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一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法

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本发明涉及一种绿色荧光蛋白替换Fiber‑2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，本发明利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体，将病毒的毒力基因之一F2进行删除，纯化后成功获得了表达EGFP的F2完全缺失的重组FAdV4病毒，在体内及体外实验结果均显示，FAV4‑EGFP‑rF2重组病毒毒力显著降低，且攻毒后保护率很好，由此可见，本发明提供的F2完全缺失型重组病毒不仅能够为FAdV‑4的防控提供生物材料，同时EGFP替换F2的位置可以作为插入其他病原保护性抗原的插入位点，为构建FAdV‑4重组多价苗提供了坚实的理论依据。

著录项

公开/公告号CN113005102A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-06-22

原文格式PDF
申请/专利权人扬州大学;
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申请/专利号CN202110332457.2
发明设计人叶建强;谢泉;穆雅茹;秦爱建;邵红霞;万志敏;李拓凡;
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申请日2021-03-29
分类号C12N7/01(20060101);C12N7/04(20060101);C12N15/85(20060101);C12N15/65(20060101);C12N15/55(20060101);C12N15/34(20060101);C12R1/93(20060101);
代理机构32222 扬州苏中专利事务所(普通合伙);
代理人沈志海
地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号
入库时间 2023-06-19 11:34:14

说明书

技术领域

本发明涉及一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无FAdV-4的疫苗。此前有报道五邻体、六邻体、纤突蛋白F1和纤突蛋白F2等亚单位疫苗均能够提供一定的保护率，考虑到亚单位疫苗的保护率不如全病毒灭活苗，而全病毒灭活苗的制备成本较高，且不能激活机体的细胞免疫。因此，考虑本发明的亮点是将禽腺病毒的毒力基因删除，获得高度致弱的禽腺病毒，作为一种弱毒疫苗，能够同时激活机体的体液免疫和细胞免疫，达到很好的保护力。与此同时，F2基因删除的位置也可以考虑作为外源基因的插入位点，从而插入外源基因，构建二价苗，甚至多价苗。

CRISPR-Cas9技术作为古细菌的免疫系统，近年来得到了快速的发展和应用，从真核生物到原核生物，从病毒到真菌，被广泛应用于各个方面。本发明利用CRISPR-Cas9技术对禽腺病毒进行编辑，通过同源重组修复，获得F2完全缺失的重组血清4型禽腺病毒，为禽腺病毒的防控打下坚实的理论基础。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，可供插入其他病原保护性抗原的位点。本发明的原理和最核心的关键技术是通过CRISPR-Cas9技术将毒力基因F2删除，并用标签蛋白EGFP替换。随后利用EGFP进行病毒纯化，获得可以稳定扩增的重组禽腺病毒。

本发明的目的是这样实现的，一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为野生型血清4型禽腺病毒SD株；

所述重组血清4型禽腺病毒的外源基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP，在激发光的照射下发出绿色荧光，作为插入位点的荧光标签分子，其序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1为：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA。

所述的重组血清4型禽腺病毒，其中EGFP插入的位置落在Fiber 1阅读框结束后，Fiber 2基因的第19位碱基开始，具体的序列如SEQ ID NO.2；

SEQ ID NO.2为：

ATGCTCCGGGCCCCTAAAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA。

一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，制备方法包括如下步骤：

(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对Fiber 2基因上下游位置的sgRNA，选择分数较高排名靠前的sgRNA，其序列如表1所示；

表1.针对Fiber 2基因上下游位置的sgRNA序列

(2)通过overlap-PCR构建标签分子EGFP替换Fiber2基因的供体质粒，overlap-PCR使用的引物序列如表2所示；

表2.构建供体质粒所用的PCR序列

(3)在转染的前一天铺LMH细胞，次日转染两条sgRNA和供体质粒各2ug，转染6h后换成10％生长液；

(4)转染48h后感染FAdV4，2h后换成1％维持液；

(5)感染FAdV4后每天观察荧光，挑取荧光斑，利用空斑实验和有限稀释法，通过筛选绿色荧光的方法进行纯化，获得表达EGFP的F2完全缺失型FAdV4重组病毒。

LMH细胞系为鸡肝癌细胞。

通过本发明，本发明利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体，将病毒的毒力基因之一F2进行删除，纯化后成功获得了表达EGFP的F2完全缺失的重组FAdV4病毒，在体内及体外实验结果均显示，FAV4-EGFP-rF2重组病毒毒力显著降低，且攻毒后保护率很好，由此可见，本发明提供的F2完全缺失型重组病毒不仅能够为FAdV-4的防控提供生物材料，同时EGFP替换F2的位置可以作为插入其他病原保护性抗原的插入位点，为构建FAdV-4重组多价苗提供了坚实的理论依据。

附图说明

图1为本发明的构建流程图。

图2为PCR扩增EGFP基因和同源臂的电泳图；

泳道M：super DNA marker；泳道1：EGFP基因；泳道2：线性化的HAL-HAR质粒。

图3为拯救重组病毒P0代荧光图；

图a：感染FAdV-4后24h荧光图；图b：感染FAdV-4后48h荧光图；图c：仅转染供体质粒对照图；图d：LMH细胞对照图。

图4为PCR鉴定纯化前后的重组FAdV4-EGFP病毒；

泳道M：super DNA marker；泳道1：P0代重组FAV4-EGFP-rF2病毒；泳道2：纯化后重组FAV4-EGFP-rF2病毒；泳道3：野生型FAdV-4病毒基因组；泳道4：空白对照。

图5为FAV4-EGFP-rF2重组病毒生长曲线图。

图6为SPF鸡群感染FAV4-EGFP-rF2重组病毒后体内中和抗体水平检测。

图7为存活的鸡群攻毒FAdV-4后的生存曲线图。

具体实施方式

实施例：

1,禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBS制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为禽腺病毒后，－20℃保存。

2，禽腺病毒基因组的制备：取禽腺病毒分离毒株病毒上清400uL于1.5mL指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时；加入400uLTris平衡酚，充分混匀后10000r/min离心10分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入400uL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得血清4型禽腺病毒基因组，置-20℃备用。

3，根据Fiber 2的基因，利用sgRNA在线设计网站(http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp和http://crispr.mit.edu)进行sgRNA序列设计。将设计好的sgRNA分别克隆到lentiCRISPR v2质粒，并通过测序验证构建成功：具体sgRNA序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1.针对Fiber 2基因上下游位置的sgRNA序列

4,EGFP-rF2供体质粒的构建：以pcDNA3.1-EGFP质粒为模板扩增EGFP基因，以HAL-EGFP-F2-HAR供体质粒为模板进行线性化扩增以获得线性化的HAL-HAR(如图2)，电泳后进行胶回收，通过同源重组将EGFP和HAL-HAR进行连接，最终获得重组病毒的供体质粒HAL-EGFP-HAR。构建供体质粒所用的引物序列见表2，其中HAL-EGFP-F2-HAR供体质粒的序列如SEQ ID NO.5。

表2.构建供体质粒所用的PCR序列

5，重组FAV4-EGFP-rF2病毒的拯救：转染前一天在6孔板中铺LMH细胞，每孔120-150w细胞；次日细胞密度生长至80％左右准备转染，2条sgRNA和供体质粒各2ug，利用2uL转染试剂Mirus与1ug质粒2：1的比例进行室温孵育45min，孵育结束后将转染试剂和质粒混合物滴加到预先用Opti-MEM覆盖的细胞中转染，转染6h后换成10％生长液。转染48h后，弃去生长液，用0.1MOI的FAdV-4感染LMH细胞，感染2h后弃去病毒，换成1％维持液。感染病毒后，每天用荧光显微镜观察细胞中是否出现荧光斑(如图3)。

6，重组FAV4-EGFP-rF2病毒的纯化及鉴定：将拯救的重组FAV4-EGFP-rF2病毒进行挑取荧光斑，利用空斑纯化技术和有限稀释法进行纯化，最终获得纯化的重组FAV4-EGFP-rF2病毒(如图4)，通过针对插入位点上下游附近的引物进行PCR鉴定，PCR所用的引物见表3。

表3.PCR扩增鉴定重组病毒的引物

7,重组FAV4-EGFP-rF2病毒体外生长曲线的绘制：在铺有LMH细胞的6孔板中分别接种拯救的重组FAV4-EGFP-rF2和野生型FAdV-4，接种量为0.1MOI，接种后分别在24h、48h、72h、96h和120h时间点收取病毒上清，之后进行TCID50测定上清中的病毒滴度(如图5)。结果显示重组病毒FAV4-EGFP-rF2与FAdV-4相比，两个病毒的复制曲线相似，但是重组病毒复制速度明显较慢，且最高滴度比FAdV-4低100-1000倍。

8，重组FAV4-EGFP-rF2病毒体内致病性的评估及攻毒保护试验：将18只2周龄的SPF鸡随机分为3组，即实验组、共饲组和对照组。之后实验组用1.6×10

SEQ ID NO.1

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列：

SEQ ID NO.2

血清4型禽腺病毒Fiber 2基因序列：

SEQ ID NO.5

HAL-EGFP-F2-HAR基因序列：

GGTGACCTACTGACCCTCAACACCAAAACGCCCATTTACGTCAGCGATCGAGCGGTCAGTCTGCTCATCGATGACAATACTTTGGCCACTAAGCAAGCCAACGGGGCGCTCATGGTCAAAACCGCGGCCCCTCTGAACTCGGGCACTGGTGGAGGCGTCACGCTAGGCTTCGACCCTCGCACCATGGCGCTAGATTCCGTCACCGGGGTGCTCAAAGTGCTCGTCGACTCACAGGGACCTCTACAAGCCGACACGGGAGGCATCACTCTCCAGTTCGACACTCAAGACTTCGTTGTCAACAATGGCGTCTTAGCGCTAGCCTCCTCGGTCGGTCCGACCTATCTGAGCCCCTTTGCGACCTACGAAGTCACGCCCGTCTTGGGAATATCGCAGAGGAACGGCAACGTAAAAAGCAAGGGCTTGCAAAACTGGTCCATAGGCTATTACATCTACATGGTGAGCTCAGCCGGGCTAGTCAACGGACTCATCACTCTGGAGCTAGCCCATGACCTCACAGGCGCGAGCGGAGAAAACAGCCTGACTAGCGGTCTCAACTTTACCTTTGTGCTCAGCCCCATGTACCCGATAGAAACAGAGGTGAATTTGTCCCTCATCGTGCCGCCCACGGTCTCGCCGACCAATCAAAACCACGTGTTTGTGCCCAATAGCAACCAGAGCGACGTGGGCTATCTCGGGCTGCCGCCTCATACCAGGGACAATTGGTACGTGCCCATCGACTCGCCCGGCCTGCGGCTCGTCTCTTTCATGCCCACCGCCACCGGAAACGAGAAATTCGGACAGGGCACGTTGGGATACTGCGCCGCCACCATCCAGAACACGTCCAGCGGAACCACGCCGTCGGATGCGATAGCCTTCACTGTCTCGCTGCCGCAGACCTCCGGCTCCAACTGGTTTGACCAGAACGCGCCCGACACTGTGGTGACGACCGGTCCTATCCCTTTTTCCTATCAGGGTTACGTCTACTCCCCCAACGGGAACAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTCCGAAAACGGGAAGCCCGAGACCGAAGCGGGACCTTCCCCGGCTCCAATCAAGCGCGCCAAACGCATGGTGAGAGCATCCCAGCTTGACCTGGTTTATCCTTTCGATTACGTGGCCGACCCCGTCGGAGGGCTCAACCCGCCTTTTTTGGGAGGCTCAGGACCCCTAGTGGACCAGGGCGGACAGCTTACGCTCAACGTCACCGATCCCATCATCATCAAGAACAGATCGGTGGACTTGGCCCACGACCCCAGTCTCGATGTCAACGCCCAAGGTCAACTGGCGGTGGCCGTTGACCCCGAAGGGGCCCTGGACATCACCCCCGATGGACTGGACGTCAAGGTCGACGGAGTGACCGTAATGGTCAACGATGACTGGGAACTGGCCGTAAAAGTCGACCCGTCCGGCGGATTGGATtCCACCGCGGGTGGACTGGGGGTCAGCGTGGACGACACCTTGCTCGTGGATCAGGGAGAACTGGGCGTACACCTCAACCAACAAGGACCCATCACTGCCGATAGCAGTGGTATCGACCTCGAGATCAATCCTAACATGTTCACGGTCAACACCTCGACCGGAAGCGGAGTGCTGGAACTCAACCTAAAAGCGCAGGGAGGCATCCAAGCCGACAGTTCGGGAGTGGGCGTTTCCGTGGATGAAAGCCTACAGATTGTCAACAACACTCTGGAAGTGAAACCGGATCCCAGCGGACCGCTTACGGTCTCCGCCAATGGCCTAGGGCTGAAGTACGACACTAATACCCTAGCGGTGACCGCGGGCGCTTTAACCGTGGTCGGAGGGGGGAGCGTCTCCACACCCATCGCTACTTTTGTCTCGGGAAGTCCCAGCCTCAACACCTACAATGCCACGACCGTCAATTCCAGCGCGAACGCCTTCTCTTGCGCCTACTACCTTCAACAGTGGAACATACAGGGGCTCCTTGTTACCTCCCTCTACTTGAAATTGGACAGCGCCACCATGGGGAATCGCCCTGGGGACCTCAACTCCGCCAATGCCAAATGGTTCACCTTTTGGGTGTCCGCCTATCTCCAGCAATGCAACCCCTCCGGGATTCAAGCGGGAACGGTCAGCCCCTCCACCGCCACCCTCACGGACTTTGAACCCATGGCCAATAGGAGCGTGACCAGCCCATGGACGTACTCGGCCAATGGATACTATGAACCATCCATCGGGGAATTCCAAGTGTTCAGCCCGGTGGTAACAGGTGCCTGGAACCCGGGAAACATAGGGATCCGCGTCCTCCCCGTGCCGGTTTCGGCCTCCGGAGAGCGATACACCCTTCTATGCTATAGTCTGCAGTGCACGAACGCGAGCATTTTTAATCCAAACAACAGCGGAACCATGATCGTGGGACCCGTGCTCTACAGCTGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGTAAGCGCGCCCTCCCCACCGCGTGTCAAATAAAGAGTCATGAACGTTGATTGCTTTTATTGATCGTCCATTTGTCCGAAAGCTTCTCTCCTTTGTTCCCGCGTCCAATCATACAACAGATTTACGCTTTCTAAAAACCAATCGGGTGCGTAAAAGCGAGTAATGTTGTGTTCCACACTGATTTCCATTTTGCGCAAGTAGTGACAGGGGAGCGCCCCCAAGGCTCCAAGCTGGGATACTACCATCAGGAATTCGGCCCGTCTGTCGATAGGGTAAAGAGGTACATGAATCATCATGCCCACCACGCCCTGCAGGTGGTGGACTACCATGGGTCCAAAGGAGGAAAACATGGCACACGCCCACGCGCACACAAAATAGTTCCCGGCTACCCCGTAGTCCTCCGAAAGTCCCTCGCACAGCTTATCCCCGTACCTACAGTACACCCCGGTTCCCACAGACAACCCCAAATTGCGCAAACCGTAATTGTGACACACACAGTTTTTGACCACCACCCTCATTCTCTCCATGCAAGCAAGCACCATGTTTTCATGCGGATTGGCTGCGGCCTCCGCCGCTGCGAGCTCCTCCTCCTCTTCGGCAAGGGGGGCCTCCTCCATCGGTTCGGGTGATGCGTCACGCTCCTCCATCTCTAAACCTGGGTCTCGTAGGGCGAAATGGAAGTGTACACGTGATCGTAAGGGTCCTCGAGTTCAGAGTATGGGTTGACAGGCACAGGCGGCAGCGGTCGCGACGCGCCTAACCCGATGCGCAAACTAGAGTACAGCGGATTGGCTGACAGTACCCACCTACCCGATCCCCGCCTTCTGAGGGACCGGACCTCTGGGGGCGTGCAACGGGGCCGTCGGAACCTCACAAGTCCACTCCCTGATAATAAAGTACAGCACAATCAACACCATTAAACTGCTGGTGAGAAACACGGTTATGACATAGAGCAACAGACTGACGGAGCGTTCCACGAAAAGAAAACTGACGAAATGCAGGTAAAGTAG

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 维多利亚水母(Aequorea victoria)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 2

<211> 735

<212> DNA

<213> 鸡(Chicken)

<400> 2

atgctccggg cccctaaagt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 60

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 120

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 180

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 240

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 300

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 360

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 420

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 480

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 540

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 600

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 660

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 720

gagctgtaca agtaa 735

<210> 3

<211> 25

<212> DNA