将75mg香菇多糖(LNT)(陕西森弗生物技术有限公司)粉末溶于5mL无菌超纯水中，在频率为40KHz、功率为240W、温度为20℃的件下超声使其充分溶解(时间2min)；用0.45μm的无菌滤膜过滤一次；再用0.22μm的无菌滤膜过滤3次，得到香菇多糖溶液；

②无菌条件下，将0.0176g亚硒酸钠(Na

③无菌条件下，将0.0704g抗坏血酸(Vc)粉末溶于10mL无菌超纯水中并用0.22μm的无菌滤膜过滤，得到抗坏血酸溶液；

④无菌条件下，各取1mL香菇多糖溶液分别与2mL亚硒酸钠溶液和2mL抗坏血酸溶液混合均匀，得到香菇多糖/亚硒酸钠混合液以及香菇多糖/抗坏血酸混合液；

⑤150rpm搅拌条件下将香菇多糖/亚硒酸钠混合液逐滴加入到香菇多糖/抗坏血酸混合液中，用时5min，然后用无菌水定容到20mL，继续搅拌，30min后将搅拌速度调为350rpm，继续反应10h；用无菌超纯水纯化(这是透析袋的截留分子量10000kD，每隔12h更换一次)48h，得到香菇多糖纳米硒(SeNPs@LNT)。

(2)取上述制备的菇多糖纳米硒(50μL)用体积比为3:1的硝酸和高氯酸(硝酸：16mol/L,高氯酸:12.38mol/L)消化(180℃，5h)后用原子荧光光谱检测硒含量，用透射电子显微镜(TEM)、高分辨投射电子显微镜(HR-TEM)、原子力显微镜(AFM)、拉曼光谱及X射线光电子能谱(XPS)等对其结构进行表征。

(3)将香菇多糖纳米硒加入到恶性胸腔积液(来自肺腺癌患者)(香菇多糖纳米硒的终浓度为80μM)中孵育(37℃)不同时间(24h、48h)，1500rpm离心5min，取上清液或将上清液冷冻干燥得到粉末样品，对其结构进行TEM、AFM、拉曼及X-射线光电子能谱(XPS)等表征。

结果如图3所示：本发明所制备的SeNPs@LNT是粒径约为160nm的纳米球(图3B,3C)；纳米球的表面光滑，且表面高度为11.5nm～13.3nm(图3D,3E)。由图3F～3I可以看出，SeNPs@LNT在MPE中孵育24h后，致密的纳米球开始变得松散，粒径增大至180nm，表面变得粗糙，甚至有一部分裂解成高度为0.95nm小颗粒；继续孵育至48h时(图3J～3M)，纳米球完全发生裂解，同时也看到有部分分解后的纳米颗粒被MPE中的蛋白所吸附形成了“蛋白-纳米花”，其表面高度约为4.3nm。拉曼光谱如图3N所示，在原始的SeNPs@LNT结构中，252cm

X-射线光电子能谱(XPS)同样也可以验证SeNPs@LNT在MPE中的结构变化过程(图3O)，详细地，如图3P所示，在0h的光谱图中存在Se的特征结合能峰(55.95eV)，在MPE中孵育24h后52.66eV处出现Se的3d

实施例4 MPE中免疫细胞对香菇多糖纳米硒(SeNPs@LNT)的摄取

将来自患者的肺腺癌相关恶性胸腔积液用200目的无菌尼龙网过滤后加入终浓度为8μM的SeNPs@LNT(实施例3制备)，37℃条件下继续孵育4h或24h，1500rpm离心5min收集沉淀，用红细胞裂解液(北京康为世纪生物科技有限公司)裂解2～3次，离心并收集沉淀，用2.5％(v/v)的电镜固定液(康迪斯(湖北)化工有限公司，货号KDS0000053)于4℃下固定4h，用PBS漂洗两次，用1％(w/v)的锇酸固定2h，梯度洗脱，包埋，切片，TEM观察。

结果如图4所示:37℃条件下SeNPs@LNT分别孵育MPE 4h和24h后，被MPE中的巨噬细胞所摄取并主要累积在溶酶体中，在巨噬细胞摄取SeNPs@LNT的整个过程中细胞的形貌并未发生明显的改变，溶酶体结构完整，这一结果表明本发明所合成的SeNPs@LNT可以被MPE中的免疫细胞所摄取而不会对其产生毒性，进一步说明SeNPs@LNT具有良好的生物安全性使其表现出优异的MPE免疫调控功能。

实施例5不同类型的硒、不同类型的多糖、不同多糖修饰的纳米硒对MPE微环境中NK细胞的调节作用

(1)将来自患者的肺腺癌相关恶性胸腔积液用200目的无菌尼龙网过滤后分别加入终浓度为8μM(以Se计)的亚硒酸钠(Na

结果如图5、图6、图7所示：相比于不同类型的硒或是多糖，香菇多糖纳米硒对NK细胞的正向免疫调节作用最为显著，即使NK细胞的比例由原来的10.98％分别升高至46.34％，由此可见，SeNPs@LNT在提高机体免疫力的同时还能很好地维持NK细胞的活性且效果优于其余几种硒以及多糖。

(2)按照上述步骤(1)的方法，将恶性胸腔积液(来自肺腺癌患者)用200目的无菌尼龙网过滤后分别加入终浓度为4、6和8μM(以Se计)的SeNPs@LNT进行孵育，最后用流式细胞仪检测NK细胞和CD4

结果如图8所示：图8表明SeNPs@LNT对NK细胞和CD4

实施例6 SeCys和SeNPs@LNT对MPE微环境中免疫细胞功能的调节作用

将来自患者的肺腺癌相关恶性胸腔积液用200目的无菌尼龙网过滤后分别加入终浓度为8μM的硒代胱氨酸(SeCys)和SeNPs@LNT(实施例3制备)，37℃条件下继续孵育24h，1500rpm离心5min收集沉淀，用红细胞裂解液裂解2～3次，离心并收集沉淀，加入100μL含有相应抗体)的PBS，4℃避光染色20min，PBS洗涤后重悬在300μL PBS中，多功能流式细胞仪检测个免疫细胞及细胞因子的比例(这部分检测委托武汉双知普锐医学检验实验室有限公司进行检测)。

结果如图9A所示，SeNPs@LNT组的作用效果明显优于SeCys组，例如经SeNPs@LNT处理24h后，能够特异性直接杀伤靶细胞同时使机体对各种病毒感染做出免疫反应能力的杀伤性T细胞由14.9％提高至23.8％，值得注意的是，回巢性记忆CD8

我们发现SeNPs@LNT可有效提高Thf1的表达率，即由原来的3.2％增加至16.1％(图9B)。细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,Tc细胞)能直接攻击带异抗原的肿瘤细胞、病毒感染细胞和异体细胞，其中Tc1细胞与抗感染过程相关，和Th1细胞亚群非常相似，同样在SeNPs@LNT的刺激下，MPE微环境中Tc1细胞的表达率由原来的4.2％升高到13.6％(图9B)。综上，我们认为，SeNPs@LNT对MPE微环境中的Th/Tfh/Tc细胞的表达率的升高在一定程度上具有正向免疫调节作用，这对进一步阐明MPE微环境的免疫状态具有指导意义，同时也为肺腺癌所引起的MPE检测提供临床依据。

NK细胞作为机体最重要的免疫细胞，不仅参与抗肿瘤免疫反应，而且能够识别靶细胞、杀伤介质。经过我们的研究发现，SeNPs@LNT刺激后的患者MPE中晚期功能阻断性NK细胞表达率从对照组的8.2％降低至1.8％，而SeCys组仅降低至4.5％(图9C)。NK细胞作为人体抗肿瘤的第一道防线，SeNPs@LNT对NK细胞表现出非常有利的的调控作用，这也很好的说明纳米硒在将来用于临床免疫治疗MPE具有广阔的前景。γδT细胞主要分布于人体的肠道、呼吸道以及泌尿生殖道和皮下组织，因此对于粘膜方面的癌症治疗效果突出，例如消化道、呼吸道、生殖系统等方面的癌症效果显著。我们对SeNPs@LNT处理后的MPE进行了γδT细胞功能方面的详细研究，结果发现γδT细胞的表达率明显上升(处理组为8.1％，对照组2.7％，SeCys组7.1％)(图9C)，由此可见，机体通过摄取纳米硒提高体内NK细胞的表达率将成为激活自身免疫战胜癌症的有效途径。

机体中的B细胞受抗原刺激后分化增殖为浆细胞合成抗体参与免疫调节如感染、肿瘤等诸多疾病。经过研究我们发现，SeNPs@LNT可使MPE微环境中B细胞的表达率上升(图9C)，开始大量分泌抗体，发挥体液免疫的功能。虽然B细胞在肿瘤免疫中的研究不及T细胞广泛，但目前越来越多的研究显示出B细胞在这一领域的重要性，而且B细胞作为肿瘤免疫治疗的靶细胞已开始应用于临床并显示出其广阔的前景。

上述结果表明，SeNPs@LNT能够刺激MPE微环境中的各种免疫细胞促进免疫应答，提高患者的免疫功能，并在抗肿瘤中发挥积极作用，且作用效果比SeCys显著，因此通过补充适量的香菇多糖纳米硒来增强机体的体液免疫功能、细胞免疫功能和非特异性免疫功能来有效增强机体的抗病能力是值得在临床上推广使用的。

实施例7代谢组学检测优选的SeNPs@LNT对MPE微环境中各代谢物的影响

将来自患者的肺腺癌相关恶性胸腔积液用200目的无菌尼龙网过滤后分别加入终浓度为8μM SeNPs@LNT，37℃条件下继续孵育24h，用LC-MS/MS分析(委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行检测分析)，UHPLC-MS/MS产生的数据文件用化合物Discoverer 3.1(CD3.1，Thermo Fisher)处理，对每种代谢物进行峰比对、峰挑选和定量。

结果如图10和图11所示：主成分分析(PCA)得分图(图10A和图11A)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)(图10B和图11B)验证了我们的分析方法可行。具体地说，总共筛选了61种不同的代谢物(包括33种负离子模式和28种正离子模式)，并将其以热图的形式展示在图10G和图11F中。值得注意的是，表现出明显的上调的代谢物(正离子模式有14种，负离子模式有9)，下调的代谢物(正离子模式有19种，负离子模式有19)(图10H和图11G)。更详细地说，SeNPs@LNT作用后，参与肿瘤生长抑制和免疫系统激活的代谢物水平增加(图10C，图10D和图11C)。相反，与肺癌标志物(图10E)、凋亡抑制(图10F)和肿瘤生长相关的代谢物水平下降(图11D)。此外，SeNPs@LNT有效地上调了抗炎代谢物N-乙酰5-羟色胺(N-Acetylserotonin)水平1.4倍(图11E)。

我们还取得了另一个重要发现：SeNPs@LNT处理后，羟基脂肪酸脂肪酸酯(FAHFA)(20：1/14：1)、FAHFA(18：1/8：0)和FAHFA(2：0/22：1)水平降低(图11F)。最近，有研究表明，与正常组织相比，肿瘤组织中的FAHFA水平升高，并且在较宽的浓度范围内不能诱导大肠癌细胞系的凋亡。在我们的研究中，FAHFAs的下调伴随着肺癌标志物表达的降低，特别是2，4-二羟基苯甲酸的表达。然后，我们使用KEGG途径富集来鉴定在SeNPs@LNT处理的MPE中发生实质性变化的生物学过程。SeNPs@LNT选择性地调节MPE中的代谢途径，包括各种氨基酸和维生素B6的代谢途径(图10I和图11H)。有研究发现维生素B6分解代谢增加与肺癌风险增加有关。然而，我们观察到SeNPs@LNT孵育24h后，维生素B6代谢途径中富集的4-吡哆酸水平下降，表明SeNPs@LNT是治疗MPE-LA的候选药物。综上，我们的研究表明SeNPs@LNT可以下调FAHFAs和肺癌标志物等关键的凋亡抑制因子，上调具有抗炎活性和免疫激活特性的代谢物水平，调节各种氨基酸和维生素B6的代谢。因此香菇多糖纳米硒很有可能成为治疗肺腺癌相关MPE的候选药物。

总结

选用香菇作为表面修饰剂，在无菌条件下制备了具有MPE微环境响应性能的纳米硒，并表现出良好的生物相容性、生物可降解性和安全性；通过对比亚硒酸钠、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、纳米硒、壳聚糖、虎奶菇多糖、枸杞多糖、香菇多糖、壳聚糖纳米硒、虎奶菇多糖纳米硒、枸杞多糖纳米硒和香菇多糖纳米硒，我们发现香菇多糖纳米硒对肺癌腺相关恶性胸腔积液表现出积极有效的调控作用，免疫激活能力好，能够被恶性胸腔积液中的免疫细胞所摄取，促进T细胞、NK细胞、B细胞的成熟与分化并分泌细胞因子，激活免疫应答，降低肺癌相关标志物的表达，将处于免疫抑制的恶性胸腔积液从“冷”态转变为“热”态，从而实现治疗肺腺癌相关恶性胸腔积液的效果。

综上所述，本研究不仅展示了香菇多糖纳米硒对肺腺癌相关恶性胸腔积液的免疫调控与治疗效果，而且为纳米材料的肺腺癌相关恶性胸腔积液的防治机制及今后在恶性胸腔积液免疫治疗中的临床应用提供了更多的证据。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。