一种基于SRAP分子标记构建紫苏核心种质资源库的方法

摘要

一种基于SRAP分子标记构建紫苏核心种质资源库的方法，属于紫苏属种质资源的遗传多样性评价和核心种质的构建技术领域。所述方法包括如下步骤：筛选出100份紫苏品种材料，栽植在花盆中，取幼苗植株叶片为试验材料，提取每个品种的总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度及其完整性，用紫外分光光度计测定各品种总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度，于‑20℃保存备用；使用总DNA进行SRAP‑PCR扩增，扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。本发明利用SRAP标记技术对100份紫苏属种质资源构建指纹图谱，编制紫苏属分子检索表，进行核心种质构建，揭示紫苏属种和栽培品种之间的亲缘关系，建立科学的分类体系，并对其进行遗传多样性评价。

说明书

技术领域

本发明属于紫苏属种质资源的遗传多样性评价和核心种质的构建技术领域，具体涉及一种基于SRAP分子标记构建紫苏核心种质资源库的方法。

背景技术

紫苏(Perillafrutescens L.)又名回回苏、苏麻、红紫苏、赤苏、苏子等，属于唇形科紫苏属一年生草本植物，是中国传统的药食兼用型植物，其茎、叶和种子均可入药，幼苗及嫩叶香味独特，是东亚各国较为喜爱的蔬菜及调味品。近年来研究发现，紫苏种子油中α－亚麻酸(人体必需脂肪酸)含量高达65％，具有促进大脑发育和治疗心脑血管疾病等多种保健功效，对其研究和开发已受到国内外的广泛关注。

我国是紫苏属植物的起源地和分布中心。由于紫苏属植物变异类型多，变异幅度大，种间杂交容易，种质资源难于鉴定，许多品种的分类仍然存在争议。目前对于紫苏属遗传多样性的研究，大都以少数典型材料为研究对象，偏重于起源、亲缘关系或分类方面的研究，很少开展全面系统的遗传多样性分析，尚不能全面了解我国现有紫苏属种质资源的遗传背景以及遗传多样性的分布规律及特点。在优异种质的挖掘和利用方面，虽然通过对部分种质的表型鉴定获得了一些优异种质，但面对如此大量的种质资源，缺乏一种可以高效、准确筛选具有不同特性的优异种质的策略和方法，因而也加大了种质资源评价和利用难度。

此外，由于市场经济的影响，民间对紫苏种质资源的保护和利用不当，许多优良种质正在逐步退化、萎缩乃至消亡。为了更好地开发和利用紫苏属药食两用植物资源，一方面需要通过表型鉴定不断挖掘优异种质，另一方面也需要利用分子标记技术，探索紫苏属种和品种间的亲缘关系，明晰品种的种源，建立科学的分类体系，为进一步的育种和种质资源保护奠定基础。

SRAP(Sequence-related amplifiedpolymorphism)标记技术是基于PCR的新型分子标记系统，其原理是通过独特的引物对开放式阅读框(Open reading frames，ORFs)进行扩增。SRAP分子标记由于直接反映了不同种或品种在DNA水平上的差异，故可通过分析亲本与子代之间的共有条带来鉴定、评估品种纯度或者快速鉴别品种。SRAP技术与现有的AFLP、ISSR、RAPD等分子标记技术相比，可操作性和稳定性强，重复性和共显性好，成本低，分析自动化程度高。该技术已在水稻、棉花、番茄、马铃薯、柑橘、大蒜、黄瓜、芹菜、油菜、拟南芥、小麦、烟草等植物研究中成功应用。这在种质资源保存、种质资源创新和杂交育种等方面都有重要意义。

依靠分子标记方法获得的基因型信息处理后获得的核心种质，具有不受外界环境及基因间相互影响的特点，能准确、高效的构建何种种质。根据核心种质学说，即用科学的方法，从某物种整个种质资源中选择一部分，以最少的种质资源数量最大程度地涵盖该物种的整体遗传特性，以减轻因种质资源库增大而导致的冗余负担，使种质资源的评价与性状研究更具重点。故此，构建核心种质成为紫苏种质资源管理和保存的必然方向，对紫苏种质资源的综合利用、评价和保护也具有重要的意义。SRAP以最少的种质资源数量最大程度地涵盖该物种的整体遗传特性的优势，在众多分子标记技术中优势明显，更适宜紫苏核心种质库的构建。

贵州省农科院油料研究所魏忠芬对贵州省紫苏种质资源表型多样性进行了研究，黑龙江省科学院大庆分院魏国江对现有紫苏种质资源进行质量性状和数量性状的分类及聚类分析。在紫苏表型性状分析基础上，利用SRAP分子标记这种高效、准确筛选具有不同特性的优异种质的方法，对紫苏属植物种质资源进行分子水平评价。

SRAP分子标记直接反映了不同种或品种在DNA水平上的差异，可通过分析供试种质资源之间的条带来鉴定、评估品种纯度或者快速鉴别品种，这在种质资源保存和杂交育种等方面都有重要意义。因此，将该技术应用于紫苏资源的保存、鉴定和种质资源的创新上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明利用SRAP分子标记技术对100份紫苏属种质资源进行遗传多样性评价和核心种质的构建，实现以最少数量的遗传资源最大限度地保存紫苏整个资源群体的遗传多样性，为紫苏种质资源的保存、种质资源的创新研究和遗传育种提供强有力的技术支撑和理论依据。

为实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种基于SRAP分子标记构建紫苏核心种质资源库的方法，包括如下步骤：

步骤一：通过8年大田试验，筛选出100份紫苏品种材料，栽植在花盆中，取幼苗植株叶片为试验材料，提取每个品种的总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度及其完整性，用紫外分光光度计测定各品种总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度，于-20℃保存备用；

步骤二：使用总DNA进行SRAP-PCR扩增，扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

本发明相对于现有技术的有益效果为：本发明利用SRAP标记技术对100份紫苏属种质资源构建指纹图谱，编制紫苏属分子检索表，进行核心种质构建，揭示紫苏属种和栽培品种之间的亲缘关系，建立科学的分类体系，并对其进行遗传多样性评价。一方面为紫苏属的起源、演化和分类研究提供可能的新的理论依据，另一方面，为紫苏种质资源保存、鉴定、创新、利用及遗传育种提供理论依据。

附图说明

图1为遗传距离构建的UPGMA聚类树示意图；

图2为Nei遗传一致性构建的UPGMA聚类树示意图；

图3为PCoA图(2D)；

图4为PCoA图(3D)；

图5为K＝4的struture结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。

具体实施方式一：本实施方式记载的是一种基于SRAP分子标记构建紫苏核心种质资源库的方法，包括如下步骤：

步骤一：通过8年大田试验，筛选出100份紫苏品种材料，栽植在花盆中，取幼苗植株叶片为试验材料，提取每个品种的总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各品种总DNA纯度及其完整性，用紫外分光光度计测定各品种总DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度，于-20℃保存备用；特意提经过8年大田试验，是想证明这些种子在黑龙江可以种植，分类时按照农艺性状分类具有大田稳定性；

步骤二：使用总DNA进行SRAP-PCR扩增，扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种基于SRAP分子标记构建紫苏核心种质资源库的方法，步骤二中，所述SRAP-PCR扩增所使用的正向引物为me1～me9，反向引物为em1～em17。所使用的SRAP扩增引物均采用现有的，百度查询可得。

以下是本发明具体的引物设计、调试与扩增效率检测，基因检测使用引物与探针序列如下：

实验结果如下：

(1)单群体描述性统计，下表只显示单个群体的遗传参数。

表1紫苏种质遗传多样性参数表

其中，DA为大粒紫苏种子，GAO为高油种子，PX为品系种子，Y为引种，ZH为株行种子，ZX为株系种子；

na*＝Observed number ofalleles(观察等位基因数)

ne*＝Effective number ofalleles[Kimura and Crow(1964)](有效等位基因数)

h*＝Nei's(1973)gene diversity(Nei’s基因多样性指数)

I*＝Shannon's Information index[Lewontin(1972)](shannon信息指数)

Ht(居群总的遗传多样性Population genetic diversity)

Hs(居群内遗传多样性Genetic diversity withinpopulatio)

Nei's genetic identity(above diagonal)and genetic distance(belowdiagonal).

(2)多群体描述性统计，下表只显示总的群体的遗传参数

(3)分子方差AMOVA

组内差异越小说明取样的群体越纯合，组内差异越大，说明取样的群体越杂。组件差异越大，说明2个群体差异越大。

(4)聚类

图1为遗传距离构建的UPGMA聚类树示意图；图2为Nei遗传一致性构建的UPGMA聚类树示意图；遗传距离指不同的种群或种之间的基因差异的程度，并且以某种数值进行度量。通常由基因频率的某个函数所确定。常用遗传系统树加以表达。位于同一条染色体上两个基因座间发生交换和重组的机会，两个基因座距离越近，发生重组的机会愈低，反之，重组率愈大，最大值为0.5。单位为分摩(10％的重组率)或厘摩(1％的重组率)；基因一致性：群体中任意两个等位基因等同的概率。

(5)PCoA作图

PCoA(主坐标分析)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，PCoA可以找到距离矩阵中最主要的坐标，结果是数据矩阵的一个旋转，它没有改变样品点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。通过PCoA可以观察个体或群体间的差异。图3和图4两幅图为一组数据的2D和3D PCoA效果图，通过PCoA可以观察个体或群体间的差异。

(6)PIC

PIC(多态信息含量)指的是一个标记用于在群体检测多态性的价值。PIC取决于检测的等位基因的数目和它们的频率分布。

表2多态信息含量值表

(7)struture

可以直观了解个体间的分类关系—即可以将某个群体分为若干亚群、群体间是否存在基因交流以及每个个体混血程度是多少。Structure中群体的亚群数被称为K值。下图中列出了K＝4时的结果。图中每一种颜色代表一个类群，每个个体代表图中的一个小柱状堆叠图，那么我们可以看出有些个体血统较为纯正，有些则出现了混杂。通过颜色我们便可以对种群中的个体进行不同亚群的划分。