蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂联合蛇毒金属蛋白酶抑制剂抗肝癌细胞(MHCC97H)的侵袭转移作用

摘要

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，病死率高，复发转移是影响预后的最主要因素。肝癌细胞的侵袭转移能力与其产生降解细胞外基质(ECM)的蛋白水解酶能力密切相关。目前针对ECM相关蛋白酶的生物治疗已经成为肝癌治疗研究的热点，其中蛇毒活性成分的药用价值更是不断得到认可。我们前期克隆了蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)和蛇毒金属蛋白酶抑制剂(BJ46a)基因，初步证明其各自具有抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的侵袭转移功能。鉴于sv-Cystatin和BJ46a抑制肿瘤侵袭转移作用的靶点不同，我们设想二者联合表达存在协同作用的可能。为此，我们应用双基因真核表达载体将sv-Cystatin和BJ46a同时导入人的高转移肝癌细胞株MHCC97H，通过体外和动物在体实验研究各自的抗肝癌侵袭转移作用、协同作用和存在的新功能，探讨两种基因的表达对肝癌细胞影响的可能分子机制，并利用重组sv-Cystatin与BJ46a腺病毒观察体内应用的初步治疗效果。 一、表达sv-Cystatin或/和BJ46a基因的MHCC97H细胞株的建立 利用分子克隆技术构建了重组表真核达载体pBudCE4.1/sv-Cystatin、pBudCE4.1/BJ46a和pBudCE4.1/sv-Cystatin+Bj46a；经Westem Blot证实建立的细胞株MHCC97H/sv-Cystatin、MHCC97H/BJ46a和MHCC97H/sv-Cystatin+Bj46a可以分别稳定表达sv-Cystatin、BJ46a和同时表达sv-Cystatin和BJ46a，为后续研究提供了实验材料。 二、sv-Cystatin或/和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移功能的影响 体外细胞活力和裸鼠皮下肝癌细胞原位瘤重分析表明，表达sv-Cystatin能显著地抑制MHCC97H细胞的体外、体内增殖能力，但sv-Cystatin和BJ46a共同表达时没有协同作用。细胞培养中发现表达sv-Cystatin可以使MHCC97H细胞具有聚集成团倾向，细胞间连接更为紧密，并具有抑制MHCC97H细胞体外趋化的作用。利用Transwell--Matrigel实验和裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型证实表达sv-Cystatin和BJ46a具有各自抑制MHCC97H细胞体外、体内侵袭转移的作用，共表达时具有协同作用。 三、sv-Cystatin或／和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移影响的分子机制 流式细胞检测、电镜观察和TUNEL实验证实诱导凋亡是表达sv-Cystatin的MHCC97H细胞生长增殖能力降低的原因，其可能的机制为sv-Cystatin的表达下调Twist表达，降低Twist所介导的抑制P53分子通路的保护细胞作用，直接导致促凋亡作用的P53表达升高及其靶分子Bax的上调，启动凋亡线粒体通路级联反应。BJ46a不具有此功能，故sv-Cystatin和BJ46a共表达时没有体现诱导凋亡的协同作用。 细胞培养上清通过荧光分光光度检测Cathepsin B、明胶酶谱分析MMPs，培养细胞通过凝胶迁移分析转录因子Twist活性及其相关的E-cadherin和N-cadherin表达等证明：(1) MMP2和MMP9的活性的下降是表达BJ46a的MHCC97H细胞侵袭能力减弱的直接原因；(2) CathepsinB、MMP2和MMP9活性的同时下降，Twist活性减弱导致的E-cadherin表达上调和N-cadherin表达下调共同促成了表达sv-Cystatin的MHCC97H细胞侵袭能力的抑制；(3)以上二者因素的协同作用导致同时表达sv-Cystatin和BJ46a的MHCC97H细胞的侵袭能力最弱。 四、重组sv-Cystatin和BJ46a腺病毒治疗转移性肝癌的实验研究 利用腺病毒载体pShuttle-IRES-hrGFP-1构建了携带sv-Cystatin和BJ46a基因的重组腺病毒。通过裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型的瘤内注射治疗实验证实Ad/sv-Cystatin可以降低MHCC97H细胞的肺转移率30.4％，而联合注射Ad/sv-Cystatin和Ad/BJ46a可降低28％，未见协同作用；瘤内注射Ad/sv-Cystatin在一定程度上具有抑制MHCC97H细胞生长的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 表达sv-Cystatin或／和BJ46a基因的MHCC97H细胞株的建立

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 sv-Cystatin或／和BJ46a的表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移功能的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 sv-Cystatin或／和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移影响的分子机制

材料与方法

结果

讨论

小结

第四部分 重组sv-Cystatin和BJ46a腺病毒治疗转移性肝癌的实验研究

材料与方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

综述 肝癌侵袭转移机制与治疗策略

附录

在学期间获得的科研成果和发表的论文

致谢