抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型(抗PCSK9)纳米制剂化合物及使用其的方法

摘要

公开了调节前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)的生理作用的纳米制剂化合物，以及使用这些化合物来降低LDL及相关胆固醇水平和/或用于治疗和/或预防心血管疾病(CVD)的治疗方法，包括治疗高胆固醇血症。

说明书

本申请根据35 U.S.C.§119(e)对2018年11月5日提交的美国临时专利申请号62/755,709提出优先权要求。前述申请通过引用并入本文。

本发明是在国家心肺血液研究所(NHLBI)授予的SBIR补助金编号HL137449下，在政府的支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及调节前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型(PCSK9)的生理作用(包括其与低密度脂蛋白受体(LDLR)的相互作用)的化合物纳米制剂。在某些实施方案中，本发明涉及将PCSK9抑制剂或拮抗剂例如SBC-115,418或其类似物(参见，例如，WO 2017/222953)肝靶向地递送至受试者的肝脏的组合物和相关方法。在某些实施方案中，提供了组合物，其包括疏水性纳米颗粒、附着或连接(例如，以共价方式)于每个纳米颗粒外部的肝靶向部分(参见，例如，US 9,682,085)以及包封在每个纳米颗粒中的至少一种PCSK9抑制剂或拮抗剂(例如，SBC-115,418)。纳米颗粒可以包括壳聚糖杂化纳米颗粒、胺改性聚-(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒(SLN)和/或其组合。肝靶向部分的实例包括甘草次酸(GA)、乳糖酸(LA)、海藻酸和/或其组合。PCSK9功能的小分子调节剂可在治疗上用于降低血液中的LDL-胆固醇水平，并且可以用于预防和/或治疗胆固醇、脂质和脂蛋白代谢紊乱，包括高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、导致动脉粥样硬化的血脂异常、动脉粥样硬化，和更通常的，心血管疾病(CVD)、糖尿病以及有高心血管风险的肥胖受试者。

背景技术

心血管疾病(CVD)是导致死亡的原因，而动脉粥样硬化是心血管疾病的首要原因。动脉粥样硬化是动脉的疾病并且导致与工业化国家的许多死亡相关的冠状动脉心脏疾病。现在已确定冠状动脉心脏疾病的几个危险因素，包括但不限于：血脂异常、高血压、糖尿病、吸烟、不良饮食习惯、缺乏运动和压力。血脂异常是血浆胆固醇(高胆固醇血症)和/或甘油三酯(TGs)的提高或低的高密度脂蛋白(HDL)水平，这促使动脉粥样硬化发病，这是一种被证实能够促进心血管疾病的代谢疾病。在血液中，胆固醇在脂蛋白颗粒中运送，其中，低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(LDL-C)被认为是“坏的”胆固醇，而HDL-胆固醇(HDL-C)被称为“好的”胆固醇。由于胆固醇对动脉粥样硬化的影响，脂质和脂蛋白异常在一般人群中极为常见，并且被认为是心血管疾病的高度可改变的危险因素。尽管使用他汀类药物治疗(目前动脉粥样硬化的标准治疗方法)，但60-70％的心血管事件、心脏病发作和脑卒中仍有大量未满足的需求。此外，新的指南建议应该实现更低的LDL水平以保护高危患者免于过早患CVD(1)。

在PCSK9和胆固醇代谢之间的联系建立之后，很快就发现PCSK9基因中的选定突变引起常染色体显性高胆固醇血症(2)，这表明突变通过增加PCSK9的正常活动而赋予功能获得(gain-of-function)(3)。这通过野生型和突变PCSK9(S127R和F216L)在小鼠的肝脏中高水平地表达的实验得到支持；而且，据发现，接受野生型或突变PCSK9的小鼠的肝LDLR蛋白水平急剧下降(4，5)。未观察到LDLR mRNA水平的相关降低，表明无论突变还是野生型PCSK9的过表达通过转录后机制降低LDLR。

由于PCSK9的功能获得型突变导致高胆固醇血症，那么产生功能缺失型突变是否具有相反的效果并导致低胆固醇血症的疑问是合乎情理的。在非裔美国人中确定了PCSK9的三个功能缺失型突变(6)。这些突变降低LDL-C水平28％，并显示出降低冠状动脉心脏疾病的频率(解释为心肌梗塞，冠心病死亡或冠状动脉血管重建)88％。Rashid等人(7)研究了其中灭活PCSK9的小鼠中功能缺失型突变的机制。他们报告说，这些基因敲除小鼠显示了增加的肝脏LDLR蛋白(而不是mRNA)，增加的循环脂蛋白的清除以及降低的血浆胆固醇水平。PCSK9的天然存在的突变的结构功能关系分析也已经提供了对PCSK9的作用机制的深刻理解。有趣的是，被发现与LDL-C血浆水平的最大降低相关的PCSK9的突变是通过扰乱其合成(Y142X)、自催化处理(L253F)或折叠(C679X)而防止成熟PCSK9分泌的那些(8)。Y142X突变不产生可检测的蛋白，因为其早在转录时发生并且据预计启动无义介导的mRNA降解。催化结构域(L253F)的突变干扰蛋白质的自催化切割。表达PCSK9-253F的细胞与表达PCSK9-WT的细胞相比，成熟蛋白质的量降低，这表明突变抑制自催化切割。L253F突变靠近催化三联体(PCSK9是一种丝氨酸蛋白酶)，因此它可能干扰活性位点(8)。由于蛋白质从内质网(ER)输出需要PCSK9的自催化切割)，L253F突变延迟PCSK9从ER传输到细胞表面。PCSK9中的无义突变(C679X)，其截断蛋白质14个氨基酸，不干扰蛋白质加工，但成熟蛋白在细胞中积聚并且不分泌，这表明该蛋白正常地裂解但被错误折叠，并保留在ER中(8，9)。

尚未完全阐明PCSK9引起LDLR降解的机制。然而，很明显LDLR降解不需要PCSK9的蛋白酶活性(10，11)。Li等人(10)已经共同表达了前结构域和催化结构域，并表明所分泌的PCSK9无催化活性，但在降低细胞LDL摄取和LDLR水平方面它功能上等同于野生型蛋白。McNutt等人(11)也报道了类似的研究。此外，Zhang等人(12)已经绘制PCSK9结合到LDLR的EGF-A重复，并且表明这样的结合降低了受体回收并增加其降解。他们还报道了与EGF-A结构域的结合是钙依赖性的，并且随着pH从7降低到5.2显著地减少。Kwon等人(13)确定了与LDLR-EGF-AB(EGF-A和EGF-B)复合的PCSK9的晶体结构。该结构显示明确界定的EGF-A结构域，但EGF-B结构域是无序的并且未出现在它们的电子密度图中。EGF-A结构域在远离催化位点的位点处与PCSK9催化结构域结合并且不与C末端结构域或前结构域接触(14)。

已经为靶向PCSK9提出了若干策略(15)。

目前(22-24)，市场上有FDA批准的可注射PCSK9单克隆抗体拮抗剂。这些是Regeneron/Sanofi的PRALUENT(alirocumab)和Amgen的REPATHA(evolocumab)，两者都是完整的人抗PCSK9单克隆抗体。这些单克隆抗体方法遵循策略3，使用可注射抗体而非口服小分子。

发明内容

本发明涉及选择性地与PCSK9功能相互作用并下调PCSK9功能的纳米成型小分子的治疗应用，所述纳米成型小分子任选地是肝靶向的。在第一个实施方案中，用于实施本发明的化合物具有通式I：

包括化合物的药学上可接受的盐和立体异构体，其中R

在一个具体的实施方案中，本发明提供式II的化合物：

包括化合物的药学上可接受的盐和立体异构体，其中R

本发明还提供了用于将PCSK9拮抗剂肝靶向地递送至受试者的肝脏的组合物。在一个具体的实施方案中，该组合物包含纳米颗粒(例如，疏水性纳米颗粒)、附着于每个纳米颗粒的外部的至少一个肝靶向部分(例如通过共价键结合)和包封在每个纳米颗粒中的至少一种PCSK9拮抗剂(例如，式I或II的化合物)。在一个具体的实施方案中，疏水性纳米颗粒选自由以下组成的组：壳聚糖杂化纳米颗粒、胺改性的聚-(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒和/或其组合。在一个具体的实施方案中，靶向肝脏的部分选自由以下组成的组：甘草次酸(GA；enoxolone)、乳糖酸(LA)、海藻酸和/或其组合。

本发明还提供了将PCSK9拮抗剂(例如，SBC-115,418及其类似物、式I或II的化合物)靶向递送至受试者的肝脏的方法。在一个具体的实施方案中，该方法包括向受试者施用组合物，其中，所述组合物包含纳米颗粒(例如，疏水性纳米颗粒)、附着于每个纳米颗粒的外部的至少一个肝靶向部分(例如，共价键合)和包封在每个纳米颗粒中的至少一种PCSK9拮抗剂(例如，式I或II的化合物)。所述方法可以是治疗、抑制和/或预防有此需要的受试者的高胆固醇血症(例如家族性高胆固醇血症)、血脂异常(例如动脉粥样硬化性血脂异常)、动脉粥样硬化和/或心血管疾病(CVD)。

在一个具体的实施方案中，疏水性纳米颗粒如美国专利9,956,291(通过引用并入本文)中所述。在一个具体的实施方案中，疏水性纳米颗粒带正电。在一个具体的实施方案中，疏水性纳米颗粒的直径小于1μm，特别是1nm至约500nm，特别是50nm至约300nm。在一个具体的实施方案中，疏水性纳米颗粒是壳聚糖杂化纳米颗粒、胺改性的聚-(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒(SLN)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)纳米颗粒、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(HPMC-AS)纳米颗粒、或其组合。在一个具体的实施方案中，疏水性纳米颗粒选自由以下组成的组：壳聚糖杂化纳米颗粒、胺改性的聚-(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒和/或其组合。在一个具体的实施方案中，纳米颗粒包含壳聚糖和聚-(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。在一个具体的实施方案中，纳米颗粒包含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(HPMC-AS)。在一个具体的实施方案中，纳米颗粒包含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和壳聚糖。在一个具体的实施方案中，纳米颗粒包含DSPE-PEG和/或PLGA。

在一个具体的实施方案中，靶向肝脏的部分选自由以下组成的组：甘草次酸(GA)、乳糖酸(LA)、海藻酸和/或其组合。在一个具体的实施方案中，肝靶向部分包被在纳米颗粒上。在一个具体的实施方案中，肝靶向部分与纳米颗粒缀合。在一个具体的实施方案中，肝靶向部分通过离子缀合(例如，COO-与NH

在一个具体的实施方案中，PCSK9拮抗剂具有式I或II。在一个具体的实施方案中，PCSK9拮抗剂选自由以下组成的组：SBC-115,418、SBC-115,433、SBC-115,448、SBC-115,462和SBC-115,477。在一个具体的实施方案中，PCSK9拮抗剂是在WO 2017/222953(通过引用的方式并入本文)中描述的式I-V化合物。

在一个具体的实施方案中，所述组合物和/或方法还包含至少一种降低LDL的物质和/或抗血脂异常的剂。抗血脂异常的剂可以被包含在纳米颗粒内(包封的)和/或外部。

在一个具体的实施方案中，所述方法包括与上述组合物分开施用抗血脂异常的剂。在一个具体的实施方案中，抗血脂异常的剂选自由以下组成的组：他汀、依泽替米贝、苯二酸、甲状腺激素受体β激动剂(TR-β激动剂)和/或其组合。

附图说明

图1A提供了SBC-115,418纳米制剂A的合成特征。制剂A是壳聚糖接枝的聚-(乳酸-共-乙醇酸)纳米颗粒，包封了SBC-115,418(CHI-PLGA-NPS-SBC-115,418)。制剂A通过溶剂扩散法制备。简要地，将20mg的SBC-115,418与4mL的PLGA溶液(100mg/ml的乙酸乙酯溶液)混合。向该混合物中加入20mL的2％w/v

图1B提供了SBC-115,418纳米制剂E的合成特征。制剂E是聚合脂质纳米颗粒(PLNP)，包封了SBC-115,418(PLNPs-SBC-115,418)，如本文所述进行合成。简言之，将160mg卵磷脂、40mg DSPE-PEG(1,2-二硬脂酰基-Sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基-(聚乙二醇)-2000)溶解在20mL的4％乙醇溶液中。将该溶液在70℃加热约15分钟。并行地，在另一个小瓶中将500μL SBC-115,418(40mg/mL的二甲基亚砜DMSO溶液)、200μL的PLGA(80mg/mL的DMSO溶液)和200μL的

图1C提供了包封/装载率的图表。通过使纳米颗粒崩解并使用UV-Vis光谱法测定SBC-115,418的量(在λ335nm处的吸光度)来确定包封在纳米颗粒(制剂A和制剂E)中的SBC-115,418的量。包封率由下式确定：

包封率(装载)＝([药物]

其中[药物]

图1D提供了SBC-115,418纳米制剂D的特性。示出了通过HPLC-UV测定制剂D中的SBC-115,418的包封效率和负载率。纳米颗粒通过纳米沉淀法制备。简言之，对于SBC-115,418药物，在室温磁力搅拌下，将SBC-115,418(10mg)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP；也称为聚维酮，15mg；平均分子量40,000)和海藻酸(1mg)在1ml DMSO中的有机溶液加入到10ml水中。然后使用探针超声仪将整个溶液超声1-2分钟。将壳聚糖低聚糖乳酸盐(1mg)溶解在0.5mL水中。然后将该壳聚糖溶液在超声处理下添加到上述整个溶液中，并在室温下孵育30分钟。使用离心(15,000×g，4℃，60分钟)将NP悬浮液用水洗涤两次。然后将NP沉淀在-80℃下冷冻12小时，然后在室温下在0.110mPa的压力下升华24小时。最后，收集NP并将其保存在冰箱中，以进行药代动力学(PK)和药效学(PD)研究。通过分析与最初进料的SBC-115,418相比，NP中的SBC-115,418负载，可以确定SBC-115,418NP的包封效率。冻干后，将称量的NP粉末分散在3mL DMSO中30分钟。使用HPLC和校正曲线(右)在337nm下确定DMSO中SBC-115,418的量。SBC-115,418的包封效率为97％，SBC-115,418的装载量为28％，分别由式1和式2计算得出。

使用Malvern zeta粒度测定器(Malvern Instrumentation Co，Westborough，MA)确定纳米颗粒在水分散体中的粒度分布。将50mg冻干的纳米颗粒重新悬浮在2mL水中。将该纳米颗粒溶液放入3mL的4面透明塑料比色杯中，并直接进行测量。示出了SBC-115,418的HPLC色谱图，用于构建不同浓度的标准曲线。在DMSO中通过2倍系列稀释制备SBC-115,418的校准系列，包括3.9、7.8、15.6、31.5、62.5、125和250μg/mL(左)。80％的乙腈不完全溶解100μg/mL的SBC-115,418。

图2A提供了通过DSL测量的1号和3号纳米制剂的粒度和Zeta电位数据的图表(上图)。1号纳米制剂产生的颗粒的z-平均值为162.4nm，ζ电势为-19.1mV。3号纳米制剂产生的颗粒的z-平均值为118.5nm，ζ电势为-11.8mV。添加了甘露糖醇(5％)的3号纳米制剂产生的颗粒的z-平均值为127.5nm，ζ电势为-30.8mV(中图)。4号纳米制剂(8mg SBC-115,418、4mgPVP(40k)、4mg羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(HPMCAS)、0.6mg甘草次酸)产生的颗粒的z-平均值为90.0nm，ζ电势为-12.8mV(下图)。

图2B提供了SBC-115,418的纳米制剂(纳米SBC-115,418)的特征。简言之，利用SBC-115,418(69mg)、PVP(平均分子量40,000；69mg)、HPMC-AS(100mg)和海藻酸(1mg)来合成纳米颗粒。通过HPLC-UV-CAD分析SBC-115,418溶液(上图)。溶液的SBC-115,418浓度为42mg/ml。制备了三种浓度用于体内实验，包括30mg/ml、10mg/ml和3mg/ml(中图)。与储备制剂相比，没有观察到显著变化。为了进行功效研究，相同的制剂被稀释，用于在喂食高脂饮食的小鼠中以1、3、10和30mg/Kg口服(PO)和3mg/Kg皮下(SC)给药。在测试期间，纳米颗粒还表现出良好的稳定性(物理和化学稳定性)(下图)。

图2C提供了使用透射电子显微镜(TEM)获得的纳米SBC-115,418的特征，表明Zeta粒度分析仪显示纳米颗粒的平均粒度(Z-平均值)为128.2nm(上图)。还提供TEM图像，以确认粒度(50-250nm)(下图)。

图3提供了SBC-115,418、SBC-115,433、SBC-115,448、SBC-115,462和SBC-115,477的化学结构。与对照相比，这些化合物(在式I和II内)影响LDLR上调，而对PCSK9的加工和分泌没有显著影响。提供了PCSK9/LDLR相互作用的体外抑制作用(IC50，μM)。全部小于5μM。

图4A提供了SBC-115,418、SBC-115,433、SBC-115,448,和SBC-115,462对PCSK9/LDLR相互作用的影响的图。使用体外ELISA测定试剂盒(Circulex)。为了筛选PCSK9/LDLR相互作用的抑制剂，将不同浓度(0.01nM-100μM)的所选化合物与His-标记的PCSK9一起孵育，然后加入到用重组LDLR-AB结构域预包被的孔中。孵育后，洗涤平板并使用生物素化的抗His标签和辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白测量重组His-标记的PCSK9的量，并使用BioTek Synergy 2板读取器定量。计算每种化合物对PCSK9与重组LDLR-AB结构域结合的影响。

图4B提供了在溶解作用增加的条件(10％DMSO)(418s)下，SBC-115,418对PCSK9/LDLR相互作用的作用的图。利用体外ELISA测定法(Circulex)。如图4A所示，将不同浓度(0.01γM-100μM)的SBC-115,418的DMSO溶液与带有His标签的PCSK9孵育，然后添加到预先用重组LDLR-AB结构域包被的孔中。

图5提供了SBC-115,418、SBC-115,433、SBC-115,448和SBC-115,462对HepG2细胞中荧光Dil-LDL摄取的影响的图。这些化合物经证实具有增加HepG2细胞中荧光Dil-LDL摄取的能力。数据显示使用10μM的化合物增加荧光Dil-LDL摄取。

图6提供了纳米制剂D的PK分析图。雄性C57BL/6小鼠，4-5周大，5只/笼子，房间保持在20±2℃，湿度50±10％，12小时光/暗周期。给动物饲喂标准的颗粒状鼠粮。施用单次静脉(IV)(10mg/kg)和口服(30mg/kg)剂量的SBC-115,418制剂D，并在给药后0.25、0.5、1、3、6、12、24和48小时使用抗凝毛细管收集50μl血液样本，使用已建立的LC/MS/MS方法进行PK分析。使用内标校正提取效率。血浆中化合物的浓度表示为ng/ml。数据显示，给药30分钟后，化合物的浓度增加，口服生物利用度相对于IV的SBC-115,418为18％，半衰期更长。

图7提供了纳米制剂D的PD分析图。在雄性小鼠(C57BL/6小鼠)中测试制剂D中SBC-115,418的功效。在气候控制条件下以每笼四只动物饲养小鼠，温度(20-24℃)，湿度(60-70％)，以及交替12小时光/暗循环。将小鼠分为3组。一组喂食商业饲料(Prolab RMH 3000,PMI feeds,St.Louis,MO)作为阴性对照，而其他2组喂食高脂饮食(TD.06414)，该高脂饮食提供60％来自脂肪的卡路里。自由饮水。每周采集血浆一次以监测LDL水平。4个星期饲喂高脂饮食后，小鼠被随机分配到几组中的一组，使得不同组间的平均LDL水平相等。用媒介物处理喂食高脂饮食的2组小鼠中的一组并用作阳性对照，而第二组每天用10mg/kg的SBC-115,418口服处理5天。在药物施用之后5天经由每管含有2USP单位的铵肝素的肝素化毛细管(Carolina,Burlington,NC)从眼眶后静脉丛采集血液样品(75μl)。在室温下离心(5000xg)5分钟立即分离血浆并保持在-80℃下直至测定脂质分布。用酶法测量血浆胆固醇和LDL-C水平。

图8提供了相对于分散体制剂，在喂食高脂饮食的小鼠中施用纳米SBC-115,418后24小时，血浆和肝脏中测得的SBC-115,418水平的图。称重肝组织，并在有机溶剂中匀浆，有机溶剂为1：1：1比例的DMSO/乙腈/甲醇，用利血平作为内标物。将组织匀浆以15,000x g离心15分钟，然后将上清液冻干，并在少量但已知体积的乙腈中重建，用于注入LC/MS/MS中。

图9提供了喂食高脂饮食的小鼠每天施用纳米SBC-115,418后24小时和2周时SBC-115,418水平的图。纳米SBC-115,418的肝靶向给药显示了重复给药后肝脏水平的调整(2周)，而没有明显的药物积累，但具有足够的残留水平以产生持续作用。

图10提供了使用SBC-115,418的分散体制剂(左)对比纳米晶体/肝靶向制剂(纳米SBC-115,418)(右)，在喂食高脂饮食的C57BL/6小鼠中LDL-胆固醇减少的图。C57BL/6小鼠每天口服10mg/kg，连续5天(分散体)或7天(纳米SBC-115,418)。在指定的时间收集血浆并测量血浆LDL-C水平。该图显示了纳米SBC-115,418(降低了约60％的LDL)与SBC-115,418分散体(降低了20％的LDL)相比具有更高的功效。

图11提供了饲喂高脂饮食的用纳米SBC-115,418处理了2周的小鼠血浆中胆固醇水平的图。

图12提供了饲喂高脂饮食的用不同剂量的纳米SBC-115,418处理了1天、1周和2周的小鼠血浆中LDL-胆固醇水平的图。

图13提供了口服或通过皮下注射3mg/Kg的纳米SBC-115,418治疗的高脂饮食小鼠的血浆LDL-胆固醇水平的图。

图14提供的图显示了纳米SBC-115,418对喂食高脂饮食的C57/Black6小鼠的血浆LDL-C和PCSK9水平的影响。

图15提供的图表显示了口服纳米SBC-115,418(30mg/Kg，2周)对喂食高脂饮食的C57/Black6小鼠的血浆LDL-C和PCSK9水平的影响与注射

图16提供的图表显示了口服纳米SBC-115,418(30mg/Kg，1天)对喂食高脂饮食的C57/Black6小鼠的血浆LDL-C和PCSK9水平的影响与SC注射

图17提供了蛋白质印迹分析(上)和图表(下)，显示了喂食高脂饮食的用不同剂量纳米SBC-115,418处理的小鼠肝脏中LDL受体表达水平。

具体实施方式

本发明提供了有效降低LDL的剂及其使用方法，包括纳米肝靶向方法。为了提高小分子PCSK9/LDLR拮抗剂的功效，本发明使用纳米技术平台来靶向PCSK9拮抗剂(例如SBC-115,418及其类似物，有或没有他汀或其他LDL-C降低剂)，以差异靶向递送至肝脏，从而使功效最大化并使其全身分布最小化。图1和图2描绘了根据本发明的实施方案的包含SBC-115,418和肝靶向部分(甘草次酸(GA)、乳糖酸(LA)和海藻酸)的纳米颗粒的选定实例。如本文所证明的，经修饰用于肝靶向的PCSK9拮抗剂例如SBC-115,418及其类似物的纳米制剂提供了降低LDL-胆固醇的改善的功效。与降低胆固醇合成的他汀类药物不同，PCSK9拮抗剂(例如SBC-115,418及其类似物)下调细胞外前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)的功能，包括其与低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)的相互作用。PCSK9拮抗剂及其纳米制剂可用于治疗性地降低血液中的LDL-胆固醇水平，以及预防和/或治疗胆固醇和脂蛋白代谢异常，包括家族性高胆固醇血症、动脉粥样硬化血脂异常、动脉粥样硬化以及更常见的心血管疾病(CVD)。

本发明的纳米肝靶向PCSK9拮抗剂(例如，SBC-115,418)可以与他汀或其他降脂物质组合。在一个具体的实施方案中，将药物(例如，PCSK9拮抗剂和降低脂质(例如，降低LDL)的物质)纳米包封到疏水性纳米颗粒中。疏水性纳米颗粒的实例包括但不限于胺改性的聚-(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)或EPA/DHA或固体脂质纳米颗粒(SLN)(使用带有或不带有交联或接枝到壳聚糖的HDL)。壳聚糖，特别是低至超低分子量壳聚糖，可以与脂肪酸(包括但不限于EPA、DHA和/或不同量的组合)或其他酸(例如氨基酸、透明质酸和/或亚油酸)缀合，形成疏水聚合物，该聚合物仍保留粘膜粘附特性和正电荷，可长时间保留在细胞膜上。在下文示例性地描述了将SBC-115,418包封到与肝靶向部分(如甘草次酸、乳糖酸和海藻酸)缀合的带有或不带有壳聚糖和聚乙二醇(PEG)的疏水PLGA、壳聚糖-EPA、壳聚糖-DHA或壳聚糖-EPA/DHA纳米颗粒以及SLN中。

如本文所用，术语“受试者”包括人类和动物。如本文所用，术语“PCSK9”是指任何形式的蛋白质PCSK9，包括PCSK9突变体和变体，其保留至少部分的PCSK9活性或功能。除非另有说明，例如通过明确提及人类PCSK9，否则PCSK9指具有天然序列PCSK9的所有哺乳动物物种，例如，人、猪、牛、马、犬和猫。一个示例性的人类PCSK9序列见UniProt登录号Q8NBP7。示例性的氨基酸序列是：

MGTVSSRRSW WPLPLLLLLL LLLGPAGARA QEDEDGDYEE LVLALRSEED GLAEAPEHGTTATFHRCAKD PWRLPGTYVV VLKEETHLSQ SERTARRLQA QAARRGYLTK ILHVFHGLLP GFLVKMSGDLLELALKLPHV DYIEEDSSVF AQSIPWNLER ITPPRYRADE YQPPDGGSLV EVYLLDTSIQ SDHREIEGRVMVTDFENVPE EDGTRFHRQA SKCDSHGTHL AGVVSGRDAG VAKGASMRSL RVLNCQGKGT VSGTLIGLEFIRKSQLVQPV GPLVVLLPLA GGYSRVLNAA CQRLARAGVV LVTAAGNFRD DACLYSPASA PEVITVGATNAQDQPVTLGT LGTNFGRCVD LFAPGEDIIG ASSDCSTCFV SQSGTSQAAA HVAGIAAMML SAEPELTLAELRQRLIHFSA KDVINEAWFP EDQRVLTPNL VAALPPSTHG AGWQLFCRTV WSAHSGPTRM ATAVARCAPDEELLSCSSFS RSGKRRGERM EAQGGKLVCR AHNAFGGEGV YAIARCCLLP QANCSVHTAP PAEASMGTRVHCHQQGHVLT GCSSHWEVED LGTHKPPVLR PRGQPNQCVG HREASIHASC CHAPGLECKV KEHGIPAPQEQVTVACEEGW TLTGCSALPG TSHVLGAYAV DNTCVVRSRD VSTTGSTSEG AVTAVAICCR SRHLAQASQELQ(SEQ ID NO:1)。

如本文所用，“PCSK9功能调节剂”是指一种小分子，其能够抑制PCSK9生物活性或功能，和/或PCSK9信号传导介导的(多个)下游通路，包括PCSK9介导的LDLR下调，以及PCSK9介导的LDL血液清除下降的抑制。PCSK9功能调节剂包括阻断、拮抗、抑制或减少(到任意程度，包括显著程度)PCSK9生物活性的化合物，所述PCSK9生物活性包括由PCSK9信号传导介导的下游通路，例如LDLR相互作用和/或诱导对PCSK9的细胞应答。出于本发明的目的，将明确理解的是术语“PCSK9功能调节剂”涵盖导致所述PCSK9本身，PCSK9生物活性(包括但不限于其介导与LDLR的相互作用的任何方面，下调LDLR，并抑制血液LDL清除降低)，或生物活性被以任何可测量的程度基本上消除、降低或中和的结果。在一些实施方案中，PCSK9功能调节剂结合PCSK9并防止其与LDLR相互作用或其分泌。在其他实施方案中，PCSK9功能调节剂结合PCSK9的活性位点，以稳定其酶原和防止自加工。在另一些实施方案中，PCSK9功能调节剂降低或阻断PCSK9介导的LDLR的下调；抑制PCSK9介导的LDL血液清除的下降；通过培养的肝细胞增加培养基中的LDL清除；通过体内的肝脏增加血液LDL清除；改善患者对其他LDL降低药物的敏感性，包括他汀类；与其他LDL降低药物协同，包括他汀类；并阻断PCSK9与其他尚未确定的因素的相互作用。本文中提供了PCSK9功能调节剂的实例。在一个具体的实施方案中，“PCSK9功能的调节剂”是PCSK9拮抗剂。

本发明的化合物可以盐的形式施用，这也在本发明的范围内。药学上可接受的(即，无毒，生理上相容的)盐是优选的。如果本发明的方法的化合物具有例如至少一个碱性中心，那么它们可以形成酸加成盐。这些可以用以下酸形成，例如强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或盐酸；强有机羧酸，如具有1至4个碳原子的未取代或取代(例如，被卤素取代)的烷烃羧酸，例如乙酸，如饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸，如羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸，诸如氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸或赖氨酸或精氨酸，或苯甲酸，或用有机磺酸，例如未取代或取代(例如，被卤素取代)的(C

含有碱性基团的本文所述的化合物的示例性的盐包括单盐酸盐、硫酸氢盐、甲磺酸盐、磷酸盐或硝酸盐。

含有酸性基团的本文所述的化合物的示例性的盐包括钠、钾和镁盐和药学上可接受的有机胺。

可用于本文描述的方法的化合物的所有立体异构体，以混合物或以纯的或基本上纯的形式，都被认为在本发明的范围之内。本发明的化合物可在任何碳原子处具有不对称中心，包括R取代基中的任何一个碳原子。因此，在本发明的方法中使用的化合物可以以对映体或非对映体形式或其混合物存在。制备这类化合物的工艺可以利用外消旋体、对映体或非对映体作为起始原料。当制备非对映体或对映体产物时，它们可通过例如色谱、手性HPLC或分级结晶的常规方法分离。

如本文所用，术语“药效团”是指确保与特定生物靶结构的最佳超分子相互作用和引发、激活、阻断、抑制或者调节生物靶标的生物活性所必需的空间和电子特征的整体，依情形而定。参见，IUPAC，Pure and Applied Chemistry(1998)70:1129-1143。

如本文所用，术语“药效团模型”是指限定的坐标系统中的点的表示，其中点对应于配体和/或相互作用的多肽、蛋白质或有序水分子的结合构象中的原子或化学部分的位置或其他特性。有序水分子是从多肽或蛋白质的结构测定导出的模型中的可观察到的水。药效团模型可以包括，例如，配体的结合构象的原子或其部分。药效团模型可以包括配体的结合构象或其部分，以及与配体相互作用并且来自结合的多肽或蛋白的一个或多个原子。因此，除了配体的结合构象的几何特征，药效团模型可以指示其他特征，包括例如，原子或化学部分的电荷或疏水性。药效团模型可包含配体的结合构象内的内部相互作用或者配体的结合构象和多肽、蛋白质或其他受体的相互作用，包括例如范德华相互作用、氢键、离子键和疏水相互作用。可从两种或更多种配体的结合构象导出药效团模型。

如本文所用，术语“配体”是指与受体的配体结合结构域相互作用并调节其活性的任何化合物、组合物或分子。“配体”还可以包括调节该受体但不直接与该受体结合的化合物。

在实施本发明的方法中，上述化合物可以其本身施用，或者可以衍生出活性剂的形式例如前药来施用。前药是本文描述的化合物的衍生物，其药理学作用起因于通过体内的化学或代谢过程转化成活性化合物。本文使用的术语“前药酯”包括酯和碳酸酯，其形成是通过使用本领域的那些技术人员已知的程序使本发明的方法中使用的化合物的一个或者多个羟基与烷基、烷氧基或芳基取代的酰化剂反应来生成乙酸酯、三甲基乙酸酯、甲基碳酸酯、苯甲酸酯等。可在体内转化以提供生物活性剂(例如，式I或II的化合物)的任何化合物均是在本发明的范围和精神内的前药。前药的各种形式是本领域已知的。前药和前药衍生物的全面描述如下：(a)The Practice of Medicinal Chemistry,Camille G.Wermuth等人,第31章,(Academic Press,1996)；(b)Design of Prodrugs,由H.Bundgaard编辑,(Elsevier,1985)；(c)A Textbook of Drug Design and Development,P.Krogsgaard-Larson和H.Bundgaard,编辑,第5章,第113-191页(Harwood Academic Publishers,1991)。

在实行本发明的方法中使用的治疗剂的施用量通常足以在其接受者中引起所需的治疗效果。因此，如本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗剂的量，其足以治疗或者预防可通过施用上述式I或II的化合物中的一种或者多种或其前药治疗的疾病。在具体实施方案中，治疗有效量是指适于治疗PCSK9相关疾病的量，即带来可检测的治疗、预防或改善效果。效果可以包括，例如，治疗或预防本文所描述的疾病。

本文所描述的(多种)化合物可以施用的剂量在每天约0.01mg至约200mg/kg体重的范围内。每天0.1至100mg/kg的剂量，特别是每天1至30mg/kg的剂量，每天或每周一次或多次施用，应能有效地产生预期效果。举例来说，口服施用的合适剂量将在每天1-30mg/kg体重的范围内，而静脉内施用的典型剂量将在每天1-10mg/kg体重的范围内。当然，如所属领域的技术人员将理解的，实际施用剂量取决于被治疗的疾病，接受者的年龄、健康和体重，同期治疗的类型(如果有的话)以及治疗的频率。此外，有效剂量可以由本领域技术人员基于在生物测定中测量(多种)化合物生物活性的常规实证性活性试验来确定，并由此建立待施用的合适的剂量。

在本发明的方法中使用的化合物通常一天1-2次高至每周1-2次施用，以便提供上述日剂量。但是，对于本文所述的化合物的施用的确切治疗方案将必然取决于被治疗的个体受试者的需要，施用的治疗的类型以及主治医学专家的判断。

在一个方面，本发明提供用于治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或血脂异常、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏疾病的至少一种症状的方法，包括对该个体施用有效量的拮抗循环PCSK9的PCSK9功能调节剂。

在另一方面，本发明提供拮抗细胞内、细胞外或循环PCSK9的有效量的PCSK9功能调节剂，用于治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或血脂异常、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏疾病的至少一种症状。本发明还提供拮抗细胞内、细胞外或者循环PCSK9的有效量的PCSK9功能调节剂在制备用于治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或血脂异常、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏疾病的至少一种症状的药物中的用途。

本发明的方法使用PCSK9功能调节剂，它指的是阻断、抑制或减少(包括显著减少)PCSK9生物活性的任何分子，所述PCSK9生物活性包括由PCSK9信号传导介导的下游通路，例如诱导对PCSK9的细胞应答。

PCSK9功能调节剂应表现出以下特征的任何一种或多种：(a)结合PCSK9；(b)减少或阻断PCSK9与LDLR的相互作用；(c)减少或阻断PCSK9的分泌；(d)减少或阻断PCSK9介导的LDLR的下调；(e)抑制PCSK9介导的LDL血液清除的降低，(f)通过培养的肝细胞增加培养基中的LDL清除，(g)通过体内的肝脏增加血液LDL清除，(h)改善患者对其他LDL降低药物(包括他汀类药物)的敏感性，(i)与其他LDL降低药物(包括他汀类)协同；及(j)阻断PCSK9与其他尚未确定的因素的相互作用。

一般地，在本发明的方法中使用的(多种)化合物可以通过使用本领域已知的任何可接受的途径施用来实现PCSK9功能的调节。因此，(多种)活性剂可以通过口服，口腔，胃肠外(例如通过静脉内或动脉内输注)，肌内，腹膜内，鞘内或皮下注射，通过脂质体介导的递送或纳米颗粒包封，直肠，阴道，通过吸入或吹入，经皮或通过眼递送来施用。

口服施用的剂量单位可以是片剂，囊片，丸剂，半固体，软或硬明胶胶囊，水性或油性溶液，乳剂，混悬剂或糖浆剂的形式。用于肠道外施用的合适的剂型包括可注射的溶液或悬浮液，栓剂，粉末制剂，例如纳米晶体、微晶或气溶胶喷雾。活性剂也可掺入常规的透皮递送系统。

如本文所用，表述“生理上相容的载体介质”包括适于所需的特定剂型的任何和所有溶剂，稀释剂或其他液体媒介物，分散或悬浮助剂，表面剂(surface agents)，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂，固体粘合剂，润滑剂，填料等。Remington：The Science andPractice of Pharmacy,第20版,(A.R.Genaro等人,第5部分,PharmaceuticalManufacturing,第669-1015页(Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD/Philadelphia,PA)(2000))公开了用于配制药物组合物的各种载体及其制备的已知技术。除非任何常规的药物载体介质与本发明中使用的PCSK9调节剂不相容，如通过产生不期望的生物学效应或以有害的方式与包含这类化合物的制剂的任何其他(多种)组分相互作用，否则其使用也涵盖在本发明的范围之内。

为了生产固体剂型，包括硬和软胶囊，治疗剂可以与药学上惰性的无机或有机赋形剂混合，例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、明胶、麦芽、甘露糖醇、硅胶、淀粉或其衍生物混合物、滑石、硬脂酸或其盐、脱脂乳粉、植物油、石油、动物油或合成油、蜡、脂肪、多元醇等。为了生产液体溶液、乳剂或混悬剂或糖浆剂，可以使用赋形剂，例如水、醇、盐水溶液(aqueoussaline)、葡萄糖水溶液、多元醇、甘油、脂质、磷脂、环糊精、植物油、石油、动物或合成的油。对于栓剂，可以使用赋形剂，如植物油、石油、动物油或合成油、蜡、脂肪和多元醇。对于气雾剂制剂，可以使用适于此目的的压缩气体，如氧、氮和二氧化碳。该药物组合物或制剂也可以含有一种或多种添加剂，包括但不限于，防腐剂，稳定剂例如UV稳定剂，乳化剂，甜味剂，调节渗透压的盐，缓冲剂，包衣材料和抗氧化剂。

本发明还包括用于施用活性剂的控制释放、持续释放或延长释放的治疗剂型，其包括将活性剂并入合适的递送系统中。这种剂型控制活性剂释放的方式是可以维持(多种)活性剂在血液中的有效浓度一段延长的时间，使血液中的浓度保持相对恒定，以提高治疗效果和/或最小化副作用。此外，控制释放系统将提供活性剂血浆水平的最小波峰到波谷波动。

用于实施本发明的化合物包括PCSK9拮抗剂，例如以上式I以及特别是式II的那些。在一个具体的实施方案中，PCSK9拮抗剂选自由以下组成的组：SBC-115,418、SBC-115,433、SBC-115,448、SBC-115,462和SBC-115,477(参见例如图3)。在一个具体的实施方案中，PCSK9拮抗剂是SBC-115,418。

本发明的这些方法通常包括医疗随访，以确定在接受本文描述的(多种)化合物和/或(多种)组合物治疗的受试者中带来的治疗或预防效果。

定义

提供以下定义以有助于对本发明的理解：

除非上下文另外明确指出，否则单数形式包括复数指代。

如本文所用的术语“烷基”是支链或非支链饱和烃链部分。“低级烷基”是指具有1至约8个碳原子的支链或非支链烃链，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、2-甲基戊基戊基、己基、异己基、庚基、4,4-二甲基戊基、辛基、2,2,4-三甲基戊等。“取代的烷基”包括可以被一个或多个取代基团取代的烷基，所述取代基团通常连接到该链以形成如三氟甲基、3-羟基己基、2-羧丙基、2-氟乙基、羧甲基、氰基丁基、苯乙基、苄基等的烷基，所述取代基团如羟基、卤素、巯基或硫代、氰基、烷硫基、羧基、烷氧羰基、氨基、硝基、烷氧基或任选取代的烷基、烯基、炔基、杂环基、芳基等。

本文单独地或者作为另一基团的一部分使用的术语“卤素”或“卤代”是指氯、溴、氟和碘。

术语“烷氧基”指烷基-O-，其中烷基如上所定义。

除非另有说明，否则如本文单独地或作为另一个基团的一部分使用的术语“环烷基”包括饱和或部分不饱和(含有1或多个双键)的含有1至3个环的环状烃基(碳环)，包括单环烷基、二环烷基和三环烷基，含有形成环的总共3至20个碳，特别是形成环的3至10个碳，并且可以与1或2个芳环稠和，如对芳基所述，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二烷基和环己烯基。

“取代的环烷基”包括可以被1个或多个取代基取代的环烷基，所述取代基如卤素、烷基、取代的烷基、烷氧基、羟基、芳基、取代的芳基、芳氧基、环烷基、烷基酰胺基、烷酰基氨基、氧代、酰基、芳基羰基氨基、氨基、硝基、氰基、硫醇和/或烷硫基和/或包括在“取代的烷基”的定义中的任何取代基。

除非另有说明，否则本文单独地或作为另一基团的一部分的术语“芳基”或者“Ar”是指环部(如苯基或萘基，包括1-萘基和2-萘基)含6至10个碳的单环和多环芳族基团，并且可以任选地包括与碳环(如环烷基环)稠合的或与芳基或杂环环或其取代形式稠合的一至三个另外的环。

“取代的芳基”包括可以被一个或多个取代基团取代的芳基，所述取代基团如卤素、烷基、卤代烷基(例如，三氟甲基)、烷氧基、卤代烷氧基(例如，二氟甲氧基)、烯基、炔基、环烷基-烷基、杂环基-烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、芳氧基、芳氧基烷基、芳基烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、芳基羰基、芳烯基、氨基羰基芳基、单烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、氨基羰基芳基、芳硫基、芳基亚磺酰基、芳基偶氮、杂芳基烷基、杂芳基炔基、杂芳基杂芳基、杂芳氧基、羟基、硝基、氰基、氨基、其中氨基包括1或2个取代基的取代的氨基(其任选地被烷基、芳基或在定义中提到的任何其他取代基取代)、巯基、烷硫基、杂芳硫基、芳硫基烷基、烷氧基芳硫基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基亚磺酰基烷基、芳基磺酰基氨基或芳基磺酸基氨基羰基和/或以上提及的任何烷基取代基。

除非另有说明，否则本文单独地或者作为另一基团的一部分使用的术语“杂芳基”或者“Het”是指包括1、2、3或4个如氮、氧或硫的杂原子的5-或7-元芳环，而且这种环稠合到芳基、环烷基、杂芳基或杂环烷基环，并包括可能的N-氧化物。杂芳基基团的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基和噁二唑基。稠合杂芳基基团的实例包括喹啉、异喹啉、吲哚、异吲哚、咔唑、吖啶、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噁唑、异苯并呋喃、苯并噻吩、菲咯啉、嘌呤等。“取代的杂芳基”包括可以被1至4个取代基取代的杂芳基，如上述“取代的烷基”，“取代的环烷基”和“取代的芳基”的定义中包括的取代基。

本文单独地或作为另一个基团的一部分使用的术语“杂环(heterocyclo)”，“杂环(heterocycle)”或“杂环(heterocyclic ring)”表示未取代或取代的稳定的5至7元单环环系，其可以是饱和的或部分不饱和的，并且其由碳原子和选自N，O或S的1-4个杂原子组成，且其中氮和硫杂原子可任选地被氧化，且氮杂原子可任选地被季铵化。“取代的杂环基(或杂环或杂环)包括可以被1至4个取代基取代的杂环基，例如，在上述“取代的烷基”，“取代的环烷基”和“取代的芳基”的定义中包括的取代基。该杂环可以在导致创建稳定结构的任何杂原子或碳原子处被连接。这种杂环基的例子包括，但不限于，哌啶基、哌嗪基、氧代哌嗪基、氧代哌啶基、氧代吡咯烷基、氧代氮杂基、氮杂基(azepinyl)、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉亚砜(thiamorpholinyl sulfoxide)和噻吗啉砜(thiamorpholinyl sulfone)。

术语“任选取代的”在本文用于表示所提及的化学部分，例如，烷基、芳基、杂芳基，可以是未取代的或者被一个或多个基团取代，该一个或多个基团包括但不限于低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳烷基、芳基、卤代芳基、杂环、杂环烷基、杂芳基、羟基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、卤素、卤代烷氧基、芳氧基、芳氧基烷基、烷基芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基芳基、羧基、烷氧羰基、羧酰氨基、氨基羰基、单烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、单烷基氨基亚磺酰基、二烷基氨基亚磺酰基、单烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羟基磺酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、单烷基氨基磺酰基烷基、二烷基氨基磺酰基烷基、单烷基氨基亚磺酰基烷基、二烷基氨基亚磺酰基烷基等。可被任选取代的上述式I和II的化学部分包括低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳烷基、芳基、杂环和杂芳基。例如，任选取代的烷基将包括丙基和2-氯丙基。另外，“任选取代的”也包括其中已指定的取代基或(多个)取代基具有多个取代基而不仅仅是单个取代基的实施例。例如，任选取代的芳基可以包括苯基和3-溴-4-氯-6-乙基苯基。

除非另有明确说明，否则本文对烷基和芳基基团的所有提及还包括其取代形式。

本文描述的化合物的活性已被实验证明。提供以下实施例以进一步详细地描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，而不打算在任何方面限制本发明。

实施例1

在结合试验中对SBC-115,418和类似物进行测试，以确定它们抑制PCSK9/LDLR相互作用的能力。SBC-115,418抑制PCSK9/LDLR相互作用，IC50在亚微摩尔范围。实验细节在上文和WO 2017/222953中提供。几个新的类似物(见图3)也以亚微摩尔(SBC-115,433和SBC-115,477)或低微摩尔(SBC-115,448和SBC-115,462)范围(图4A)抑制。鉴于先导化合物SBC-115,418的亲脂性，进行了溶解度研究，以研究其对结合的影响(图4B)。在不同的溶解条件下，以不同浓度(0.01μM-100μM)的SBC-115,418进行了体外ELISA结合测定。数据显示，使用改良的溶解度条件进行SBC-115,418的体外结合可显著提高结合效力，IC50为50nM。此外，通过用氮原子正式取代SBC-115,418的苯并噁唑部分的氧原子以制备苯并咪唑部分(SBC-115,477；log P＝4.5)，进一步观察到了效力增加，导致溶解度增加和.19μM的IC500。

实施例2

SBC-115,418及其类似物对PCSK9在细胞内或在培养基中的合成、加工和分泌均无影响。实验细节在上文和WO 2017/222953中提供。

实施例3

与用相同体积的DMSO(对照)处理的细胞相比，SBC-115,418、SBC-115,433、SBC-115,448和SBC-115,462的LDLR水平升高，LDLR显著上调。此外，在10μM浓度下，SBC-115,418和SBC-115,462在HepG2细胞中的Dil-LDL摄取显著增加(图5)。

实施例4

制备并优化了几种SBC-115,418纳米制剂(图1A-1D)。表1和表2提供了SBC纳米制剂1-3号的成分及其含量。将SBC-115,418、PVP(平均分子量40,000)、HPMC-AS和海藻酸的DMSO溶液添加到水中，在室温下通过探头超声处理1-2分钟。然后将上述溶液在室温下孵育30分钟。使用离心(15,000×g，4℃，60分钟)将NP悬浮液用水洗涤两次。将海藻酸替换为乳糖酸，或者对于4号制剂，替换为甘草次酸(GA)。

表1：使用甲基纤维素衍生物和聚乙烯吡咯烷酮包衣的乳糖酸生产纳米晶体的工艺参数的优化。PVP，聚乙烯吡咯烷酮；HPMCAS，羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯。

表2说明了优化后的1-3号纳米制剂的粒度、ζ电势和包封率(％)。表2还包括3号，其中添加了5％甘露醇作为防冻剂以防止聚集。3号纳米制剂是理想的，因为它的粒度较小。

表2：包封率(％)。使用HPLC-UV来定量NP中的SBC-115,418。

实施例5

用SBC-115,418/纳米制剂D(SBC-115,418、PVP、藻酸、壳聚糖寡糖乳酸盐)测定PK和PD。对于SBC-115,418的PK和口服生物利用度，数据显示，在小鼠血浆中从30分钟到1小时观察到SBC-115,418(5mg/kg口服和腹腔注射)的浓度增加。数据显示，SBC-115,418具有18％的口服生物利用度(图6)。对于PD，SBC-115,418对高脂饮食(HFD)喂养的C57/Black6小鼠中LDL胆固醇水平的影响显示，在施用SBC-115,418 5天后，LDL-C降低了20％(图7)。

实施例6

HPMC-AS是一种广泛使用的赋形剂，具有增加的溶解度，能够形成固体分散体，并抑制API从分散体基质中结晶，并且是用于缓释剂型的速率控制聚合物。分散体的制备如下：使用超声处理10分钟，将SBC-115,418溶解在HPMC-AS中。使用SBC-115,418/HPMC-AS作为分散体制剂对比纳米晶体/肝靶向最佳制剂纳米SBC-115,418(SBC-115,418/PVP/HPMC-AC/海藻酸)(图2)，对于小鼠中的SBC-115,418，分散体制剂显示出更大的AUC、血液Cmax和口服生物利用度％F(表3)。然而，与SBC-115,418的分散体制剂相比，纳米SBC-115,418获得了更大的肝SBC-115,418递送(图8和9)。此外，纳米SBC-115,418对高脂饮食喂养的C57BL/6小鼠中LDL-C水平的影响显示，与SBC-115,418的分散体制剂相比，纳米SBC-115,418具有出乎意料的更高的LDL-C功效(图10)。

表3：提供了纳米SBC-115,418与溶于HPMC-AS的SBC-115,418(分散体)的药代动力学，包括皮下(SC)和口服施用优化的纳米晶体/肝靶向制剂(纳米SBC-115,418)与SBC-115,418的HPMC-AS分散体(SC和口服)的测量的PK参数(AUC、Cmax、Tmax)和计算的口服生物利用度(％F)。

实施例7

在气候控制条件下以每笼四只动物饲养小鼠，温度(20-24℃)，湿度(60-70％)，以及交替12小时光/暗循环。给小鼠喂食高脂饮食(TD.06414,Harlan Research Diet,Inc.,Indianapolis,Ind.)，该饮食通过脂肪来源提供60卡路里的热量，以增加总胆固醇。因此，营养诱发的小鼠是用于研究纳米SBC-115,418的肝脏靶向降低LDL-C水平的效果的合适模型。雄性C57BL/6小鼠喂食商业饲料(Prolab RMH 3000,PMI feeds,St.Louis,Mo.)作为阴性对照，或喂食高脂肪饮食(TD.06414,Harlan Research Diet,Inc.,Indianapolis,Ind.)。每周采集血浆一次以监测LDL-C和PCSK9的水平。喂食高脂饮食4周后，将小鼠随机分配到不同的组中，使每种生物标志物水平的平均值在不同组之间具有可比性。一组用溶媒治疗，另一组用不同剂量的纳米SBC-115,418治疗(表4)。通过每管含有2USP单位的铵肝素的肝素化毛细管(Carolina,Burlington,NC)从眼眶后静脉丛采集血液样品(75μl)。在室温下离心(5000x g)5分钟立即分离血浆并保持在-80℃下直至测定脂质分布。测量血浆总胆固醇和游离胆固醇、LDL-C和游离PCSK9的水平。

表4：高脂喂养小鼠中纳米SBC-115,418的剂量和给药途径。提供了纳米SBC-115,418对高脂饮食小鼠脂质谱的药效学治疗方案。N＝每个研究队列的小鼠数。治疗24小时、1周和2周后收集血液。

数据表明，纳米SBC-115,418在降低高脂饮食小鼠的LDL-C和PCSK9方面非常有效(图11-16)。另外，纳米SBC-115,418导致HDL胆固醇显著增加(2倍)。在高脂饮食小鼠中单独口服施用(30mg/kg)纳米SBC-115,418可导致LDL-C降低近90％，并且比单克隆抗体更有效。另外，纳米SBC-115,418引起肝脏中LDL受体水平的浓度依赖性增加(图17)。鉴于前述内容，纳米SBC-115,418清楚地证明了用于降低LDL-C的意料不到的优异性能。

本说明书包括对某些出版物的引用，提供这些引用是指示本发明所属的技术领域的状态。每篇所引用的公开出版物的整个公开内容通过引用的方式并入本文。

尽管上面已经描述和/或例举了本发明的某些实施方案，根据上述公开内容，各种其他实施方案对于本领域的技术人员将是显而易见的。因此，本发明不限于所描述和/或例举的具体实施方案，而是能够有相当大的变化和修改，而不偏离所附权利要求的范围。此外，过渡术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”，当在原始和修改形式的所附权利要求中使用时，在未列举的附加的权利要求要素或者步骤(如果有的话)被排除在(多个)权利要求的范围之外方面限定权利要求的范围。术语“包含”旨在是包容性的或者开放式的，并且不排除任何附加的、未列举的要素、方法、步骤或材料。术语“由......组成”排除了权利要求中指明的那些之外的任何要素、步骤或材料，在后一种情况下，杂质通常与指定的(多种)材料相关联。术语“基本上由......组成”限制权利要求的范围到指定的要素、步骤或(多种)材料和那些不实质上影响要求保护的发明的基本和新颖的(多个)特征。体现本发明的所有的组合物和使用它们的方法可以，在替代的实施方案中，由过渡术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个具体地限定。

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SEQUENCE LISTING

<110> 沙克尔·A·穆萨

纳比勒·A·艾尔斯霍尔巴吉

哈罗德·V·迈耶斯

谢林·萨拉赫丁·阿卜杜勒-马吉德

<120> 抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin

9型（抗PCSK9）纳米制剂化合物及使用其的方法

<130> 5122-P06628WO00

<150> 62/755,709

<151> 2018-11-05

<160> 1

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 692

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln

690